金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1/Smad信号通路及其转分化的影响

为探索金黄色葡萄球菌(S.aureus)对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)TGF-β1/Smad信号通路及其转分化的影响,用热灭活金黄色葡萄球菌(0、10~4、10~5、10~6、10~7和10~8 CFU·mL~(-1))刺激BMFB,24h后采用Real-time PCR方法检测TGF-β1、α-SMA和collagen-ⅠmRNA的转录量,Western blot方法检测α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3蛋白的表达量。使用TGF-β1受体特异性抑制剂SB-431542预处理细胞,再用10~5 CFU·mL~(-1)热灭活金黄色葡萄球菌刺激细胞,24h后采用Real-time PCR方法检测α-SMA和collagen-ⅠmRNA的转录量,Western blot方法检测α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3蛋白的表达量,免疫荧光法检测collagen-Ⅰ蛋白的表达量。结果显示,不同浓度热灭活金黄色葡萄球菌处理细胞的TGF-β1mRNA的转录量显著升高(P0.05或P0.01),其中以10~5CFU·mL~(-1)刺激组的TGF-β1mRNA的转录量最高。不同浓度灭活的金黄色葡萄球菌处理细胞的α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表达量均能显著升高(P0.05或P0.01),其中以10~5 CFU·mL~(-1)刺激组的α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表达量最高。抑制剂SB-431542能够极显著抑制α-SMA、collagen-Ⅰ及p-Smad2/3的表达量(P0.01)。结果提示,金黄色葡萄球菌能够通过TGF-β1/Smad信号通路诱导奶牛乳腺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞,本研究为揭示金黄色葡萄球菌性乳腺炎发生硬化的机制奠定基础。     

金黄色葡萄球菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞PDGF-BB及其受体PDGFRβ表达的影响

为研究不同浓度的金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)血小板源性细胞生长因子(PDGF-BB)及其受体PDGFRβ表达的影响,采用不同浓度的热灭活金黄色葡萄球菌(0、105、106和108 CFU/mL)作用于BMFB细胞,分别于不同的时间点(6、12、24和48h)采用RT-PCR法检测PDGF-BB及PDGFRβmRNA表达,Western-blot法检测PDGF-BB及PDGFRβ蛋白的表达。结果显示,金黄色葡萄球菌作用于BMFB后,PDGF-BB mRNA表达量的升高呈明显的时效关系和量效关系(P0.05);PDGF-BB蛋白表达升高呈明显的时效关系(P0.05)。PDGFRβmRNA的表达量较对照组升高,呈正量效关系和正时效关系,在12h达到峰值后下降,同时mRNA表达量呈负量效关系(P0.05);PDGFRβ蛋白表达量呈正时效关系(P0.05)。本研究证实了金黄色葡萄球菌可以上调BMFB PDGF-BB及PDGFRβmRNA和蛋白的表达。     

无乳链球菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞瘦素及其受体表达的影响

为研究无乳链球菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)瘦素(Leptin)及其长型受体(OB-Rb)表达的影响,本研究将不同浓度热灭活的无乳链球菌(0、10~5 cfu/mL、10~6 cfu/mL和10~8 cfu/mL)作用于BMFB,分别于不同作用时间采用荧光定量PCR(qPCR)方法检测Leptin及OB-Rb mRNA转录水平,western blot方法检测Leptin及OB-Rb蛋白的表达。各组总体变化规律结果显示,无乳链球菌作用BMFB后,除6 h、12 h 10~6 cfu/m L和10~8 cfu/mL作用浓度外,其余作用时间实验组Leptin mRNA的转录水平及蛋白表达量与对照组相比显著升高(p0.05);各作用时间实验组OB-Rb mRNA的转录水平及蛋白表达量与对照组相比极显著升高(p0.01)。上述研究结果表明,热灭活的无乳链球菌能够促进BMFB的Leptin及OB-Rb mRNA的转录水平和蛋白的表达,为奶牛乳腺纤维化的防治提供依据。     

