小琴丝竹和凤尾竹LEA3基因的克隆及分析

中国竹类植物资源丰富,栽培历史悠久,是集生态、经济和社会价值于一身的园林植物。本研究以小琴丝竹和凤尾竹为材料提取叶片总DNA,通过PCR扩增技术克隆得到2种竹类植物LEA3基因,其中小琴丝竹LEA3基因全长810 bp,编码区序列编码188个氨基酸,GC含量为67.9%;凤尾竹LEA3基因全长分别为810 bp和834 bp,编码区序列分别编码188个氨基酸和195个氨基酸,GC含量为67.72%和68.53%。通过DNAMAN等生物软件分析发现,小琴丝竹和凤尾竹LEA3基因与其他禾本科LEA3基因同源性均在77%以上,同源性较高,且编码蛋白均属于稳定的亲水蛋白;此外,小琴丝竹和凤尾竹LEA3基因均包含一个完整的开放阅读框,其编码的氨基酸均含有6个由11个氨基酸组成的保守基元序列,本研究不仅为分析其他竹类植物的脱水耐受性机制提供基础数据,同时也为竹类植物及其他农作物抗旱育种提供了科学依据。     

翠竹及菲白竹LEA3同源基因的克隆及序列分析

竹类植物在中国有着非常悠久的栽培历史,并被广泛应用于园林、造林、庭院以及食品等行业。本研究以翠竹和菲白竹为材料提取其叶片总DNA,采用PCR方法获得翠竹SpLEA3基因与菲白竹SfLEA3-1、SfLEA3-2基因;其中SpLEA3全长804 bp,编码195个氨基酸,GC含量为68.4%;SfLEA3-1全长803 bp,编码195个氨基酸,GC含量为68.2%;SfLEA3-2全长557 bp,编码144个氨基酸,GC含量为67.8%。通过ProtParamy等生物软件分析,SpLEA3、SfLEA3-1和SfLEA3-2与贵州悬竹LEA3基因同源性高达61%以上,且3个基因编码蛋白均属于亲水性蛋白。源自2个竹种LEA3基因均包含一个完整的开放阅读框,其编码的氨基酸含有4~6个由11个氨基酸组成的保守基元序列。本研究不仅为深入了解竹类植物抗旱的分子机理研究提供了基础数据,也为竹类植物的抗旱育种后续研究提供了科学依据。     

巴西橡胶树SNARE蛋白全长cDNA克隆及其序列特征分析

从巴西橡胶树Hevea brasiliensis差减cDNA文库中筛选到一个与SNARE蛋白同源性较高的基因片段,根据其序列信息设计特异引物, 采用cDNA末端快速扩增技术RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为1 070 bp的全长cDNA克隆R295。序列分析表明该基因包含600 bp的开放阅读框,5’-UTR为93 bp, 3’-UTR为377 bp,编码199个氨基酸。该基因编码的蛋白具有一个SNARE coiled-coil保守区、一个典型的VAMP基元及一个羧基端的CAAX基元。同源分析表明该蛋白属于一类特殊的longins蛋白。RT-PCR检测表明它在胶乳中特异表达,在叶中没有表达。     

青稞hblt4.2基因的克隆及功能分析

根­据大麦blt14.2基因序列设计引物, 用青稞的DNA为模板扩增低温反应基因的全长序列, 命名为hblt14.2, 在GenBank登录号为EF514912。该基因含470 bp, 包括249 bp的开放阅读框、69 bp的5''非翻译区和152 bp的3''非翻译区, 编码82个氨基酸残基, 富含Gly、Ala、Leu和Val氨基酸, 与其他冷诱导基因编码蛋白具相似性。与大麦blt14.2基因具98.9%同源性, 所编码的蛋白存在2个氨基酸的差别。将hblt14.2基因连接CaMV35S启动子和NOS终止子后定向插入质粒pCAMBIA1301的多克隆位点中, 构建植物表达载体pCAMBIA-BI-hblt, 通过农杆菌介导转化烟草, 并对转基因烟草进行抗寒性检测。结果表明, 青稞hblt14.2基因与植物的抗寒性有一定关系。     

