甘蓝类植物小孢子培养及植株再生研究

对3个甘蓝类植物(甘蓝、青花菜、羽衣甘蓝)19个品种小孢子胚胎发生和植株再生的影响因素进行了研究,结果表明,基因型不仅影响供试材料的小孢子胚状体发生频率,也影响胚状体的质量;4℃低温预处理0 ～2d结合32.5℃热激1d,能显著提高供试基因型小孢子出胚率.胚状体先在NLN-13液体培养基中培养25d,有利于胚状体分化成苗;后在B5固体分化培养基中添加1％ ～1.2％琼脂,可有效促进胚状体萌发和植株再生.小孢子再生植株先使用流式细胞仪在生长初期鉴定倍性,后对单倍体植株采用200mg·L-1秋水仙碱浸根处理20h,并用流式细胞仪鉴定,此方法可快速、有效地获得双单倍体植株.     

小孢子培养获得松花型花椰菜DH再生植株

对5个松花型花椰菜(Brassica oleraceavar.botrytisL.)杂种一代的小孢子培养研究表明,小孢子胎胚发生主要依赖于基因型,庆农65天的每花蕾胚状体产量最高,平均达15.5个。松花菜的胚状体萌发率一般在30%左右,并有效地获得了大量的DH再生植株。冷激预处理能显著地影响花椰菜小孢子的胚胎发生,但供体材料间存在不同的结果。结球期和开花结角期再生植株的生育期与育性出现较大分离,可育且能正常结角的比例约占全部小孢子再生植株的50%以上,因而不再需要加倍处理。     

小孢子培养有效获得松花型花椰菜DH再生植株

对5个松花型花椰菜杂种一代的小孢子培养研究表明，小孢子胎胚发生主要依赖于基因型，庆农65天的每花蕾胚状体产量最高，平均达15.5个。松花菜的胚状体萌发率一般在30%左右，并有效获得了大量的DH再生植株。冷击预处理能显著影响花椰菜小孢子的胚胎发生，但供体材料间存在不同的结果。结球期和开花结角期再生植株的生育期与育性出现较大分离，可育且能正常结角的比例约占全部小孢子再生植株的50%以上，因而不再需要加倍处理。     

结球甘蓝小孢子胚诱导与植株再生

以4个结球甘蓝品种为试材,研究不同条件对小孢子胚诱导和植株再生的影响.结果表明:基因型是限制小孢子胚发生的主要因素.适宜取材的花蕾大小为2.5～4.0mm,瓣药比为2/3 ～7/6,盛花期是取蕾的适宜时期;培养基大量元素减半和添加适量活性炭均可显著提高胚状体诱导率,但对于难出胚基因型没有起到诱导出胚的作用;胚状体的诱导和萌芽需要植物生长调节剂NAA和6-BA的参与,适宜的胚状体诱导培养基为NLN-13+0.2mg· L-1 6-BA+0.1mg·L-1 NAA,胚状体诱导率为38胚/10蕾,适宜的胚状体生芽培养基为MS+0.4mg·L-16-BA +0.1mg·L-1 NAA+3％蔗糖+0.7％琼脂,芽诱导率达46.7％.     

不结球白菜游离小孢子培养及植株再生研究

为进一步优化不结球白菜游离小孢子培养技术体系,本研究以20个不同基因型的不结球白菜为试验材料,研究不同基因型、4℃低温胁迫处理时间和头孢噻胯浓度对游离小孢子胚胎发生的影响,并对小孢子胚胎发育和再生过程进行观察和倍性鉴定。结果表明,当花瓣/花药(P/A)长度比值为0.85～1.10时,不结球白菜小孢子主要处于单核晚期;共有10个基因型不结球白菜出胚,其中出胚率最大的为H20,平均出胚率为7.75胚·10蕾^-1;4℃低温胁迫处理1 d时不结球白菜出胚率最高;头孢噻胯对不结球白菜出胚率的影响与基因型密切相关;从胚状体到再生幼苗阶段,不结球白菜基因型不同,其胚胎再生频率也不同;倍性鉴定共检测出21个双单倍体和2个单倍体,自然加倍率为91.3%,不结球白菜植株形态表现出明显的多样性。本研究结果为不结球白菜游离小孢子高效培养体系的优化提供了一定的技术支撑。     