金黄色葡萄球菌对奶牛乳腺成纤维细胞α-SMA及collagen-Ⅰ表达的影响

为研究金黄色葡萄球菌(S.aureus)对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)α-SMA及collagen-Ⅰ表达的影响,本研究分别用不同浓度的热灭活金黄色葡萄球菌(0,10~4,10~5,10~6,10~7和10~8 CFU/mL)刺激BMFB,24h后采用Real timePCR方法、Western blot方法及免疫荧光法检测α-SMA及collagen-ⅠmRNA和蛋白的表达量。结果显示,不同浓度灭活的金黄色葡萄球菌处理细胞的α-SMA及collagen-Ⅰ均能显著升高(P<0.05),其中以10~5 CFU/mL刺激组的α-SMA及collagen-Ⅰ的mRNA和蛋白的表达量最高。结果表明,金黄色葡萄球菌可以使奶牛乳腺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞,为揭示金黄色葡萄球菌性乳腺炎发生硬化的机理提供数据。     

NF-κB信号通路在金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺成纤维细胞转分化中的作用

用热灭活金黄色葡萄球菌(0,104,105,106,107和108 CFU/mL)刺激奶牛乳腺成纤维细胞,24h后采用Real time-PCR方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1mRNA的表达量,Western blot方法检测α-SMA、collagen-I及pNF-κB p65蛋白的表达量。使用NF-κB通路抑制剂PDTC预处理细胞,再用105 CFU/mL热灭活金黄色葡萄球菌刺激细胞,24h后采用Real time-PCR方法检测TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1 mRNA的表达量,Western blot方法检测α-SMA、collagen-I及p-NF-κB p65蛋白的表达量,免疫荧光法检测α-SMA及collagen-I蛋白的表达量。结果显示,不同浓度热灭活金黄色葡萄球菌处理细胞的TGF-β1mRNA的表达量显著升高(P<0.05),其中以105 CFU/mL刺激组的TGF-β1mRNA的表达量最高。随着热灭活金黄色葡萄球菌浓度的升高,p-NF-κB p65蛋白的表达量逐渐升高(P<0.01),TNF-α、IL-1β、IL-6mRNA的表达量也逐渐升高(P<0.01)。不同浓度灭活的金黄色葡萄球菌处理细胞的α-SMA及collagen-I蛋白的表达量均能显著升高(P<0.05),其中以105 CFU/mL刺激组的α-SMA及collagen-I蛋白的表达量最高。抑制剂PDTC能够显著抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和TGF-β1 mRNA的表达量(P<0.05),PDTC能够显著抑制α-SMA、collagen-I及p-NF-κB p65蛋白的表达量(P<0.05)。结果提示,NF-κB信号通路在金黄色葡萄球菌诱导奶牛乳腺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞过程中发挥重要作用,本研究为揭示金黄色葡萄球菌性乳腺炎发生硬化的机制奠定基础。     

荣昌猪BMP15基因通过TGF-β RⅡ激活SMAD4信号分子机制研究

本研究旨在阐明荣昌猪BMP15基因在荣昌猪性成熟前不同发育期的表达特性及其与SMADs信号相关基因的表达关系。采集1月龄、3月龄及5月龄荣昌猪卵巢组织,利用qRT-PCR及石蜡切片免疫荧光染色法分析荣昌猪不同月龄卵巢组织内BMP15基因表达及细胞定位特征;利用5月龄卵巢活组织添加重组人BMP15蛋白及TGF-β受体抑制剂(LY215799和LY2109761),应用qRT-PCR及Western blot方法分析BMP15及SMADs信号通路相关基因SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD7、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ表达特征及BMP15/SMADs信号通路。结果表明:从1月龄至5月龄,随着荣昌猪生长发育,卵巢组织内BMP15基因mRNA表达量呈上调表达(P0.05);石蜡切片免疫荧光试验表明,5月龄卵巢组织卵母细胞周围颗粒细胞内存在BMP15蛋白荧光信号;从3月龄至5月龄的卵巢组织内BMP15、SMAD4、TGF-β1及TGF-βRⅡ基因在mRNA水平呈上调表达(P0.05),而SMAD2、TGF-β2及TGF-βRⅠ呈下调表达(P0.05);通过5月龄卵巢活组织添加重组人BMP15蛋白、TGF-βRⅠ/Ⅱ及TGF-βRⅠ受体抑制剂培养,发现TGF-βRⅠ/Ⅱ抑制剂(LY2109761)明显抑制TGF-βRⅡ受体蛋白的表达,TGF-βRⅠ抑制剂(LY2157299)不能抑制TGF-βRⅡ受体蛋白的表达。上述结果表明,荣昌猪BMP15基因在荣昌猪性成熟前的卵巢组织内呈上调表达,SMAD4、TGF-β1及TGF-β RⅡ也呈上调表达。本试验研究表明BMP15基因通过TGF-βRⅡ介导SMAD4信号分子调控下游基因的表达,为进一步研究荣昌猪BMP15基因在卵泡发育中发挥的作用提供理论依据。     