青稞新基因HvMEL1 AGO的克隆和条纹病胁迫下的表达

为筛选与青稞条纹病相关的AGO类基因,本研究以青稞抗病品种昆仑14号和感病品种1141为材料,从感病和正常叶片的转录组测序结果中获得一个差异表达的AGO家族新基因,克隆验证了该基因为青稞HvMEL1 AGO。HvMEL1 AGO基因全长3462 bp,其中蛋白质编码区(CDS, coding domain sequence)在昆仑14号和1141品种中的一致性为100%,无内含子,全长3161 bp,包含一个3129 bp开放阅读框,编码1043个氨基酸,理论等电点为9.33,预测蛋白分子量为115,865.58Da。蛋白质序列分析表明,HvMEL1AGO为亲水性的不稳定酸性蛋白,具有高度保守的DUF1785、PAZ和PIWI结构域,属于AGO基因家族成员。进化树分析表明,HvMEL1AGO与大麦AGO家族中HvAGO12、HvAGO18、HvAGO1D、HvAGO1B在拟南芥AGO家族系统发育树上属于AGO1一类;与HvAGO12的亲缘关系最近。蛋白质互作预测结果表明,在水稻中与MEL1作用密切的已知蛋白为DCL类,分别为DCL1、DCL2A、DCL3A、DCL3B和DCL4。半定量...     

菊花CgF3’H基因克隆及表达特性分析

根据菊花花器官表达序列标签序列设计引物,采用PCR和5’-RACE技术对类黄酮3'-羟化酶(F3’H)基因进行全长cDNA克隆.克隆获得F3'H cDNA全长为1 760 bp,其开放阅读框(ORF)为1 524 bp,编码一条包含508个氨基酸残基的多肽,GenBank登录号为AB523844.预测该基因编码的蛋白分...     

青稞hblt14．2基因的克隆及功能分析

根据大麦blt14.2基因序列设计引物,用青稞基因组DNA为模板扩增低温反应基因的全长序列,命名为hblt14.2,在GenBank登录号为EF514912.该基因含470 bp,包括249 bp的开放阅读框、69 bp的5'非翻译区和152 bp的3'非翻译区,编码82个氨基酸残基,富含G1y、A1a、Leu和Va1,与其他冷诱导基因编码蛋白具相似性.与大麦bit14.2基因具98.9%同源性,所编码的蛋白存在2个氨基酸的差别.将hblt14.2基因连接CaMV35S启动子和NOS终止子后定向插入质粒pCAMBIA1301的多克隆位点中,构建植物表达载体pCAMBIA-BI-hblt,通过农杆菌介导转化烟草,并对转基冈烟草进行抗寒性检测.结果表明,青稞hblt14.2基因与植物的抗寒性有一定关系.     

青稞脂质转运蛋白基因blt4.9的克隆及其对非生物胁迫的响应

为了解脂质转运蛋白基因在青稞中的功能, 以青稞品种昆仑12为材料, 利用同源克隆得到青稞blt4.9基因序列(GenBank登录号为KU170187), 该基因的cDNA序列全长720 bp, 开放阅读框长348 bp, 编码115个氨基酸残基, 相对分子质量为11.2 kD, 理论等电点9.04, 不稳定系数为28.41, 是一个稳定的蛋白质。blt4.9编码的蛋白绝大多数属于疏水区, 没有较大的亲水区。序列比对显示, 该基因与大麦blt4.9基因编码蛋白的同源性最高(98.3%)。Real-time PCR分析结果显示, blt4.9基因在20%~30% PEG-6000、4℃以及50 mmol L^-1 ABA处理后表达量显著增加, 且在抗逆性强的青稞品种(旱地紫)中的表达量高于在抗逆性弱的品种(大麻)中, 推测该基因与青稞的抗逆性有关。该研究结果为利用青稞脂质转运蛋白基因改良青稞抗逆性奠定了基础。     

