荧光报告质粒构建及其在布鲁菌细胞侵袭试验中的应用

采取质粒shuffling方法,将含GFPmut1的pPS858和能在布鲁菌中复制的质粒pBBRlMCS-2经KpnI酶切后连接,转化DH5a,利用双抗性筛选重组质粒pBBR1-GFP。将荧光质粒转入布鲁菌,获得荧光标记布鲁菌,并用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞J774A．1,探讨其用于细胞侵袭试验的可行性。结果显示,成功构建布鲁菌荧光报告质粒pBBR1-GFP,用构建好的荧光标记布鲁菌侵染巨噬细胞后,在细胞内观察到带荧光的布鲁菌,且荧光强度与胞内细菌数成正比。细胞侵袭动态试验结果表明,细菌与细胞共孵育45min后,胞内细菌达到饱和。结果表明,成功构建了布鲁菌的荧光质粒报告系统,可用于布鲁菌细胞侵袭试验。     

表达绿色荧光蛋白猪种布鲁菌的构建

为了更直观的观察猪种布鲁菌在宿主细胞/宿主体内的活动规律,本研究首先应用PCR技术扩增pEGFP-N1质粒的N1基因,与pMD18-T载体连接后,成功构建PMD18-N1质粒;进而应用XbalⅠ与SacⅡ限制性内切酶,将PMD18-N1质粒与pBBR1MCS-6质粒分别进行双酶切,并将N1片段反向连接于PBBR1MCS-6载体上,经菌液PCR鉴定与双酶切鉴定,证明成功构建了PBBR1MCS-N1质粒;在此基础上,将PBBR1MCS-N1质粒电转化至猪种布鲁菌感受态细胞,通过含氯霉素的TSA培养基筛选、PCR鉴定、荧光鉴定及菌株的传代稳定性试验与培养特性的观察,最终获得了可稳定表达绿色荧光的猪种布鲁菌。     

鉴别牛羊布鲁菌实时荧光定量PCR方法的建立

[目的]建立准确、快速检测布鲁菌、羊种布鲁菌、牛种布鲁菌的方法。[方法]以BCSP31作为布鲁菌菌属特异性基因,以IS711插入元件作为布鲁菌菌种特异性标志,设计引物和Taqman探针;分别构建标准阳性质粒模板,将其10倍倍比稀释作多重实时荧光定量PCR标准曲线,评价多重实时荧光定量PCR反应体系的敏感性、特异性、重复性。[结果]建立了鉴别牛种、羊种布鲁菌的实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床样品进行检测。[结论]所建立的多重实时荧光定量PCR诊断方法能够快速、准确地鉴别牛种和羊种布鲁菌。     

牛布鲁菌病荧光偏振检测方法敏感性和特异性评估

本文是对荧光偏振试验(FPA)应用于牛布鲁菌病检测时的敏感性和特异性进行评估.对3 022份布鲁菌病阴性血清和300份布鲁菌病阳性血清进行FPA检测,结果3 022份阴性样品经FPA检测为阳性的样品数有1 3份,FPA的特异性为99.6％ (3009/3022);300份阳性血清样品,经FPA检测有6份样品检测为阴性,敏感性为98％(294/300).FPA方法简便、快速、通量大,特异性和敏感性都较高,极适合于大批量牛布鲁菌病检疫、筛查和疫病监控.     

实时荧光定量PCR检测布鲁菌方法的建立

旨在建立实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。经选取高度保守的具布鲁菌属特异性的BSP31基因设计了一对引物及探针,并采用矩阵法优化反应体系,筛选出引物、探针、dNTP和Mg2+最优浓度配比,同时进行了特异性和灵敏性试验,建立了实时荧光定量PCR检测布鲁菌的方法。该方法可用于对布鲁菌病普查监测及进出境动物及其产品的检验检疫。     

