宜昌部分地区高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测

从宜昌部分地区猪散养户中随机抽取部分猪血样及疑似高致病性猪蓝耳病病例血样共计181份,进行高致病性猪蓝耳病RT-PCR的检测,结果显示23份为阳性。试验初步证明,随机抽取的181头猪中有部分猪感染高致病性猪蓝耳病病原。     

高致病性猪蓝耳病的实验室诊断

采用猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因RT-PCR检测方法和猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株试剂盒检测方法,对六盘水市钟山区某猪场发生的一起疑似高致病性猪蓝耳病进行实验室诊断,确诊为由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株引起的高致病性猪蓝耳病。     

高致病性猪蓝耳病的研究进展

2006年下半年开始，中国爆发了始称“高热病”的猪病疫情。其死亡率高并呈多发态势，再加上最初人们因无法确知其病原与流行病学，故而造成了一定程度的恐慌。为查清病因，农业部迅速组织专家进行攻关，对猪“高热病”病因进行了调查分析。经过中国动物疫病预防控中心田克恭研究员等科研人员的辛勤努力，2007年1月，最终确定为变异猪蓝耳病病毒是猪“高热病”主要病原，并定名为高致病性猪蓝耳病。随后，中国动物疫病预防控制中心用不到三个月的时间，完成了高致病性猪蓝耳病疫苗的研究和高致病性猪蓝耳病病毒的RT-PCR诊断试剂的开发工作。目前，该新型疫苗已经投入生产，并在高致病性猪蓝耳病防控工作中发挥着重要作用。针对此，我刊就猪业生产者及猪产品消费者关心的若干问题对中国动物疫病预防控制中心的田克恭研究员及多年从事猪蓝耳痛研究并在此领域卓有建树的广东省农业科学院兽医研究所的宋长绪士进行了采访，现将采访实录整理如下以飨读者![编者按]     

阿尔山市高致病性猪蓝耳病流行病学的调查报告

2007年10月中、下旬,兴安盟阿尔山林海街4户养猪户爆发高致病性猪蓝耳病,患猪大量死亡。经过自治区兽医站化验室RT-PCR检测,患猪血清为阳性。经过对当地养猪户的流行病学调查分析,得出这次爆发H-PRRS的主要原因是猪舍的卫生管理差和生猪的不当引入,但也不可忽视的是在注射疫苗前就已经发生该病。     

猪高致病性蓝耳病毒与猪圆环病毒混合感染的诊治

2016年6月四川九寨沟某藏香猪养殖基地母猪出现体温升高到41℃、食欲不振、泌乳量降低、返情率升高、个别食欲废绝,仔猪出现高稽留热、精神萎靡、消瘦、眼睑水肿、呼吸困难(呈腹式呼吸)、腹泻等临床症状。剖解发现全身淋巴结肿大,肺呈弥漫性间质性肺炎,表面凹凸不平,部分坏死。遂采集患病猪病料,以四川农业大学动物生物技术中心建立的病原RT-PCR和PCR方法进行检测,初步诊断为猪高致病性蓝耳病毒和猪圆环病毒混合感染。结合临床实际采取一定措施治疗后,病情得到有效控制。     

高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病二重RT—PCR检测方法的建立及应用

高致病性猪蓝耳病病毒（HP—PRRSV）（JX-EF112445）核苷酸序列与经典猪蓝耳病病毒（LP-PRRSV）（U87392）核苷酸序列,设计两对特异性引物,建立了HP—PRRSV和LP—PRRSV二重RT-PCR快速检测体系。应用此体系成功对1498份组织／血清进行了准确检测。同时,分别与商品化的HP-PRRSVRT-PCR检测试剂盒和LP—PRRSV检测试剂盒进行比对试验,结果吻合率达100％,该方法特异性好、敏感性高、克服了对两种病原进行分别检测所带来的耗时、耗试剂、增加污染几率等风险,为蓝耳病的快速诊断和流行病学调查奠定了基础。     

我国五省区部分猪场高致病性猪蓝耳病毒感染情况检测与分析

<正>对2008～2009年我国五省区发病猪场235份、屠宰场的218份样品进行了高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)RT-PCR检测,挑选具有代表性的HP-PRRSV阳性样品进行HP-PRRSVORF5基因扩增、测序及分析。结果表明,这五个省区发病场蓝耳病的检出率平均74.6%。屠宰场的检出率     