茶树生长素响应因子基因CsARF1的克隆与表达分析

生长素响应因子(ARFs)是能够与生长素原初反应基因启动子区的生长素响应基元(TGTCTC)特异结合的一类转录因子,调控生长素应答基因的表达。采用SMART-RACE-PCR技术,获得茶树生长素响应因子基因CsARF1的全长cDNA序列(GenBank登录号为JX307853),并进行了生物信息学分析和表达分析。CsARF1基因cDNA全长3222 bp,包含2463 bp的开放阅读框(ORF),编码820个氨基酸残基。编码蛋白的分子量为49.35 kD,具有保守的N端DNA结合域B3和C端二聚化结构域IAA_ARF,中间区域富含谷氨酸、丝氨酸和亮氨酸,是一个定位于细胞质的具有激活转录功能的可溶性蛋白。相似性及系统进化分析表明,该基因编码的氨基酸序列与葡萄ARF8的相似性最高(83%),与番茄ARF8的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR技术,检测该基因在茶树越冬芽休眠到萌发后不同时期的表达情况。结果显示CsARF1在茶树越冬芽深休眠和萌动期表达量较高,表明该基因与茶树越冬芽的休眠维持及解除密切相关。     

小麦胁迫相关基因TaLEAL3的克隆及分子特性分析

第3组LEA蛋白(late embryogenesis abundant protein)介导干旱、高温、高盐等非生物胁迫响应, 关于普通小麦LEA基因的研究鲜有报道。利用噬菌体原位杂交技术, 从小麦苗期干旱胁迫条件构建的cDNA文库中筛选出LEA蛋白基因TaLEAL3, 其全长750 bp, 编码区长501 bp, 编码166个氨基酸, 含有一个明显的核定位信号区。氨基酸同源性分析发现, TaLEAL3属于第3组LEA蛋白, 序列中含有由11个氨基酸组成的3个不完全重复的基序和α-螺旋的LEA结构。电子定位结果显示, TaLEAL3基因位于4BL、4DL和5AL染色体上, 主要在茎中表达, 而在根中几乎无表达。实时荧光定量PCR分析表明, 在干旱、低温和ABA诱导下, TaLEAL3基因表达量明显增加。在该基因上游1.7 kb序列处, 预测具有启动子的核心序列和增强子序列, 及与干旱和低温等多种逆境胁迫相关的调控序列。本研究为深入分析小麦LEA蛋白基因的功能, 初步解析LEA蛋白的作用机制提供了数据。     

不同耐旱性青稞叶片差异蛋白分析

为从蛋白质水平揭示不同青稞品种响应干旱胁迫的差异,分析抗旱蛋白质分子机制,本研究以干旱胁迫不敏感的旱地紫青稞(HDZ)和干旱胁迫敏感的大麻青稞(DM)为研究材料,以盆栽限量供水种植方法,对干旱处理不同梯度的青稞叶片进行叶绿素、可溶性蛋白、丙二醛含量及相对电导率4项生理指标的测定,同时利用iTRAQ技术对深度干旱胁迫青稞叶片全蛋白组进行差异蛋白分析。结果表明:随着干旱处理时间的延长,两种青稞的叶绿素和可溶性蛋白含量逐渐下降,电导率及丙二醛的含量逐渐升高,在相同处理条件下,大麻青稞的叶绿素和可溶性蛋白含量降低幅度、电导率及丙二醛含量的增高幅度明显高于旱地紫青稞;对两个青稞品种的干旱胁迫和正常培养的比较组进行iTRAQ分析,共定量出4163个蛋白(多肽),其中旱地紫青稞比较组中对比正常培养,筛选到表达上调的蛋白68个,下调的蛋白63个,在大麻青稞的比较组中筛选出表达上调蛋白21个,下调蛋白32个。KEGG通路分析表明,富集程度位于前3位的通路是代谢、氨基酸的生物合成以及次级代谢产物的生物合成,主要涉及到柠檬酸循环、碳循环等代谢通路,丙氨酸、精氨酸等氨基酸的合成降解以及花生四烯酸、亚麻酸等次级...     

