水稻OsWRKY19基因启动子的分析

利用PCR技术从水稻(Oryza sativa)秀水11品种中克隆了转录因子WRKY19编码区5'上游大小为1 404 bp的调控序列，命名为OsW19p, 将它和长度为105、378、977、1 106、1 205和1 306 bp的5'端缺失体分别与gus基因融合，构建植物表达载体。用根癌农杆菌介导法将所有载体转化水稻，GUS组织化学分析和荧光测定结果表明：(1)培养基中的2,4-D强烈抑制 gus基因在愈伤组织阶段的表达；(2) gus基因在转基因植株的根、茎、叶和花中均有表达，在花粉和成熟种子中无表达，在种子萌发时胚有表达，在苗期种子根和不定根及它们的侧根均有表达但根尖无表达，成熟期根部只有侧根有表达；(3)除p105以外OsW19p (p1404)和其它5个不同长度的缺失体均可驱动gus基因在转基因苗叶片中的表达，p1205活性最高，p977和p1306的活性减弱,由此推测-1404～-1306 bp和-1205～-977 bp间包含正调控元件，-1306～-1205 bp和-977～-378 bp间包含负调控元件。     

鸡传染性支气管炎病毒（IBV）广西流行株3＇端非编码区序列分析

本研究应用RT-PCR方法扩增出分离自广西的26株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）以及参考株M41和疫苗株H120、Ma5和4/91的3＇端非编码区（3＇UTR）的cDNA,并对其进行了克隆、序列测定、比较及其系统进化分析。序列分析结果表明,与Beaudette株的3＇UTR序列相比较,26株分离的IBV中有1株和3株的分离株3＇UTR序列分别插入了23个和2个碱基,另外有12株、6株、1株、2株和1株的分离株3＇UTR序列分别缺失了1个、2个、22个、29个和84个碱基,不同毒株之间碱基数量最大相差达107个碱基。系统进化分析结果表明,26株分离株可分为4群,其中21株属于第Ⅰ群,与经典疫苗株H120的核苷酸同源性均较低（54.4%～75.5%）;3株与4/91同属于第Ⅱ群;1株与H120同属于第Ⅲ群;另外1株单独属于Ⅴ群。综上所述,广西流行IBV的绝大部分毒株在3＇UTR序列上与目前常用的疫苗株相比都发生了很大的变异,而且存在多种形式的碱基缺失和插入现象。由此,我们认为流行株的变异可能是疫苗不能提供有效保护的主要原因。     

毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建

SEP（SEPALLATA）类基因属于花器官发育ABCDE模型中的E类基因,拟南芥中的研究表明该类基因可能具有控制花器官形态发育以及激活其它类型基因的功能,是一类花发育过程中的关键基因。因此,研究杨树SEP类基因启动子表达特性对于杨树的开花调控研究具有重要意义。本文根据毛白杨SEP3基因和毛果杨基因组序列设计引物,通过PCR获得了PtSEP3-1,基因上游2000bp的序列。序列分析结果表明该序列具有启动子的基本元件TATA—box和CAAT-box,还包含大量光响应元件ACE、BoxI和Box4等,此外还有脱落酸响应元件ABRE,赤霉素响应元件GARE—motif以及胁迫响应元件HSE、TC—richrepeats等。进一步构建了一个以PtSEP3-1启动子驱动GUS基因的植物表达载体pPtSEP3-1,protest,为该启动子的功能鉴定奠定了基础。     

烟草NtMTPC4启动子的克隆与缺失分析

组织特异性启动子是基因工程研究及实际应用中的重要工具。为了研究烟草NtMTPC4启动子的表达特性,采用实时荧光定量PCR方法分析烟草金属耐受蛋白C4(MTPC4)基因NtMTPC4在烟草不同组织中的表达模式,并利用PCR技术克隆得到NtMTPC4的上游启动子NtMTPC4-P。根据调控元件的分布对NtMTPC4-P进行不同程度的缺失,获得了NtMTPC4-P1、NtMTPC4-P2和NtMTPC4-P3缺失体;构建全长NtMTPC4-P和不同缺失体的植物表达载体,并通过花序浸染法转化拟南芥,对获得的转基因拟南芥进行GUS组织化学染色分析。结果表明,NtMTPC4基因的表达具有组织特异性,其在花中的表达量最高。NtMTPC4-P全长2 287 bp,含有CAAT-box、TATA-box、GTGANTG10和POLLEN1LELAT52等顺式作用元件和调控元件。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子NtMTPC4-P和不同缺失体都能特异性地驱动GUS基因在转基因拟南芥花粉中的表达。本研究结果为通过基因工程技术在花粉中特异表达目的基因提供了新的调控元件。     