培养基水分状况对大白菜小孢子胚成苗的影响

为提高大白菜小孢子胚成苗率，对影响胚发育成苗的培养基水分状况进行了研究。在诱导胚 生的ＮＬＮ１３培养基中、培养－３周形成的子叶期胚质量好，成苗率高，随着培养时间的延长，胚质量和成苗率逐渐降低。诱导胚发育成苗的ＭＳ０培养基的琼脂含量，对于小孢子胚的成苗率有重要的影响。     

低温预处理和高温饥饿胁迫对冬小麦小孢子胚胎发生和植株再生的影响

以几种不同基因型的冬小麦(Triticum aestivum)为材料，研究了低温预处理(单核早期的离体麦穗，4℃，处理3周)和高温饥饿胁迫(上述处理过的麦穗的花药，置于饥饿培养基B中，33℃处理4d)对几种冬小麦基因型小孢子胚胎发生和植株再生的影响。结果表明：高温饥饿处理后，供试6种基因型都得到了诱导胚，其中F1-2获得的胚最多，为107．2／穗；低温预处理后，供试6种基因型中有5个基因型获得了诱导胚，说明高温饥饿处理可以在一定程度上克服基因型对胚胎发生的限制作用；高温饥饿预处理后，可获得大量的小孢子胚胎，但胚胎发育缓慢，分化绿苗频率极低：低温处理诱导产生的胚胎虽然相对较少，但胚胎生长速度快，再生能力强，绿苗产量高，适合在加倍单倍体育种中应用。     

鉴定水稻花培再生植株倍性水平的方法

测量了水稻花培再生植株的花序长度，植株高度和颖长，发现只有颖长可以将再生植株明显分成３９在。细胞深安颖长划分的３类植株分别为单倍体、二倍体和三倍体。由辐照愈伤细胞再生的植株也获得相似结果。辐照虽会引起生理失调，但以颖长作为水稻植株倍性水平的指标较为可靠。     

大白菜BrTCP24基因的克隆与功能分析

近年来,由于家庭结构的变化,市场对小株型大白菜的需求日益迫切.开展负调控叶球大小发育相关基因的克隆与功能研究有助于加快小株型大白菜品种的选育进程.本研究利用RT-PCR方法从大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)自交系福山包头叶片中分离了一个TCP第二亚族成员基因,命名为BrTCP24.BrTCP24基因编码区内无内含子,开放阅读框(ORF)全长1 221 bp,预测编码406个氨基酸.利用MEGA4.0软件将BrTCP24与拟南芥(Arabidopsis thaliana)TCP家族基因进行进化分析发现,BrT-CP24与AtTCP3同属于一个分支,在进化上具有较近的亲缘关系.用DNAMAN软件对BrTCP24和AtTCP3蛋白进行多序列联配分析发现,二者的氨基酸一致性可达到55.17％,在保守的TCP结构域其一致性可高达91.53％.这种进化上的亲缘关系和序列上的保守性,暗示二者可能具有类似的生物学功能.通过半定量RT-PCR分析发现,BrTCP24基因在大白菜的根、茎、莲座叶、包叶、盛开的花、受精后10 d的果夹和花蕾中均有表达,其中莲座叶中表达量最高,根、包叶、盛开的花、受精后10d的果夹和花蕾中的表达量次之,短缩茎中表达量最低;另外,在5 μmol NAA处理的12h内BrTCP24的表达水平未发生明显变化.为进一步研究BrTCP24基因的功能,我们构建了转化拟南芥的正义表达载体(35S::BrTCP24),并转入拟南芥中.通过卡那霉素筛选以及基因组DNA PCR鉴定,共得到17株转基因拟南芥植株.通过对其中5株的RT-PCR分析发现,它们都能够转录表达BrTCP24基因.利用荧光实时定量PCR方法对部分转基因植株的插入拷贝数进行检测发现,BrTCP24基因以单拷贝形式插入拟南芥基因组.进一步研究发现,与野生型拟南芥相比,过量表达BrTCP24基因可导致转基因拟南芥的下胚轴和叶器官明显减小.此外,过量表达BrTCP24基因抑制了与器官大小相关基因ANT、AtEXP10、AtGRF5、AtGIF1和CycD3;1的表达.这些结果表明,大白菜BrTCP24基因可能通过抑制细胞的生长参与调节植物器官大小的发育.     

