羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因的克隆与序列分析

本试验通过对羊传染性脓疱病毒内蒙分离株(OV/nm-05)进行总DNA提取,参考GeneBank中OrfVirus(Strain NZ2)株F1L基因序列设计一对引物,应用PCR技术特异性地扩增出该毒株的F1L基因的片段,并将其克隆到pGEM-Teasy载体后进行测序,得到该病毒F1L基因序列。应用计算机软件将测定序列与参考毒株OV/7、Strain NZ2、OV/C2、OV/mi-90、OV/Torino、OV/2的F1L基因序列进行比较。结果表明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株与Strain NZ2同原性最高,达99.1%,与OV/Torino最低,但也为96.3%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙分离株F1L基因与其他参考毒株之间差异不大。     

羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株B2L基因的克隆与序列分析

提取羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株(OV/nm-05)总DNA,参考GeneBank中OrfVirus(StrainNZ2)株B2L基因序列设计1对引物,应用PCR技术特异性地扩增出该毒株的B2L基因的片段,并将其克隆到pMD18-T载体后进行测序,得到该病毒B2L基因序列。应用计算机软件将测定序列与参考毒株OV-SAOO、StrainNZ2、OV-IA82、N86.20a、N94.10m、No03.8Rt的B2L基因序列进行比较。结果表明,羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株与StrainNZ2同源性最高,达97.9%,与N86.20a同源性最低,为84.2%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株B2L基因与其他参考毒株之间差异不大。     

羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株VIR基因的克隆与序列分析

根据GenBank中已经发表的羊传染性脓疱病毒毒株StrainNZ2的VIR基因序列,设计合成1对引物。采用PCR技术对内蒙古分离株（OV/nm-05）的VIR基因进行特异性扩增,然后将其克隆到pEASY-T1载体中进行测序,得到该病毒的VIR基因序列。序列分析表明,OV/nm-05株与1710/03株的同源性最高,达98.0%;与513/04株的同源性最低,为95.4%。说明羊传染性脓疱病毒内蒙古分离株VIR基因与其他参考毒株之间差异不大,这为进一步从分子生物学角度了解VIR基因的结构和功能奠定了基础。     

1株长春地区羊传染性脓疱病毒的分离鉴定及F1L基因的克隆与序列分析

利用MDBK细胞从长春郊区一养羊户送检的出现典型"口疮"症状的病羊唇部痂皮中分离获得1株病毒,通过电镜观察、理化学测定、PCR检测、动物回归试验、间接免疫荧光(IFA)及病理组织学观察等方法对该株病毒进行了系统鉴定,证实该分离株为羊传染性脓疱病毒(Orfvirus,ORFV),命名为ORFV-cc。参照GenBank中ORFVF1L基因的核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,成功地对ORFV-cc株F1L基因进行克隆、测序,并推导出其氨基酸序列。序列分析表明,获得的ORFV-cc分离株F1L基因片段长987bp,编码328个氨基酸,与ORFV-NZ2,ORFV-7,ORFV-20,ORFV-C2,ORFV-mi-90,ORFV-Torino株核苷酸序列同源性分别为97.5%,98.3%,97.9%,98.5%,98.4%,97.5%;氨基酸序列同源性分别为97.2%,97.2%,97.5%,98.8%,98.8%,97.9%。系统发育进化树结果表明,ORFV-cc分离株与参考毒株ORFV-C2和ORFV-mi-90的亲缘关系较近,表明不同地区分离毒株的F1L基因差异不大。     

羊口疮病毒B2L和VIR基因原核表达及抗原性鉴定

为检测羊口疮病毒(Orf virus)B2L和VIR蛋白的抗原性,通过PCR方法扩增出羊口疮病毒B2L和VIR基因,与原核表达载体pET-32a连接,将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态中,对其进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和测序验证。对鉴定为阳性的菌液进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。用灭活的羊口疮病毒免疫家兔,制备多克隆抗体,Western blot、ELISA鉴定B2L和VIR蛋白的抗原性。结果显示B2L、VIR蛋白均能与兔抗羊口疮病毒抗血清结合,证明B2L、VIR蛋白具有与羊口疮病毒共同的B细胞表位。     

接触传染性脓疱皮炎病毒B2L基因的克隆和序列分析

参照文献和 Gen Bank发表的接触传染性脓疱皮炎病毒 (CPDV ) NZ- 2株的 Bam H / B片段的基因序列 ,设计并合成 1对引物 ,通过 PCR扩增出国内 CPDV疫苗株和 3个分离株的 B2 L 基因 ,目的片段长约 1.13kb。将目的片段克隆到 p MD18- T载体后进行序列测定 ,并用 DNAStar软件比较分析国内的 CPDV株与 NZ- 2株的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果表明 ,国内疫苗株和 3株分离株的核苷酸序列同源性分别为 99.7%、96 .9%和 97.4 % ,与国外 NZ- 2株的同源性为 96 .1%。国内 CPDV株与 NZ- 2株的氨基酸序列同源性分别为 92 .0 %～ 96 .0 % ,表明CPDV Bam H / B2 L基因变异的幅度小。     