我国高致病性猪蓝耳病病毒的演化分析

自2006年以来,我国大面积暴发高致病性猪蓝耳病,但目前对其病原HP-PRRSV的起源还不得而知.本试验通过对多株HP-PRRSV进行全长基因组分析,发现HP-PRRSV中存在4处缺失,而且这4处缺失是逐步形成的,在中间过渡类型的毒株中存在着缺失1处、2处、3处的毒株.此外,中间过渡类型毒株中的一些氨基酸基序也是逐步变化的.本试验初步阐明了我国HP-PRRSV的起源是CH-1a-1ike PRRSV,在中间过渡的毒株中能够发现逐步演变的轨迹.     

河北屠宰场高致病性猪蓝耳病带毒情况调查

为了了解河北省屠宰场猪只高致病性猪蓝耳病的带毒情况,采用RT-PCR方法对2006～2009年采自全省11个地市228个县级屠宰场1565份商品猪的肺脏或肺门淋巴结进行高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)病原学检测,结果4年间猪场的阳性比率分别为55.56％、72.50％、44.62％和28.74％;4年样品阳性检出率分别为28.45％、40.74％、12.01％和7.31％.HP-PRRSV同伪狂犬病病毒(PRV)、圆环病毒2型(PCV-2)和猪瘟病毒(CSFV)混合感染所占的比率为61.66％,多以PCV-2和PRV的二重或三重混合感染为主.总之,HP-PRRSV在河北省猪群中污染面积较大,值得高度重视.     

荧光定量PCR在高致病性猪蓝耳病检测上的应用

应用实时荧光定量RT-PCR方法对上海松江区8个生猪重点养殖地区的60份样品（血液样品50份、组织病料10份）,以及10个规模化猪场的100份样品（血液样品81份、组织病料19份）进行高致病性猪蓝耳病的检测,结果均为阴性,表明该区猪群中没有高致病性猪蓝耳病的隐性感染和健康带毒。同时,熟悉并完善了高致病性猪蓝耳病的荧光定量RT-PCR检测技术。     

我国部分省区HP-PRRSV分离株ORF5基因遗传变异分析

参考GenBank发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV ) JXA1的ORF5基因序列,设计并合成了一对引物,对分离自云南、浙江、山东、辽宁、黑龙江、天津、湖南等7省12株PRRSV分离株进行RT-PCR扩增,获得约773 bp的DNA片段,将其分别克隆至pGEM-T Easy载体中,并进行测序.应用DNAStar软件分析序列,并与VR-2332、CH-la、MLV、LV、BJ4、HB1、HuB2、JXA1等毒株ORF5序列进行比较,结果表明,分离株间的核苷酸同源性为91.9%～100%,氨基酸同源性为90.1%～100%;在美洲株遗传关系上又分为明显的2个群:12株分离株与HB1、HuB2、JXA1、CH-la亲缘关系比较近,处于一个亚群;VR-2332、MLV、BJ4处于另一个亚群.说明高致病PRRSV为我国PRRS主要流行病毒.     

应用RT-PCR检测猪粪便中PRRSV

通过逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR），设计特异性引物检测猪粪便中猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因片段。结果发现，所检测的8份猪粪便样本中有6份扩增出了目的条带，判定为阳性。     

应用RT-PCR检测猪粪便中PRRSV

通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),设计特异性引物检测猪粪便中猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因片段.结果发现,所检测的8份猪粪便样本中有6份扩增出了目的条带,判定为阳性.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank上猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株的核苷酸序列与古典美洲株的核苷酸序列,设计一对高致病性PRRSV特异性引物,结合快速的RNA抽提试剂和一步法RT-PCR,建立高致病性PRRSV快速RT-PCR检测体系。通过测序和同类试剂盒检测效果比对,证实该体系检测结果准确,体系特异性和灵敏度试验结果显示,该体系对猪瘟病毒、普通PRRSV、禽流感病毒无扩增产物,至少能检测经10万倍稀释后的临床阳性样品。该方法可直接对可疑组织样品进行检测,操作简单、快速、价廉、受环境因素污染概率小,适合临床样品的检测。     

2007年-2010年江苏省高致病性PRRSV分离株遗传特征分析

为了了解江苏省高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,本研究在2007年-2010年从江苏不同地区采集病料,利用RT-PCR方法进行病毒检测.结果发现江苏地区所有毒株都属于美洲型毒株,且Nsp2基因都存在不连续的30个氨基酸的缺失,缺失氨基酸的位置为481位和533位～561位.病毒分离株PRRSV...     