青稞HvBADH1基因的克隆及其转化烟草的初步研究

应用RT-PCR结合RACE技术, 从青稞总RNA中扩增得长度为1 512 bp的甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对, 发现该序列的推定表达产物与大麦BADH同工酶BBD2的同源性为98.4%, 而与小麦、玉米和水稻等禾本科作物的BADH同源性分别为97.0%、84.7%和85.1%。将克隆到的青稞cDNA序列命名为HvBADH1, 投递到GenBank, 获得收录号EF492983。HvBADH1可以在原核表达系统TB1-pMAL c2x中正常表达出分子量为54.2 kD的多肽链。将HvBADH1的编码ORF, 插入到添加了植物表达CaMV 35S启动子和Nos polyA终止子调控元件的植物表达载体pCAMBIA1301质粒相应的克隆位点中, 构建了HvBADH1基因的农杆菌植物转化系统LBA4404(pCAM-ba)。进而采用农杆菌介导法, 将HvBADH1基因导入烟草中, 对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR、Southern blot和RT-PCR等分子生物学检测, 结果表明, 在得到的2个转基因株系中, HvBADH1基因已整合到受体植物基因组中, 并且可以在mRNA水平上进行转录。     

基于转录组测序数据的青稞WRKY基因家族的生物信息学分析

WRKY是植物中一类重要的转录因子,广泛调控了植物的生长发育和逆境胁迫应答。基于青稞白粉病侵染幼苗的转录组测序数据,本研究鉴定得到41个青稞WRKY转录因子,被划分为3个大组:Ⅰ组(6个)、Ⅱ组(21个)和Ⅲ组(12个)。另外,Hv WRKY40和Hv WRKY41没有分组。青稞WRKY基因进化分析的聚类结果和分组结果一致,进一步支持了我们分组的正确性。包括HvWRKY2、HvWRKY8、HvWRKY13、HvWRKY34和HvWRKY41,以及HvWRKY4、HvWRKY7、HvWRKY20、HvWRKY26和HvWRKY30在内的两组WRKY基因,表现出明显的先升高(36 h和72 h),后降低(168 h)的基因表达趋势。这些WRKY基因很可能参与了调控青稞抗白粉病的分子应答机制。青稞WRKY家族的蛋白相互作用网络中,Hv WRKY3、Hv WRKY8、Hv WRKY9属于网络中的主要中心节点。此外,Hv WRKY3、Hv WRKY8、Hv WRKY9、Hv WRKY30、HvWRKY34、Hv WRKY38、Hv WRKY39彼此之间相互作用,是蛋白互作网络的核心网络。本研究挖掘了青稞的WRKY家族成员,系统分析了家族成员的分组、家族成员的WRKY保守域特点、家族成员之间的进化关系、白粉菌侵染下的基因表达水平和家族成员的蛋白互作网络。本研究可为今后青稞的抗逆研究提供优良的候选WRKY基因。     

青稞Wx基因多态性与直链淀粉含量的关系

以150份青稞品种为材料, 采用碘–碘化钾染色法进行表型鉴定, 筛选出含糯性基因型的4份参试材料, 分别是品种IG107028、Puebla、互助双槽人和APM-HC1905。经双波长法测定, 150份参试材料的直链淀粉含量(AC)为12.4%~38.5%, 平均26.0%; 4份糯性参试材料的直链淀粉含量为12.4%~18.6%, 平均16.7%。以直链淀粉含量差别较大的51份材料为模板, 利用引物P4进行扩增, 结果P4引物在51份材料中均有扩增产物出现, 且随着参试材料直链淀粉含量的增大, 其扩增产物的分子量有逐渐增大的趋势, Wx基因位点表现出多态性, 二者呈正相关。根据带型将51份材料分成I型、II型、III型和IV型, 其扩增片段分子量分别为457、481、489和491 bp, 各类型品种的直链淀粉含量分别为12%~27%、29%~30%、31%~35%和36%~38%。P4可作为糯性青稞品种选育的辅助选择标记。     