羊传染性脓疱病毒吉林株主要囊膜蛋白B2L基因的克隆与序列分析

参照Genbank自行设计2对引物,对羊传染性脓疱病毒JS04株病毒DNA进行两次扩增,扩增产物与pMD19-T连接后,热转化至E.coli Competent Cells DH5中,涂布平板,37℃过夜培养,挑选阳性菌落殖菌,提取质粒,对质粒上产物基因测序,序列大小1137bp,并导出其相关的氨基酸序列。序列分析表明,该毒株B2L基因与ORF-NZ2、Shanhjahnpur82/04等毒株的核苷酸序列同源性为97.8%～99.5%,氨基酸序列同源性为97.6%～99.5%。B2L基因的系统发育进化树结果表明,不同地区分离毒株的B2L基因差异不大。     

羊口疮病毒B2L和F1L截短融合基因原核表达产物的免疫原性分析

为分析羊口疮病毒(OrfV) B2L和F1L截短融合基因表达蛋白的反应原性,本研究分别选取B2L、F1L基因序列的主要抗原区域,采用重叠延伸PCR将二者融合后克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-B2L-F1L,通过PCR、双酶切和测序鉴定,结果显示获得1 080 bp的B2L-F1L融合基因目的片段,测序结果经比对分析正确无误,表明正确构建了重组表达质粒pET-32a-B2L-F1L。将pET-32a-B2L-F1L转化BL21 (DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果显示表达了39 ku的重组蛋白rB2L-F1L。采用Ni-IDA亲和层析方法纯化重组蛋白,经western blot鉴定,结果显示获得39 ku的单一特异性条带,表明rB2L-F1L的纯化效果和免疫原性均较好。采用rB2L-F1L纯化蛋白皮下多点注射免疫羔羊,采用ELISA方法检测免疫后不同时间羔羊血清中的OrfV抗体、IL-2、IFN-γ和IL-4细胞因子。结果显示,与生理盐水组相比,rB2L-F1L能够诱导羔羊产生OrfV特异性抗体,并可显著或极显著诱导羔羊分泌IL-2、IFN...     

羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立及CBP基因的序列分析

根据GenBank中的羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列,设计合成1对引物,通过对PCR条件的优化,敏感性、特异性试验,成功建立了ORFV的PCR检测方法。敏感性与特异性结果显示,最低核酸检测量为1.2 fg/μL,对口蹄疫病毒、山羊痘病毒、丝状支原体山羊亚种的扩增结果均为阴性。同时根据GenBank中的ORFV的CBP基因的序列,设计合成1对特异性引物,以ORFV贵州分离株作为模板,成功克隆出ORFV的CBP基因。同源性分析表明,核苷酸与GenBank中ORFV的CBP基因的核苷酸序列相似性99.4%～88.8%。本研究为ORFV感染的流行病学调查和CBP基因功能研究奠定基础。     

羊传染性脓疱诊断方法的建立

利用MDBK细胞从青海某养殖户发病羊唇部痂皮中分离获得一株病毒,通过临床症状、PCR检测以及组织病理学观察等方法对该株病毒进行了鉴定,证实分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf Virus,ORFV),命名为ORFV-QHMH01。参照GenBank中ORFV F1L基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物,对ORFV-QHMH01株F1L基因进行了克隆、测序,并推导出其氨基酸序列。序列分析表明,分离株F1L基因片段长987bp,编码328个氨基酸,与AF097215、AY040081、AY040082、AY040083、AY040084、AY040085、FJ808075、HM133903、HQ221964、JQ271535株的核苷酸序列同源性分别为:96.7%,95.6%,96.1%,96.2%,97.5%,97.2%,96.5%,48.6%,95.3%,98.3%。系统发育进化树结果表明,ORFV-QHMH01分离株与参考毒株JQ271535和AY040084的亲缘关系较近,这表明不同地区分离株的F1L基因具有较好的保守性。     

Isolation and Identification of Orf Virus from Jiangsu Province and Phylogenetic Analysis of Their B2L Gene