奶牛乳腺炎源性大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞瘦素及其受体表达的影响

为了研究大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)对奶牛乳腺成纤维细胞(bovine mammary fibroblast,BMFB)中瘦素(leptin,LP)、长型瘦素受体(leptin receptor,OB-Rb)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ,COL Ia1)表达的影响,以探讨大肠杆菌感染引起奶牛乳腺纤维化的分子机制,试验用不同浓度(1×105cfu/m L、1×106cfu/m L、1×108cfu/m L)的热灭活E.coli作用于BMFB,并以无血清培养液作为对照组,同时利用qPCR及Western-blot检测LP、OB-Rb和COL Ia1 mRNA及其蛋白的表达水平并进行相关性分析。结果表明:E.coli作用BMFB后,1×108cfu/m L处理组LP、OB-Rb和COL Ia1mRNA的转录水平与对照组相比显著升高(P0. 05),1×108cfu/m L处理组LP、OB-Rb和COL Ia1蛋白表达水平在24,48小时时显著或极显著高于对照组(P0. 05或P0. 01)且与作用时间呈正相关。LP与OB-Rb mRNA相关性分析显示,两个因子在12小时时显著相关(P0. 05),其蛋白水平相关性分析显示,两个因子在48小时时极显著相关(P0. 01); LP与COL Ia1 mRNA在6小时时显著相关(P0. 05),其蛋白在24,48小时时极显著相关(P0. 01); OB-Rb与COL Ia1 mRNA在24,72小时时极显著相关(P0. 01),其蛋白在6小时时显著相关(P0. 05)。说明1×108cfu/m L热灭活的E. coli能够促进BMFB中LP、OB-Rb和COL Ia1 mRNA的转录和蛋白表达。     

酿酒酵母菌及其灭活菌对绵羊瘤胃外植体β-防御素-1(SBD-1)表达的影响

旨在探索益生性酿酒酵母菌及其灭活菌对绵羊瘤胃外植体内β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)表达的影响。本研究建立了绵羊瘤胃外植体培养方法,将不同浓度(10~4、10~5、10~6、10~7、10~8、10~9 CFU·mL^-1)的酿酒酵母菌及其灭活菌与外植体共培养24 h后,通过qPCR和ELISA方法检测瘤胃外植体内SBD-1 mRNA和蛋白的表达变化,以分别确定活菌及其灭活菌诱导SBD-1表达最高的菌液浓度;然后用该浓度的活菌及其灭活菌对瘤胃外植体进行不同时间(2、4、8、12、16、20、24 h)的刺激,同样用qPCR和ELISA方法检测瘤胃外植体内SBD-1 mRNA及蛋白的表达变化,从而筛选出活菌及其灭活菌诱导SBD-1表达的最佳时间。结果表明,益生性酿酒酵母菌及其灭活菌均能显著促进绵羊瘤胃外植体SBD-1的表达(P<0.05)。当酿酒酵母菌浓度为10~7 CFU·mL^-1、灭活菌浓度为10~8 CFU·mL^-1分别诱导绵羊瘤胃外植体16 h时,SBD-1表达量分别达到最大,且二者与对照相比均呈极显著差异(P<0.01)。在最佳诱导条件下对比二者的诱导效果,酿酒酵母菌活菌高于其灭活菌。因此,益生性酿酒酵母菌及其灭活菌均能促进绵羊瘤胃外植体内SBD-1的表达,且活菌浓度为10~7 CFU·mL^-1、灭活菌浓度为10~8 CFU·mL^-1分别诱导16 h时,绵羊瘤胃外植体内的SBD-1的表达量分别达到最大,并且益生性酿酒酵母菌的诱导效果高于其灭活菌。     