大白菜抽薹相关基因BrFLC1的KASP标记开发

为了提高大白菜耐抽薹品种的分子育种效率,本研究针对大白菜抽薹相关基因BrFLC1第6个内含子的第一个碱基(Pi6+1)G-A的SNP变异开发进行高通量检测的竞争性等位基因特异性PCR(KASP)标记。结果表明,开发的KASP标记BrFLC1-KASP1可有效将晚抽薹类型材料Y177-12(G)和早抽薹类型材料Y195-93(A)分为2组。利用BrFLC1-KASP1标记可以对57份大白菜材料的基因型进行有效鉴别,且鉴定结果与酶切扩增多态性标记(CAPS)G-MvaI以及直接测序法的鉴定结果完全一致。综上所述, BrFLC1-KASP1标记在大白菜材料中具有通用性,且具有准确率高、成本低、效率高的特点。本研究结果对大白菜耐抽薹性的分子标记辅助选择具有重要的育种实践价值。     

大白菜InDels标记开发及其在剩余杂合体鉴定中的应用

大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)参考基因组序列的公布及测序成本的降低为大规模开发插入/缺失(Insertion/Deletion,InDel)标记提供了可能.本研究以性状差异明显的大白菜自交系He102与06-247为亲本,开展了全基因组重测序、标记开发和验证工作.二者测序深度分别为10×和8×,经筛选共获得330 218个InDels差异位点,出现频率为1.2个/kb,其中有11 238个差异位点位于编码区,包括5 184个差异基因,每个基因平均包含2.2个差异位点.分别以He102与06-247测序数据中筛选出的多态性InDels位点为参照,从10条染色体上随机选择933个位点进行了PCR扩增及电泳检测验证.结果表明,测序深度对假阳性率有直接影响,以测序较深的材料中筛选到的差异位点为参照,其验证结果的假阳性率亦较高,反之则较低.本研究中以He102与06-247为参照选择InDels位点验证的平均假阳性率分别是51.9％和22.5％.从933个位点中共筛选出593个在亲本之间实际表现为多态性的位点,这些差异位点中有375个位于编码区,是潜在的功能性标记.利用上述差异位点,检测了He102与06-247衍生的F7代重组自交系群体,明确了F7代各株系在593个位点的纯/杂合状态,为利用剩余杂合株系精细解析和精准定位大白菜耐抽薹、抗病毒、抗干烧心等重要农艺性状奠定了基础.     