苹果异戊烯基转移酶基因启动子调控特性研究

异戊烯基转移酶(IPT)是细胞分裂素合成途径的第一限速酶,过表达苹果MdIPT3a的转基因烟草表现出典型的细胞分裂素特异的生长表型,可作为苹果同源转基因的潜在筛选标记。为阐明MdIPT3a自主启动子对基因表达的调控作用,本试验克隆了富士苹果MdIPT3a基因上游启动子序列,分别构建不同长度的MdIPT3a启动子驱动GUS基因的植物表达载体,以CaMV35S驱动GUS基因的表达载体作为对照,遗传转化烟草W38,并对转基因植株进行GUS定性和定量分析,探讨不同长度的MdIPT3a启动子对GUS表达的影响。结果表明,转基因植株的各组织均有GUS染色,不同长度的MdIPT3a启动子均能驱动GUS基因表达,最小的有效启动子长446 bp,且含MdIPT3a启动子的转基因植株GUS表达水平显著低于含35S启动子的对照植株。本试验结果为MdIPT3a的同源转基因技术研究提供了一定的理论参考。     

水稻psb A启动子诱导的GUS基因在烟草叶绿体中的瞬间表达

利用水稻ｐｓｂＡ基因的启动子与ＧＵＳ基因融合构成叶绿体瞬间表达载体ｐＲＧ６，通过基因枪法将该质粒导入烟草叶片细胞叶绿体中，得到ＧＵＳ基因的瞬间表达。ＧＵＳ反应产生的监色沉淀局限于细胞内某一特写区域，而在核质表达载体ｐＢＩ１２１转化的细胞中蓝色沉淀分布于整个细胞质中。实验表明单子叶植物叶绿体水稻ｐｓｂ Ａ基因的启动子可以十分有效地在双子叶植物烟草细胞叶绿体中起作用，在观察时采用了植物组织切片中的二甲     

甘蓝型油菜SAMDC3基因及其启动子的克隆与分析

S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）是植物体内亚精胺和精胺前体物质形成的关键酶。本研究克隆了甘蓝型油菜（Brassica napus）BnSA MDC3基因家族2个成员的全长cDNA和启动子序列,并对其诱导表达特性进行了鉴定。BnSAMDC3—1（GenBank accession No．HM013966）和BnSAMDC3—2（GenBankac．cession No．HM013967）的全长cDNA分别为1746bp和1754bp,开放阅读框（ORF）长度分别为1101bp和1104bp,在大ORF上游132bp处均包含一个171bp的小ORF。BnSAMDC3基因在叶片中表达量较高,受高温和干旱抑制。6-BA、GA,和SA抑制BnSAMDC3—1的表达,而GA,和甘露醇诱导BnSAMDC3—2表达上调。BnSAMDC3基因启动子具有多个与胁迫和激素诱导相关的顺势调控元件,表明BnSAMDC3可能通过ABA、6-BA和SA信号途径介导植物对非生物胁迫的响应。本研究将有助于进一步探讨甘蓝型油菜抗逆的分子机理,为甘蓝型油菜的栽培和品质改良奠定基础。     