布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据布鲁菌BCSP31基因序列设计布鲁菌通用检测引物和探针,建立了布鲁菌Cycling探针荧光定量PCR检测方法。以构建的含BCSP31基因的质粒标准品10倍递进稀释为模板检测其敏感性,结果显示,本方法能检测约10个拷贝的阳性质粒,且标准曲线的线性关系良好。用本方法检测5株不同种的布鲁菌以及猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等4株对照菌。结果显示,5株不同种的布鲁菌均出现典型的"S"型扩增曲线,4株对照菌40个循环内均无CT值出现。用本方法和B4/B5-PCR方法对来自布鲁菌病流行地区3个不同牛场的40份血样、奶样和血清样进行平行检测。结果显示,本方法和B4/B5-PCR方法的结果符合率为80.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的27份样品经本方法检测均为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的13份样本,经本方法检测,其中8份呈阳性,5份为阴性。本方法的敏感性明显高于B4/B5-PCR方法。试验表明,所建立的Cycling探针荧光定量PCR方法具有敏感、特异、稳定等特点,可用于布鲁菌感染的快速检测。     

鹿布鲁菌分型实时荧光定量PCR检测方法的建立

鹿布鲁菌病主要是由牛型、羊型和猪型布鲁菌引起的,其他感染型少见,本研究依据布鲁菌的特异性基因BruAB20168、BMEII0466、BR0952上的部分高度保守片段设计猪型、牛型、羊型引物和探针,用于检测并区分鹿源布鲁菌的种型,且优化了反应体系,筛选出引物、探针的最优浓度配比。将扩增产物连接到pUC57载体上,制备标准品及标准曲线,建立鹿布氏菌各分型荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、稳定性、敏感性进行评价。由标准曲线敏感性可知该方法的最低检测浓度分别可达到12、9、8copies/μL,比常规PCR灵敏度高出很多。     

布鲁菌病及其诊断方法研究进展

布鲁菌病是当前一种严重威胁人类和多种动物生命健康的人兽共患病.由于该病临床症状复杂,引起的发热、流产等病理损害易与某些常见疾病混淆,给诊断带来了一定的困难.目前,针对布鲁菌病的传统诊断方法主要是血清学方法和细菌学方法,但由于耗时耗力或对实验条件要求太高等原因而具有一定的局限性.酶联免疫吸附试验是一种快速的诊断方法,此种方法克服了以往方法的缺点,特异性和敏感性较高,具有重要的推广价值.鉴于布鲁菌病危害的严重性和防治的重要性,对布鲁菌病的危害、症状、流行特点、检测方法等进行了综述.     

布鲁菌介导细胞自噬的研究进展

布鲁菌是布鲁菌病的病原体,在世界范围内给养殖业带来巨大损失.自噬是细胞的一种代谢方式,细胞在自噬相关基因的调控下清除细胞内病原微生物和吞噬降解受损、衰老细胞器及大分子物质,以维持机体内环境平衡.布鲁菌入侵细胞后,能够诱发细胞自噬,而这一复杂的过程需要很多细胞因子的参与,探究布鲁菌引发的细胞自噬已成为揭示布鲁菌致病机制的...     

奶牛布鲁菌病及其防控

奶牛布鲁菌病是由布鲁菌引起的一种人畜共患传染病。对奶牛布鲁菌病从病原学、流行病学、发病机理、临床症状及病理变化等方面进行了简述,并对其诊断、防控以及流行趋势等作了介绍。     

羊布鲁茵16MvjbR蛋白酵母双杂交诱饵表达载体的构建及其毒性和自激活效应检测

利用Sos招募系统（SRS）,通过聚合酶链反应（PCR）扩增羊布鲁菌16MVjbR基因的编码序列,定向克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵重组质粒pSos－VjbR,经测序正确后其将转入酵母菌cdc25H（α）感受态细胞,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无自激活作用。结果表明,经序列测定证实重组诱饵质粒pSos－VjbR构建成功。重组质粒转化入酵母细胞后,经检测其表达产物对cdc25H（α）酵母细胞无毒性作用,对报告基因亦无自激活作用。这为利用SRS来研究与羊布鲁菌16MVjbR蛋白相互作用的蛋白奠定了基础。     