The study was aimed to investigate prevalence of Orf virus (ORFV) in Jiangsu province in recent years and control Orf better. A total of 121 tissue samples were collected in some farms from 2013 to 2015 and subjected to PCR detection, viral isolation and phylogenetic analysis of B2L gene. Four samples were ORFV positive by PCR. The viruses were isolated by passaging in ovine fetal turbinate (OFTu) cells and MDBK cells, and were named as ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China, ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China, ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China and ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China,respectively. The B2L gene was amplified and sequenced for the phylogenetic study. The nucleotide homology of these 4 strains was 98.5% to 100.0%. ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China, ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China and ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China, gathered into a cluster with SC-JY, GX-YB, JS-FX isolates and the nucleic acid homology of these strains was 97.8% to 100%. ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China gathered into a cluster with LiaoNing, HuB and Gansu isolates, the nucleic acid homology was 98.8% to 98.9%. The nucleic acid homologies of 4 strains and ORFV strain China vaccine was 96.8% to 98.1%. The result showed that the ORFVs in Jiangsu province might be from different source. For controlling the spreading of this virus, it was necessary to carry out deep epidemiological survey in Jiangsu province.     

羊口疮病毒陕西分离株B2L基因的克隆、序列分析及原核表达

为了对羊口疮病毒(ORFV)陕西分离株B2L基因进行克隆、序列分析及原核表达,根据GenBank已登录的ORFV(JN565694.1)B2L基因序列,设计合成一对特异性引物,应用PCR技术扩增ORFV B2L基因,并将目的基因连接到原核表达载体pET-28a中,成功构建重组质粒PET28a-B2L,转化大肠埃希菌BL21感受态细胞进行诱导表达,并进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,成功克隆了ORFV陕西分离株B2L全基因序列,核苷酸序列分析表明,陕西分离株B2L基因与国内外已报道的ORFV毒株核苷酸同源性超过97.3%,氨基酸同源性超过95.0%。重组菌经IPTG诱导后成功表达分子质量约为42ku的重组蛋白,该蛋白能与羊口疮阳性血清特异性结合,具有良好的反应原性。研究结果为ORFV的分子生物学特性研究提供资料,为进一步研制ORFV单克隆抗体及抗体检测ELISA试剂盒奠定了基础。     

江苏省羊口疮病毒的分离鉴定及B2L基因的遗传进化分析

为了解江苏省近年来羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）的流行情况,更好地控制江苏地区的羊口疮病,2013~2015年采集江苏部分地区羊口疮疑似病料121份,进行病毒分离鉴定及其B2L基因的遗传进化分析。结果显示,样品中ORFV PCR检测阳性4份,用胎羊鼻甲骨细胞（OFTu）和MDBK细胞进行病毒分离,分离到4株病毒。这4株病毒分别命名为ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China、ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China、ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China和ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China。扩增ORFV的B2L基因全长并绘制遗传进化树。B2L基因序列分析显示,4株分离株之间的核酸同源性为98.5%~100.0%。遗传进化树显示,ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China株、ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China株和ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China株与SC-JY、GX-YB、JS-FX株聚成一簇,核苷酸同源性为97.8%~100.0%。ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China与LiaoNing、HuB、Gansu株亲缘关系接近,核苷酸同源性为98.8%~98.9%。4株分离株与中国疫苗株的核苷酸同源性为96.8%~98.1%。结果表明,江苏地区的ORFV来源可能不同,有必要开展更为深入的流行病学调查,为防控江苏地区的羊口疮奠定基础。     

Isolation and Identification of Orf Virus in Chongqing Area,and Prokaryotic Expression of F1L Gene

The assay was aimed to isolate,culture and identify Orf virus (ORFV) in Chongqing area,and investigate the expression of the F1L gene sequence in E.coli,the virus in the scab samples collected from suspected ORFV infected lamb was isolated in MDBK cell.Moreover,the F1L gene was amplified by PCR and ligated into pET-32a for expression in E.coli.The recombinant plasmid pET-32a-F1L was constructed with the introduction of restriction enzymes NotⅠand EcoRⅠ.The isolated virus was ORFV.SDS-PAGE analysis and Western blotting showed that the target protein was highly expressed with 57.4 ku in lenght at 5 h in E.coli as inclusion bodies and had good reactivity.     

重庆地区羊口疮病毒的分离鉴定及F1L基因的原核表达

本试验旨在对重庆地区羊口疮病毒(ORFV)进行分离培养及鉴定,并研究其F1L基因序列在大肠杆菌中的表达情况.利用MDBK细胞对疑似ORFV感染的羔羊痂皮中的病毒进行分离培养;对F1L基因序列进行PCR扩增,引入限制性内切酶NotⅠ和EcoRⅠ,构建重组质粒pET-32a-F1L,转化至大肠杆菌BL21菌株后,对阳性菌株进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定.结果表明,所获得的毒株为ORFV,其F1L基因在大肠杆菌中的表达产物大小约为57.4 ku,主要以包涵体形式存在,5 h为最佳诱导表达时间,并具有良好的反应原性.     