猪诱导多能干细胞多能性相关基因启动子区域甲基化检测

DNA甲基化是一种十分重要的表观遗传修饰,与转座元件沉默、基因组印记以及X染色体失活等多种生物学过程相关。胚胎特异性转录因子的表达可以将已经分化的小鼠(Mus musculus)成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSCs)。由于在重编程过程中还伴随着一系列的表观遗传修饰变化,iPSCs可作为研究表观遗传特点的有利工具,用来研究表观遗传修饰的相互作用及其动态学过程。本研究中,从35 d的猪(Sus scrofa)胎儿分离出胎儿成纤维细胞(PFF),使用经典的4因子组合,即Oct4、Sox2、Klf4和cMyc将PFF重编程为iPSCs,并进行了多能标记的染色,结果表明,所得到的克隆呈现OCT4、SOX2、NANOG和SSEA1阳性结果。采用亚硫酸氢盐测序法对内源性多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的启动子区域甲基化进行了检测,发现其启动子甲基化程度很低,表明体细胞重编程为iPSCs的过程伴随着多能基因启动子甲基化程度的降低,为理解iPS重编程中多能性相关基因的DNA去甲基化过程和了解控制多能性相关基因的表观遗传调节提供基础。     

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子功能区的缺失分析

花生β-1,3-葡聚糖酶基因启动子(Arachis hypogaea promoter of β-1,3-glucanase,Ah-Glu-Pro)属于诱导型的启动子.为分析该启动子序列中对外源信号分子响应的重要顺式调控元件,利用交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,TAIL-PCR)方法扩增得到长度为970 bp的Ah-Glu-Pro序列.PLACE和PlantCARE在线预测结果表明,该启动子序列中含有对病原菌及水杨酸(salicylic acid,SA)响应的顺式调控元件,如GRWAAW、GTl-motif、W-box、RAV lAAT、INRNTPSADB、AMMORESIVDCRNIA1和BIHD 1OS.根据预测结果,在5’端设计5个正向引物Glu-F、Glu-P4、Glu-P3、Glu-P2和Glu-P1,3’端设计一个反向引物Glu-R,5个引物对扩增得到该启动子序列Ah-Glu-P以及5'端4个缺失片段Ah-Glu-P4～Ah-Glu-P1,长度分别为931、767、650、376和217 bp.将这5个片段分别克隆到pCAMBIA 1301-xylA载体中,构建以木糖异构酶基因(xylose isomerase gene,xylA)作为安全筛选标记、以β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase gene,GUS)作为报告基因的相应5个植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-Glu-P～pCAMBIA 1301-xylA-Glu-P1.将这5个表达载体分别转化洋葱(Allium cepa)表皮细胞,进行GUS蛋白组织化学染色及GUS酶活性检测,结果表明,经SA诱导后,转入Ah-Glu-P～Ah-Glu-P3 3个载体的洋葱表皮细胞中的GUS酶活性分别提高1.45、2.16和1.27倍,转入Ah-Glu-P2～Ah-Glu-P1载体的洋葱表皮细胞在SA诱导前后GUS酶活性无明显差别.结合软件预测结果推测,在启动子Ah-Glu-P、Ah-Glu-P4和Ah-Glu-P3内部存在的RAV1 AAT、MYBCOREATCYCB1和INRNTPSADB为对SA响应的正调控元件;在Ah-Glu-P～Ah-Glu-P4之间存在的GT1-motif和AMMORESIVDCRNIA1为对SA响应的负调控元件.对这些重要顺式调控元件功能的进一步确认将为通过调控实现花生内源β-1,3-葡聚糖酶基因的高效表达、提高花生(Arachis hypogaea)的抗病性、以及在花生遗传转化过程中特异诱导表达启动子的有效利用提供理论依据.     

拟南芥低温诱导cor15a基因的启动子克隆及在转基因马铃薯中的表达

利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)品种Columbia的基因组中扩增出低温诱导基因cor15a的启动子片段并插入克隆载体。序列分析表明，克隆的启动子长900bp，与目前已经发表的启动子序列完全一致。将此启动子插入pBI121的gus基因及NOS终止子上游构成表达载体pLB，通过直接法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，并转化马铃薯(Solarium tuberosum)获得转化再生植株。再生植株PCR检测和PCR-Southern鉴定结果证明，cor15a基因启动子已经成功地转入到马铃薯植株基因组中。GUS组织染色证明拟南芥cor15a启动子在马铃薯中也同样具有低温诱导表达的能力。     