烟夜蛾幼虫中肠类钙粘蛋白基因cDNA片段的克隆与序列分析

类钙粘蛋白位于昆虫中肠刷状缘膜囊泡上,该蛋白作为Bt毒素的受体可以与其结合导致昆虫死亡,因此,昆虫对Bt毒素的抗性与类钙粘蛋白有密切关系。本研究以烟夜蛾五龄幼虫中肠的总RNA为模板,根据已经克隆的其他昆虫的类钙粘蛋白基因序列设计引物,利用RT-PCR技术扩增出了烟夜蛾类钙粘蛋白基因的cDNA片段,将其连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌后筛选阳性克隆并进行序列测定,测序得到的1 335 bp的片断编码444个氨基酸残基。序列分析表明,该氨基酸序列与棉铃虫和烟芽夜蛾类钙粘蛋白的一致性分别为95%和86%。研究结果对进一步研究昆虫对Bt毒素产生抗性的机制以及发展分子技术快速检测并监测田间昆虫抗性基因的产生奠定了基础。     

小麦脂质转运蛋白cDNA结构及相应肽链构造特征的分析

根据测序获得的1条261 bp cDNA片段,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217(Pm2)的cDNA中扩增获得1条651 bp的cDNA片段,通过同源比对发现其包含小麦LTP1 完整的编码序列.该片段包含基因的5'非翻译区42 bp,3'非翻译区261 bp,开放阅读框348 bp,编码115个氨基酸.预计蛋白的分子量为11.2 kD,等电点为9.46.此基因有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及25个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY796184(基因)和AAV65513(蛋白).通过疏/亲水性分析,发现肽链分子具有较大范围的疏水面.     

鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的克隆及生物信息学分析

为了解GM-CSF的基因及蛋白质特性,本研究以pUC-GM-CSF为模板,根据GenBank中登录的GM-CSF序列设计引物扩增GM-CSF基因,随后将其克隆至 pMD18-T载体,并对鉴定正确的重组质粒 pT-GM-CSF进行测序分析,然后对GM-CSF基因进行同源性分析、ORF分析、氨基酸序列分析、疏水性分析、磷酸化位点预测、亚细胞定位分析及二级结构预测。结果表明：该基因ORF的全部长度为453 bp,能够编码150个氨基酸,并且在GM-CSF基因所编码的蛋白质中有4个丝氨酸和3个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化的位点。同时,GM-CSF蛋白的最大疏水性为2.267,且有8.91%的可能位于细胞外,有0.8%的可能位于细胞壁,有0.24%的可能位于细胞质。同时,该蛋白质的二级结构主要由无规卷曲、α螺旋和延伸链构成。本研究通过对GM-CSF基因进行生物信息学分析,为探究其免疫增强机制奠定基础。     

小麦品种“陕253”低分子量谷蛋白亚基基因的克隆及原核表达

利用LMW-GS特异引物,从强筋小麦品种陕253中克隆了1个1 498 bp的片段(GenBank登录号为FJ172533),该片段包含全长为912 bp的低分子量谷蛋白亚基的完整编码序列.经比较推导氨基酸序列的同源性,发现该基因属于Glu-D3位点编码低分子量谷蛋白亚基的基因,编码产物N-端具有LMW-m型低分子量谷蛋白亚基的典型特征,系统演化分析也支持这一结果.构建了该基因的表达载体pET32a-GluD3-S253,在宿主菌E. coll Rosetta-gami B(DE3)中经IPTG诱导表达融合蛋白.SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,证实融合蛋白表达成功.