转化生长因子βⅠ型受体基因在敖汉细毛羊不同组织及发情时期卵巢中的表达分析

试验旨在探究转化生长因子βⅠ型受体(transforming growth factor-beta receptorⅠ,TGF-βRⅠ)基因在敖汉细毛羊中的组织表达情况,以及在不同发情时期卵巢中表达量的变化规律,为探讨其与绵羊发情的关系奠定基础。以24只季节性发情的敖汉细毛羊为研究对象,分为乏情期、发情间期、发情前期和发情期4组,每组6只。首先利用实时荧光定量PCR检测其发情期甲状腺、下丘脑、垂体、卵巢、肾上腺、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、肌肉12个组织中TGF-βRⅠ基因的表达情况,其次对4个不同发情时期卵巢TGF-βRⅠ基因的表达量变化进行研究。结果显示,TGF-βRⅠ在各组织中均有表达,在卵巢和甲状腺中表达量最高,极显著高于其他组织(P0.01);在下丘脑、垂体、胰腺、肾上腺、脾脏和肺脏组织表达量较高,显著高于心脏、肝脏、肾脏和肌肉组织(P0.05)。卵巢中TGF-βRⅠ基因在发情前期表达量最高,极显著高于其他3个时期(P0.01),发情间期表达量最低,极显著低于其他3个时期(P0.01)。综上所述,卵巢组织中TGF-βRⅠ基因在发情前期时可能对排卵前卵泡的成熟起促进作用。     

荣昌猪BMP15基因通过TGF-β RⅡ激活SMAD4信号分子机制研究

本研究旨在阐明荣昌猪BMP15基因在荣昌猪性成熟前不同发育期的表达特性及其与SMADs信号相关基因的表达关系。采集1月龄、3月龄及5月龄荣昌猪卵巢组织,利用qRT-PCR及石蜡切片免疫荧光染色法分析荣昌猪不同月龄卵巢组织内BMP15基因表达及细胞定位特征;利用5月龄卵巢活组织添加重组人BMP15蛋白及TGF-β受体抑制剂（LY215799和LY2109761）,应用qRT-PCR及Western blot方法分析BMP15及SMADs信号通路相关基因SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD7、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β RⅠ和TGF-β RⅡ表达特征及BMP15/SMADs信号通路。结果表明：从1月龄至5月龄,随着荣昌猪生长发育,卵巢组织内BMP15基因mRNA表达量呈上调表达（P<0.05）;石蜡切片免疫荧光试验表明,5月龄卵巢组织卵母细胞周围颗粒细胞内存在BMP15蛋白荧光信号;从3月龄至5月龄的卵巢组织内BMP15、SMAD4、TGF-β1及TGF-β RⅡ基因在mRNA水平呈上调表达（P<0.05）,而SMAD2、TGF-β2及TGF-β RⅠ呈下调表达（P<0.05）;通过5月龄卵巢活组织添加重组人BMP15蛋白、TGF-β RⅠ/Ⅱ及TGF-β RⅠ受体抑制剂培养,发现TGF-β RⅠ/Ⅱ抑制剂（LY2109761）明显抑制TGF-β RⅡ受体蛋白的表达,TGF-β RⅠ抑制剂（LY2157299）不能抑制TGF-β RⅡ受体蛋白的表达。上述结果表明,荣昌猪BMP15基因在荣昌猪性成熟前的卵巢组织内呈上调表达,SMAD4、TGF-β1及TGF-β RⅡ也呈上调表达。本试验研究表明BMP15基因通过TGF-β RⅡ介导SMAD4信号分子调控下游基因的表达,为进一步研究荣昌猪BMP15基因在卵泡发育中发挥的作用提供理论依据。     

病原体相关分子模式(PAMP)诱导对奶牛乳腺成纤维细胞TLR4、NOD2、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA表达的影响

通过观察病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)诱导对奶牛乳腺成纤维细胞(bovine mammary fibroblast,BMFB)TLR4、NOD2、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA表达的影响,揭示BMFB的免疫应答功能。本试验以BMFB为研究对象,分别用100 mg/L lipid A和10 mg/L胞壁酰二肽(MDP)诱导24 h,采用半定量RT-PCR检测细胞中TLR4、NOD2、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA表达的情况。结果显示,BMFB可表达TLR4、NOD2、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA;与对照组相比,lipid A组TLR4、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的表达水平显著上调(P0.05);胞壁酰二肽(MDP)组NOD2、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的表达水平显著上调(P0.05)。结果表明,BMFB可能通过表达TLR4和NOD2识别PAMP,进而上调炎症细胞因子的表达。     