棉花DELLA蛋白基因GhGAI3和GhGAI4启动子的克隆及序列分析

棉纤维是纺织行业的重要原材料。赤霉素能够促进棉纤维的生长发育,而DELLA蛋白又是赤霉素信号转导通路中的关键调控因子,因此研究棉花DELLA蛋白基因表达的调控模式,对阐明棉纤维生长发育的分子生物学机理具有重要意义。本研究根据两个棉花DELLA蛋白基因GhGAI3和GhGAI4序列设计特异引物,以陆地棉新陆早13号的基因组DNA为模板,用基因组步移法克隆了棉花DELLA蛋白基因GhGAI3和GhGAI4的启动子。对两个启动子进行序列分析表明,这两个启动子均具有真核生物典型的核心启动子区,同时也都具有一个或多个光响应元件和赤霉素响应元件,说明这两个基因可能受到光信号和赤霉素信号的调控,这与其它植物中DELLA蛋白的表达模式是一致的。此外,这两个启动子还具有各种转录调控相关的顺式作用元件,比如其它激素类的响应元件和逆境胁迫响应元件,说明棉花中DELLA蛋白基因可能在响应其它激素信号以及逆境胁迫中也起到一定的作用。     

基因工程菌诱导表达苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白的条件优化

营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,Vip)是在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)营养生长至对数中期到稳定期期间产生的一类蛋白。为获得苏云金芽胞杆菌Vip3Aa蛋白的高效表达条件,本研究利用正交试验综合考察了大肠杆菌(Escherichia coli)重组基因工程菌BL21-p Czn1-Vip诱导过程中诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对Vip3Aa蛋白表达量的影响。结果表明,该工程菌目的蛋白的最优诱导表达条件:诱导温度21℃、诱导时间8 h、诱导剂(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-dthiogalactoside,IPTG))浓度为200μg/m L;直观分析表明,影响目的蛋白表达量的最主要因素为诱导温度,其次为诱导时间,诱导剂浓度影响最小;方差分析结果表明,诱导温度的P值0.01、诱导时间的P值0.05、诱导剂浓度的P值0.05,与直观分析结果相一致;利用优化后诱导表达条件进行培养,测得目的蛋白最高表达量可占总蛋白的27.6%,相当于常规诱导方法的2.3倍。本研究为大量制备高纯度Vip3Aa蛋白及其深入的理论研究和实践应用提供了基础资料。     

Synthesis and fungicidal activity of novel 4,4'-bis(2' '-aryl-5' '-methyl/unsubstituted-4' '-oxo-thiazolidin-3' '-yl) bibenzyl

Reduction followed by nitration of benzil I yielded 4,4'-dinitrobibenzyl (III) which by reduction furnished quantitatively and analytically pure 4,4'-diaminobibenzyl (IV) which on condensation with different carbonyl compounds gave 4,4'-bis (benzylideneamino) bibenzyls (Va-f). Compounds (Va-f) on cycloaddition with mercaptoacetic acid/2-mercaptopropionic acid yielded the corresponding 4-oxothiazolidin-3-yl bibenzyls (VIa-l). The compounds VIg-l have two chiral centers in each thiazolidinone moiety so two diastereomers are possible, but on crystallization and repeated chromatography, one diastereomer was obtained. The absolute configuration of the diastereomer was tentatively assigned on the basis of (1)H NMR spectra. (1)H NMR spectra of the product showed a distinct doublet at delta 1.22 for C(5)-CH(3) of thiazolidinone ring (22, 23) and a distinct quartet at delta 4.20 for the C(5)-H proton. Similarly, the C(2) proton showed an independent singlet at delta 5.95, so the diastereomers obtained were assigned trans configuration. Compounds Va-f and VIa-l were evaluated in vitro for their fungitoxicities against Fusarium oxysporium and Penicillium citrinum. All the compounds were found to be antifungal active. Some of the compounds displayed activities comparable with that of the commercial fungicide Dithane M-45. Structure-activity relationships for the screened compounds are discussed.     