结球白菜结球前期基因表达序列标签（EST）分析

以结球白菜(Brassica rapa L.ssp．pekinensis)结球前期心叶为材料，构建了结球前期球叶cDNA文库，随机挑选克隆单向单次测序后，共得到1162条峰图良好和插入片段长度大于150bp的可用序列。BLASTX及BLASTN序列比对分析表明，94．8％(1102／1162)的表达序列标签(EST)可在蛋白质或核苷酸水平上找到同源类似物。同源性最大的蛋白质按物种来源分析后发现，大约77％的功能已知蛋白质来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，另外还有60个EST与已发表的植物基因没有同源性，这一部分EST对于研究结球白菜独特的生理和形态发育途径以及开展基因组分子作图具有重要的意义。同源蛋白质按其功能进行分类表明，参与蛋白质合成过程的酶或蛋白质的EST数量最多，其次是参与能量代谢过程(包括光合作用)的EST序列。在核苷酸水平上，全部EST中只有51％的同源物来自拟南芥。对上述1162条EST进行片段重叠群分析(contig analysis)共获得895个非冗余片段重叠群，其中723个仅由一个EST组成(即singletons)，表明结球白菜结球过程中表达的基因种类繁多。大量EST的获得为进一步了解结球白菜结球机制及获取相关基因提供了重要的序列信息。     

大白菜简单序列重复(SSR)和插入/缺失(InDel)标记的开发及通用性分析

为探讨大白菜基因组序列中SSR位点的分布规律并开发SSR引物,利用SSRHunter软件对大白菜A10(16899818～17299817)的DNA序列进行简单序列重复(SSR)位点查找,共得到394个SSRs,平均每1.02kb出现1个SSR。二核苷酸和三核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占79.44%和18.78%。为了提高SSR标记开发的准确性和通用性,对检索得到的含SSR位点的序列进行了同源比对,选取符合条件的15条SSR序列并设计引物;依据Blast过程中发现的在SSR位点不存在差异而在其侧翼序列中存在插入/缺失(InDel)差异的序列,设计了19条InDel引物。用34对SSR及InDel引物在6个大白菜(Brassica rapassp.pekinesis)材料中进行多态性研究,发现28对引物能扩增出理想的PCR产物,有效扩增率为82.35%,其中27对引物具有多态性,多态性比率为79.41%。为验证SSR引物的真实性,随机对4对SSR引物的部分白菜扩增片段进行了测序,发现100%的片段具有相应的SSR位点。28对SSR和InDel引物在甘蓝(B.oleracea)、油菜(B.napus)和萝卜(Raphanus sativus)品种的有效扩增率分别为85.71%、100%和77.78%,说明新开发的SSR和InDel标记具有较好的多态性和通用性。利用6对引物分析了48份十字花科种质的遗传多样性,结果表明48份材料被明显地区分成白菜和甘蓝组、萝卜组、油菜组3大类群,与传统分类一致。大白菜SSR和InDel标记的开发对于十字花科种质亲缘关系及遗传多样性分析具有重要的应用价值。     

大白菜与结球甘蓝种间异源多倍体的鉴定

利用异源多倍体作为桥梁材料是克服远缘杂交障碍,创制新种质和进行品种改良的一种重要途径.本研究对已获得的大白菜(Brassica campestrisL.ssp.pekinensis (Lour.) Olsson)与结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)种间异源四倍体和异源三倍体,利用形态学、解剖学、分子标记及细胞学等方法进行比较鉴定.研究表明,多倍体在植株形态、花器官和气孔大小等方面均表现出巨大性和超亲优势,其中四倍体比三倍体表现普遍更明显.多倍体的气孔密度显著的低于双亲.多倍体花粉生活力比双亲降低,四倍体花粉活力为81.56％,三倍体的花粉活力仅有18.78％.多倍体自交结实性明显低于双亲,四倍体自交结实率仅为0.28％;四倍体作为母本与大白菜杂交结籽率比其反交要高,是反交的2.11倍,以三倍体为母本或父本时与大白菜杂交,结实均非常低,且三倍体自交未获得种子.相关序列扩增多态性(SRAP)标记结果表明,多倍体中包含了双亲的遗传信息,但分f标记并不能区分四倍体与三倍体.细胞学观察显示,四倍体的染色体数目为2n=4x=38,三倍体的染色体数目为2n=3x=29.大白菜-结球甘蓝异源多倍体的鉴定为进一步大白菜品种改良和新种质的创制提供了基础资料.