去乙酰化蛋白酶1在马兜铃酸肾纤维化模型中对TGF-β1/Smad7信号通路的作用

检测马兜铃酸肾纤维化(AAN)模型肾组织中转化生长因子-p1 (TGF-β1)、Smad7、去乙酰化蛋白酶1(HDAC1)的mRNA和蛋白表达变化,探讨HADC1和Smad7的表达在AAN发展中的作用及两者间的联系.RTPCR检测TGF-β1、Smad7和HDAC1的mRNA表达,ELASA检测TGF-β1的蛋白表达,免疫组化定位和检测HADC1和Smad7蛋白,HE染色观察肾病理学改变.结果显示:AAN模型肾组织中TGF-p1和HDAC1mRNA表达呈时间依赖性升高,TGF-p1 mRNA表达较对照组有明显差异(P＜0.05),28 d开始AAN组中HDAC1mRNA增加,差异极显著(P＜0.01) ;Smad7 mRNA和蛋白表达均呈下降趋势,HDAC1蛋白免疫组化染色强度呈上调趋势,与对照组比较HDAC1阳性着色主要分布于上皮细胞和间质细胞的细胞核;肾脏病理表现为肾小管浊肿、变性和脱落等急性小管间质损伤,并随用药时间的延长呈进行性加重.本研究表明肾组织中Smad7弱表达可促进TGF-β1信号转导,HDAC1 mRNA和蛋白在肾组织中的高表达并参与TGF-β1/Smad7信号通路在肾纤维化发展中起重要作用,可能是潜在的新作用靶点.     

重组UBC13对RAW264.7炎症因子mRNA表达的影响

为了研究重组蛋白UBC13对RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症因子mRNA表达量的影响,采用噻唑蓝(MTT)法检测UBC13对RAW264.7细胞活力的影响,qPCR法检测不同浓度UBC13(20、10、5μg/mL)在不同时间点(3、6、9、12、24h)对RAW264.7细胞产生的IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2 4种炎症因子mRNA表达量的影响。结果表明,在整个试验时间范围内IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2mRNA表达量呈现逐步降低的趋势;与细胞对照组组相比,在24h时IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2mRNA表达量显著降低(P0.05)。说明重组蛋白UBC13作用于RAW264.7细胞24h时能够明显抑制RAW264.7细胞中IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2的mRNA表达,并且具有药物剂量依赖性。     

犬氧化损伤性白内障晶状体结构和TGF-β_1 mRNA表达的变化

为了明确犬氧化损伤性白内障发展过程中晶状体结构的变化与转化生长因子β_1(TGF-β_1)mRNA表达的关系。本试验选取重庆本地杂交犬通过芬顿溶液进行晶状体囊袋内注射法建立犬氧化损伤性白内障模型,使用裂隙灯观察成模效果,借助光镜观察晶状体病理组织学变化,最后使用荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)检测白内障发展过程中晶状体组织TGF-β_1基因的相对表达量。结果显示,随着犬氧化损伤性白内障发展,晶状体前囊膜下和赤道部晶状体上皮细胞(LECs)从Ⅰ期起大小、数量、形态、细胞核染色以及结构排列异常,发展到Ⅲ、Ⅴ期时LECs与前囊膜连接变的疏松;当犬白内障Ⅲ期向Ⅴ期发展时后囊膜与皮质区连接疏松,在Ⅴ期时前、后囊膜均破裂;在白内障Ⅴ期时位于赤道部周围皮质区的晶状体纤维连接疏松,出现断裂崩解,走向改变的现象。与空白对照组相比犬白内障Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的TGF-β_1mRNA的表达水平均上调,差异极显著(P0.01),且Ⅱ期和Ⅲ期表达水平显著高于其他白内障发展的3个时期(P0.05),其中Ⅲ期最高,Ⅱ期其次。结果表明,犬氧化损伤性白内障发展过程中TGF-β_1mRNA呈高表达是晶状体上皮细胞(LECs)异常变化、囊膜的完整性遭到破坏而发生炎性反应,LECs的异常变化和TGF-β_1的高表达可能导致犬晶体纤维结构的病理变化。     