青海省刚察县羊口疮病毒的分离与鉴定

利用MDBK细胞从青海省刚察县某藏羊养殖小区发病羊唇部痂皮中分离获得一株病毒,通过临床症状、PCR检测以及组织病理学观察等方法对该株病毒进行了鉴定,证实分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf Virus,ORFV),命名为ORFV-QHGC01。参照Gen Bank中ORFV F1L基因的核苷酸序列,设计合成一对特异性引物,对ORFV-QHGC01株F1L基因进行了克隆、测序,并推导出其氨基酸序列。序列分析表明,分离株F1L基因片段长987bp,编码328个氨基酸,与Genbank中AF097215、AY040081、AY040082、AY040083、AY040084、AY040085、FJ808075、HQ221964、JQ271535株的核苷酸序列同源性分别为:96.7%,95.6%,96.1%,96.2%,97.5%,97.2%,96.5%,95.3%,98.3%。系统发育进化树结果表明,ORFV-QHMH01分离株与参考毒株JQ271535的亲缘关系较近,这表明不同地区分离株的F1L基因具有较好的保守性。     

山羊口疮病毒四川分离株F1L基因分子特征分析及抗原表位预测

为明确山羊口疮病毒（ORFV）四川分离株F1L基因分子特征并预测抗原表位,本试验利用生物信息学软件分析四川分离株ORFV F1L基因,并预测其编码蛋白的二、三级结构和B细胞表位。将F1L基因克隆转化后测序,用Mega 7.0软件比对分析该基因与其他地区来源的ORFV F1L基因的变异情况,利用SOPMA服务器预测F1L蛋白的二级结构,以DNAStar软件预测其亲水性、表面可及性、柔韧性及抗原性,以ABCpred方案作为验证并输出B细胞表位,在SWISS-MODEL服务器预测三级结构后,进一步在建模区域再验证抗原表位,最终回归蛋白质序列比对。结果显示,四川分离株ORFV F1L基因大小为1 029 bp,编码342个氨基酸,基因及其编码蛋白较其他地区来源毒株有一定变异;F1L蛋白预测分析存在9个可能B细胞表位,综合三级结构预测,其122-137肽段为最优表位;所预测的四川分离株ORFV F1L蛋白优势抗原表位较其他地区具有一定特异性,较多地区在124、131、137位氨基酸出现不同。本研究结果为四川地区ORFV基因工程疫苗及特异性检测方法的研究提供了理论依据。     

羊口疮病毒B2L基因密码子偏好性分析

B2L蛋白是羊口疮病毒(ORFV)的主要囊膜蛋白,为重要保护性抗原之一,可刺激机体产生强烈的抗体反应。本研究对B2L基因运用Visual Gene Developer生物信息学软件,分析其在大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒表达系统中的密码子使用偏好性,从而选择一个最适表达系统,以增加B2L蛋白的表达量。分析表明,B2L基因在昆虫杆状病毒表达系统中会得到更好的表达,这为B2L基因表达系统的选择提供了参考。     

2012年河南省猪流行性腹泻病毒分离株S1基因遗传变异分析

We designed and synthesized two pairs of specific primers amplified S1 gene by RT-PCR method to investigate the variation in S1 genes of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in 2012 in Henan.S1 genes of 5 PEDV strains were cloned and sequenced, and their phylogenetic trees were analyzed from different swine breeding farms. Sequences analysis showed that S1 genes shared 98.3% to 99.5% nucleotide identities and 97.1% to 98.9% amino acids homologies among five PEDV isolates. Compared with domestic landing PEDV from 2011, the nucleotide homologies were 88.6% to 98.0% and amino acid homologies were 85.3% to 98.7%. Compared with CV777, the nucleotide homologies were 88.7% to 89.1% and amino acid homologies were 87.3% to 88.4%. Homology analysis showed that S1 genes of 5 isolates shared the same genetic mutation, there were the same insertions and deletions. Compared with domestic mutant strains landed from 2011, there was no tendency. However, compared with CV777, there were three nucleotide insertions from 163 to 166 bp, nine nucleotide insertions from 173 to 174 bp, three nucleotide insertions from 405 to 406 bp and three nucleotide deletions from 463 to 464 bp. These insertions and deletions of nucleotides led to its corresponding changes in encoding amino acids. Phylogenetic analysis showed that S1 genes of 5 PEDV strains belonged to the third group. However compared with part of PEDV first group domestic mutant strains landed in 2011, the nucleotide homologies were 88.6% to 89.3% and amino acid homologies were 85.3% to 86.9%. CV777 was the second group. The results showed that S1 genes of PEDV prevalent strain exist in first and third groups, but mainly prevailing third group strains, the pathogenic and antigenic differences of these strains should be further studied.