Brucella suis biotype 1 infection in a dog

Brucella suis biotype 1 was isolated from the semen of a dog with hindlimb weakness and a large, firm, left epididymis. A semen sample was oligospermic, with many neutrophils, the numbers of which decreased in serial sampling. A card agglutination test for B abortus and a rapid slide agglutination test for B canis were positive. The modified 2-mercaptoethanol slide agglutination test for B canis and the agar gel immunodiffusion test, using B canis cell wall antigen, were negative. At necropsy, chronic granulomatous inflammation was found in, and B suis biotype 1 was isolated from, the left epididymis and prostate gland.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗的构建及其在Marc-145细胞中的表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）LV和VR-2332株的核苷酸序列,设计合成了1对特异性引物,对PRRSV四川分离株SC1和SC2进行RT-PCR,扩增出病毒ORF5基因。利用真核表达质粒pcDNA3．1（＋）成功构建了PRRSV四川分离株ORF5基因疫苗pcDNA-PRRSV-SC1-ORF5和pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5。通过脂质体转染法和电穿孔转染法将pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5转染Marc-145细胞,间接免疫荧光技术跟踪监测ORF5基因的表达情况,结果表明,脂质体转染法和电穿孔转染法分别在转染26h和23h后检测到ORF5基因特异性表达产物,且随着培养时间的延长,特异性表达产物增多,两者均在56h达到高峰;这证明pcDNA-PRRSV-SC2-ORF5在Mare-145细胞中已高效表达,为PRRSV基因疫苗在临床上应用提供了实验依据。     

乳酸菌Nisin诱导表达载体的构建和鉴定

为构建乳酸菌Nisin诱导表达载体,实现外源目的基因在乳酸菌中的可控表达,本研究以产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增双组份调控元件nisRK基因和诱导型启动子nisA基因,并克隆至乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pW425et中,以nisA基因替换原组成型启动子P32,构建乳酸菌Nisin诱导表达载体pW425N。为检测载体的诱导表达功能,以gfp基因作为报告基因,构建重组表达载体pW425N-gfp,以分离自仔猪肠道内嗜酸乳杆菌为受体菌,电转化法制备重组乳酸菌pW425N-gfp/L.acidophilus。结果表明,重组载体能够在Nisin诱导下表达目的荧光蛋白,并且最佳Nisin有效浓度为30 ng/mL,最佳诱导时间为3 h。该表达载体的构建为外源功能性蛋白在乳酸菌中的诱导表达奠定基础。     

Brucella suis biovar 3 infection in a Kentucky swine herd

Sows from a large farrow-to-finish operation in western Kentucky had late-term abortions. Boars and breeding-age sows were tested serologically for brucellosis, and 83 of 125 were classified as reactors. No brucellae were isolated from the tissues of 6 unbred reactor sows, but Brucella suis biovar 3 was recovered from 5 aborted fetuses. Epidemiological studies failed to determine the source of the infection.     

Characterization of the main immunogenic proteins in Brucella infection for their application in diagnosis of brucellosis

Brucellosis is an important zoonotic bacterial disease widespread in the world. The key step of control this disease is accurate diagnosis and elimination of diseased animals. The classic diagnostic methods, such as tube agglutination test, are inaccurate and nonspecific, because of cross-reaction with Yersinia enterocolitica serotype O:9. Previously, several proteins were reported as Brucella main immunogens. In this study, we used animal infection model to evaluate antibody production against OMP16, BP26, BLS, BCSP31, VirB12, SodC and GroEL proteins and investigated their application in diagnosis of brucellosis. The results showed that the BP26 and BLS are two best immunogenic proteins. In further study, we detected 44 clinical bovine sera using western blot, showing that the BP26 and BLS reacted with 30 Brucella-positive sera, but false-positive results were also shown in 14 Brucella-free sera. In an indirect ELISA assay, compared to lipopolysaccharide-based ELISA, the conformance of the BP26-based ELISA was 92.68 % in Brucella-positive sera, but only 52.94 % in Brucella-free sera. The BLS-based ELISA can hardly differentiate positive sera from negative sera. Besides, truncated fragments of the BP26 protein cannot exclude false-positive results in detection of Brucella-free sera. Altogether, although Brucella main immunogenic proteins have good reaction with Brucella-positive sera, false-positive reaction with Brucella-free sera may lead to misdiagnosis of brucellosis, suggesting that it should be more careful to use these immunogenic proteins as antigen targets to diagnosis of brucellosis.