TGFβRⅠ、TGFβRⅡ、FSH和TGFβ1对猪颗粒细胞增殖凋亡的影响

为研究TGF-β通路对猪颗粒细胞增殖、凋亡的影响，本研究对TGF-β通路基因进行调控处理，设计并筛选可高效干扰TGFβRⅠ及TGFβRⅡ表达的载体，转染不同干扰载体及添加10 ng/m L TGFβ1和25 ng/m L FSH，采用Westernblot、MTT和流式细胞法检测不同处理对颗粒细胞TGFβ RI和TGFβ RII蛋白表达量和细胞增殖凋亡的影响。结果表明：成功筛选出干扰效率最高的p OSP1-TGFβRⅠ-sh5和p OSP1-TGFβRⅡ-sh3载体，对TGFβRⅠ和TGFβRⅡ的抑制率分别为78.00%和84.10%；转染后TGFβRⅠ干扰组的TGFβRⅠ蛋白表达量显著低于其阴性对照组；TGFβRⅡ干扰组、TGFβ1组和FSH组的TGFβRⅡ蛋白表达量显著低于其阴性对照组；TGFβ RI干扰组、TGFβ RII干扰组的增殖抑制率极显著高于PLL3.7空载体组，TGFβ 1组细胞增殖抑制率极显著高于空白对照组且FSH组的增殖抑制率显著高于空白对照组；TGFβRⅠ干扰组和TGFβRⅡ干扰组细胞凋亡率极显著高于PLL3.7空载体组；TGFβ1组和FSH组细胞凋亡率极显著高于...     

金黄葡萄球菌对奶牛乳腺上皮细胞E钙黏蛋白表达的影响

为研究金黄葡萄球菌(S.aureus)对奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)E-cadherin表达的影响,分别采用金黄葡萄球菌及热灭活的金黄葡萄球菌菌液作用于BMEC。金黄葡萄球菌以MOI 100∶1分别感染细胞0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0h,热灭活的金黄葡萄球菌菌液以不同浓度(0,104,105,106,107,108 CFU/mL)刺激细胞,之后利用实时荧光定量PCR方法和Western blot方法检测E-cadherin mRNA及其蛋白的相对表达量。结果显示:金黄葡萄球菌在感染细胞2h之后,E-cadherin mRNA及其蛋白的表达量较未感染组显著降低(P0.05);不同浓度的热灭活的金黄葡萄球菌菌液处理细胞的E-cadherin mRNA及其蛋白的表达量较对照组显著降低(P0.05)。本研究表明,金黄葡萄球菌及热灭活的金黄葡萄球菌菌液均能够降低奶牛乳腺上皮细胞E-cadherin mRNA及其蛋白的表达。     

干扰和过表达BAMBI基因对猪卵泡颗粒细胞表型和功能的影响

为研究转化生长因子-β（TGF-β）信号通路中的骨形态发生蛋白和激活素膜结合抑制剂（bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor,BAMBI）基因对猪卵泡颗粒细胞的调控作用,本研究设计构建BAMBI干扰和过表达载体,并将构建好的干扰（pSIREN-BAMBI-sh1、pSIREN-BAMBI-sh2、pSIREN-BAMBI-sh3）和过表达（pcDNA3.1-BAMBI）重组质粒转染猪卵泡颗粒细胞,通过实时荧光定量PCR技术进行有效片段的筛选,并对TGF-β信号通路下游基因（TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5）和细胞凋亡基因（Bax、Bcl-2）mRNA的表达水平进行检测。最后,用MTT法和流式细胞术检测BAMBI干扰和过表达对卵泡颗粒细胞增殖及凋亡的影响。结果表明,BAMBI干扰和过表达载体成功构建,pSIREN-BAMBI-sh2抑制BAMBI表达的效果最好,干扰效率最高。干扰BAMBI时,TGF-βRⅡ表达量显著上升（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著上升（P<0.05）;过表达BAMBI时,TGF-βRⅡ表达显著下降（P<0.05）,使得SMAD2、SMAD3的表达量显著下降（P<0.05）;上调BAMBI可显著抑制猪卵泡颗粒细胞增殖,极显著促进猪卵泡颗粒细胞凋亡（P<0.01）。研究结果表明,BAMBI基因显著影响猪卵泡颗粒细胞的生长发育,可能通过调节TGF-β信号通路间接影响猪的繁殖性能。     