接种大豆孢囊线虫4号生理小种诱导GmHs1pro-1基因的表达分析

大豆孢囊线虫(Heterodera glycines,Soybean cyst nematode,SCN)是严重危害世界大豆生产的害虫,大豆对孢囊线虫的抗性由多个基因控制,发掘和利用抗病基因对于SCN抗病品种的有效选育至关重要。本研究以大豆(Glycine max)感病品种中黄13和抗病品系中品03-5373为研究材料,对包含线虫抗病基因相关结构域Hs1pro-1_N和Hs1pro-1_C的候选基因GmHs1pro-1的表达特征进行实时荧光定量PCR分析,以期明确该基因与SCN抗性之间的关系。研究发现接种SCN4号生理小种(SCN4)后1d该基因的相对表达量出现明显的上调,比对照样品高13.4倍,其后的各时间点其表达量仍然保持持续上调的趋势,在接种6d后其上调趋势有所减弱。方差分析表明,接种与未接种相对表达量之间的差异均达到显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)水平,说明SCN4侵染条件下,GmHs1pro1基因被诱导表达,该基因对SCN4具有一定的抗性作用。     

圆弧形弹齿滚筒式残膜捡拾机构设计及捡膜性能分析

介绍了一种圆弧形弹齿滚筒式残膜捡拾机构,对该机构的捡膜性能进行了分析验证,通过分析建立了机构的运动模型及残膜相对弹齿运动的微分方程。试验证明机构设计合理,捡膜能力强。在配有起膜铲及膜田表土较干燥条件下,残膜回收率可达100%。     

Hepatoprotective effects of 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone on CCl4-induced acute liver injury in mice

In this paper, the hepatoprotective effects of 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone (DMC) on CCl(4)-induced acute liver injury in Kunming mice were investigated. DMC was administered intraperitoneally (ip) (5, 10, or 20 mg/kg of body weight) for 7 days prior to the administration of CCl(4) (0.1%, ip). Pretreatment with DMC significantly decreased activities of serum hepatic enzymes, namely alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, lactate dehydrogenase, alkaline phosphatase, γ-glutamyl transferase, and total bilirubin, and decreased the elevation of lipid peroxidation, malondialdehyde, reactive oxygen species, and protein carbonyl content. Pretreatment with DMC markedly increased activities of enzymatic antioxidants such as superoxide dismutase, catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glutathione peroxidase, glutathione S-transferase, and glutathione reductase and increased levels of nonenzymatic antioxidant markers such as reduced glutathione, total sulfhydryl groups, vitamin C, and vitamin E in liver. These results combined with liver histopathology demonstrate that DMC has potential hepatoprotective effects, which may be related to the attenuation of oxidative stress, accelerating the antioxidant cascade and inhibition of lipid peroxidation.     

正交试验优化余甘子愈伤组织诱导培养基研究

以余甘子无菌幼苗作为材料,通过正交试验研究影响余甘子愈伤组织诱导的因素,以完善余甘子组织培养体系。结果表明:以茎或叶作为外植体,在MS+1.0 mg/L 2,4-D +0.5 mg/L 6-BA培养基中,愈伤组织诱导率达87.9%以上,愈伤组织生长良好。     

Protective effects of 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone to PC12 cells against cytotoxicity induced by hydrogen peroxide

Oxidative stress has been considered as a major cause of cellular injuries in various clinical abnormalities. One of the possible ways to prevent reactive oxygen species (ROS)-mediated cellular injury is dietary or pharmaceutical therapies to augment the endogenous antioxidant defense capacity. The present study found that 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethylchalcone (DMC), a chalcone isolated from the buds of Cleistocalyx operculatus, possessed cytoprotective activity in PC12 cells treated with H(2)O(2). The results showed that DMC could effectively increase cell viability [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) reduction], decrease the cell apoptotic percentage [annexin V/propidium iodide (AV/PI) assay], prevent the membrane from damage [lactate dehydrogenase (LDH) release], scavenge ROS formation, reduce caspase-3 activity, and attenuate the decrease of mitochondrial membrane potential (MMP) in PC12 cells treated with H(2)O(2). Meanwhile, DMC increased the catalytic activity of superoxide dismutase (SOD) and the cellular amount of glutathione (GSH), decreased the cellular amount of malondialdehyde (MDA), and decreased the production of lipid peroxidation in PC12 cells treated with H(2)O(2).