贵州省高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及遗传变异分析

利用已建立的猪呼吸和繁殖障碍类病毒性疫病多重PCR检测方法对2017年以来贵州9个不同地区采集的150份病料进行检测,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测为阳性的病料采用细胞接毒培养技术、病毒的形态结构观察和间接免疫荧光试验等分离鉴定PRRSV,并对其ORF5和Nsp2基因的核苷酸和氨基酸序列进行差异性分析。结果表明:分别接种Marc-145细胞并连传5代,获得5株PRRSV,分别命名为GZ-Fq、GZ-Bj、GZ-Kl、GZ-Hz和GZ-Zy;病毒粒子在电镜下呈球形或卵圆形,直径约30~80nm;5株毒株与近年来国内各地流行的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)同源性较高,分别为96.2%~100%和97.1%~98.6%,其中,ORF5基因的第13位氨基酸均为精氨酸(R),第137位氨基酸均为丝氨酸(S),Nsp2基因的氨基酸均存在第481位和532-560位氨基酸2处不连续的缺失位点;其ORF5基因及Nsp2基因均与2008年之后流行的HP-PRRSV亲缘关系较近。研究表明,贵州省PRRSV发生了变异,与近年来国内各个地区的HP-PRRSV序列的变异位点一致,属于美洲型PRRSV的变异株。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

2006年6月份以来,我国多个省份暴发高致病性猪繁殖与呼吸综合征,给我国养猪业造成了巨大经济损失.为全面了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒在我国的流行情况以及遗传变异规律,本研究采用RT-PCR的方法,对从2006年8月至2007年10月期间,来自于19省(市)共474份样品进行高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸的检测,结果检出阳性样品294份.在各省不同时期样品中均有阳性样品检出.通过对阳性样品进行Nsp2基因和ORF5基因扩增,序列分析发现所有检测的猪繁殖与呼吸综合征病毒株高度同源,为同一毒株遗传变异而来,所有猪繁殖与呼吸综合征毒株与HB-1株遗传关系最近;且Nsp2均缺失30个氨基酸.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株ORF5基因在大肠杆菌中的表达

根据测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒广东株(PRRSV GD)的序列,设计一对引物。用保存的PRRSV GD 的ORF5 的克隆产物pMD ORF5 质粒作为模板,扩增ORF5基因。将该片段定向插入到原核表达载体pBAD/gⅢC中,转化大肠埃希菌。重组质粒经PCR和酶切鉴定后,用阿拉伯糖诱导表达。用Western blotting鉴定表达蛋白,证明ORF5基因得到表达。     

进境种猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测

采用ELISA方法对812头份进境种猪血清进行猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体检测,结果发现编号213的血清呈阳性反应,其余呈阴性反应。对213号血样进行实时荧光RT-PCR扩增和凝胶RT-PCR扩增,结果显示荧光RT-PCR扩增呈阳性,凝胶RT-PCR扩增获得374 bp大小特异性片段,与已知的美洲株片段大小相符。该研究建立的先采用ELISA法检测血样,对可疑或阳性样本提取总RNA后进行荧光RT-PCR和凝胶RT-PCR的检疫模式,为PRRSV的快速检测和鉴定提供了新的技术手段,可满足大批量进境种猪快速检疫的需要,同时,该模式的建立,也为其他疫病的检疫提供了借鉴。     

Molecular evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates from central China

To investigate the genetic diversity of prevailing porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in Henan Province of China, 61 ORF5 gene sequences, originating from Henan Province during 2003–2010, were subjected to amino acid variation and phylogenetic analysis. The analyzed PRRSV ORF5 sequences carried evidence of one unique recombination event. Phylogenetic analysis revealed that all Henan isolates belonged to type 2 genotype and were divided into two subgroups. The dominant isolates had shifted from subgroup 1 to subgroup 2 during 2003–2010. Amino acid variation analysis of the glycoprotein 5 revealed that Henan PRRSV strains tended to accumulate more substitutions within the N-terminus and hypervariable region. Selective pressure analysis revealed evidence that some ORF5 sites have likely evolved in response to immune pressure.