热应激对性成熟猪睾丸TGF-β3和Claudin-11蛋白表达的影响

旨在探讨猪舍温度37~40℃热应激条件下,转化生长因子β3(TGF-β3)和Claudin-11在猪睾丸的表达与定位。6头性成熟长白公猪分成2组,3头为热应激组,置于温度控制在37~40℃的猪舍环境,每天3h,连续7d,每天于热处理结束后将猪赶回20~27℃正常猪舍环境中;另3头为对照组,饲养于20~27℃正常猪舍环境中。7d后取睾丸组织,采用qRT-PCR、Western blotting及免疫组织化学对猪睾丸TGF-β3和Claudin-11的表达进行研究。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,TGF-β3在热应激组的mRNA相对表达量显著升高(P0.01),Claudin-11的mRNA相对表达量较对照组降低(P0.05)。Western blotting结果显示,热应激处理组TGF-β3的蛋白表达较对照组升高(P0.05),Claudin-11的蛋白表达较对照组下降(P0.05)。免疫组织化学结果显示,热应激组TGF-β3免疫反应强阳性物定位于各级生精细胞和支持细胞,免疫阳性着色深度和范围高于对照组,提示热应激导致TGF-β3的表达增高;热应激组Claudin-11表达与对照组相比明显下降,对照组Claudin-11在血睾屏障位置呈明显的带状表达,而热应激组Claudin-11的表达局限在支持细胞周围,失去明显的血睾屏障带状表达。热应激影响猪睾丸TGF-β3和Claudin-11的表达与定位,提示热应激可能通过调节TGF-β3和Claudin-11的表达来影响精子发生。     

前列腺素F_(2α)受体激动剂fluprostenol对奶牛输卵管上皮细胞合成分泌细胞因子表达的影响

为验证前列腺素类化合物对输卵管分泌细胞因子有调控作用,以前列腺素F2α受体激动剂fluprostenol对奶牛输卵管上皮细胞合成分泌细胞因子TGF-α、TGF-β3、FGF-2、LIF和GM-CSF的调控机制为研究对象,采用实时荧光定量PCR技术检测吲哚美辛(10-5 mol/L)作用不同时间(2,4,8,16,24,48h)对奶牛输卵管上皮细胞TGF-α、TGF-β3、FGF-2、LIF和GM-CSF mRNA表达的影响。结果显示,fluprostenol对奶牛输卵管上皮细胞中TGF-α和FGF-2mRNA有正调控的作用,均在4h时mRNA的表达量达到峰值;fluprostenol对奶牛输卵管上皮细胞中LIF和GMCSF mRNA有双重调控作用,均是先短暂显著促进(P<0.05)其mRNA的表达,之后表现为极显著抑制(P<0.01),并均在2h时达到表达量峰值;fluprostenol对奶牛输卵管上皮细胞中TGF-β3mRNA起到正调控作用,作用48h时与空白对照组相比极显著升高(P<0.01),达到峰值。     

乳酸杆菌诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1的表达

为了解不同乳酸杆菌的刺激对绵羊瘤胃上皮细胞中绵羊β-防御素-1(sheep beta-defensin-1,SBD-1)的可能调节作用,本研究选用了2株具有益生作用的乳酸杆菌,即干酪乳杆菌Zhang(L.casei Zhang)和植物乳杆菌P-8(L.plantarum P-8),首先,运用实时荧光定量PCR技术(RT-q PCR)检测与乳酸杆菌共培养后的绵羊瘤胃上皮细胞中SBD-1mRNA的相对表达量;其次,探讨了2株乳酸杆菌诱导SBD-1 mRNA表达的差异性,选取优势菌株;最后,运用RTq PCR技术和酶联免疫吸附测定(ELISA)的方法,检测优势菌株活菌、灭活菌及其培养上清液对SBD-1基因及蛋白水平表达的影响。结果表明:2株乳酸杆菌均能促进SBD-1 mRNA的相对表达量,乳酸杆菌的浓度为107CFU/m L、刺激细胞8 h时能极显著促进SBD-1 mRNA的相对表达量(P0.01),而L.plantarum P-8强于L.casei Zhang;进一步的研究表明L.plantarum P-8的灭活菌亦可显著诱导SBD-1的基因及蛋白表达(P0.05),但弱于活菌。本研究结果表明L.plantarum P-8和L.casei Zhang均可诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1的差异性表达。