高表达粟酒裂殖酵母SpTrz2p对细胞周期的影响

[目的]测定粟酒裂殖酵母高表达的SpTrz2p对其细胞周期的影响。[方法]将粟酒裂殖酵母的trz2+克隆到pREP4x质粒上,构建带有SpTrz2的高表达载体,将构建成功的重组子转化至野生型粟酒裂殖酵母细胞中,利用流式细胞仪检测细胞周期的变化。[结果]高表达SpTrz2p可导致酵母细胞形态和周期的改变,使大部分酵母细胞停留于G1期,这说明高表达SpTrz2p对细胞周期有明显影响。[结论]该研究结果表明高表达SpTrz2p给细胞造成的致死毒性是通过影响细胞周期实现的。     

粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白全长和N端的原核表达与多克隆抗体制备

采用生物信息学方法分析粟酒裂殖酵母SpTrz2蛋白的生物学特性,利用PCR方法扩增粟酒裂殖酵母yAS56菌株SpTrz2的全长和N-末端一半的编码基因,通过NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点将SpTrz2的全长和N-末端一半编码基因定向插入pET-28a(+)原核表达载体中,并转化大肠埃希菌BL21(DE3);经过IPTG诱导...     

粟酒裂殖酵母蛋白质细胞定位载体的构建

[目的]构建用于研究粟酒裂殖酵母蛋白质细胞定位的载体。[方法]将gfp＋和nmt1＋启动子基因克隆到pJK148质粒中,构建含有GFP的表达载体,并利用野生型trz1＋检测荧光表达效果。[结果]nmt1＋启动子与trz1＋的起始密码子相距45个碱基时,无荧光信号。当nmt1＋启动子与trz1＋的起始密码子相距6个碱基时,荧光信号很强。[结论]可以利用pYJ4研究粟酒裂殖酵母蛋白质的细胞定位。     

β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因在粟酒裂殖酵母中的表达及功能分析

【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小为76ku的目的蛋白条带,在SP-Q01细胞中重组酶活性最高达155U/mL,最佳培养时间为72h,产生酶活的最适温度为60℃。【结论】成功克隆出了绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,该基因能在粟酒裂殖酵母细胞中成功表达,为绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的深入研究和应用奠定了基础。     

大肠杆菌Nissle 1917菌株荚膜多糖合成基因kfiA的功能研究

[目的]分析益生菌EcN的荚膜多糖合成基因簇,寻找致病性大肠杆菌K5菌株的肝素前体多糖替代来源。[方法]通过基因敲除、基因回补、1H核磁共振(NMR)检测等技术手段,研究了kfiA基因在EcN荚膜多糖合成过程中的功能。[结果]利用λ-red重组系统成功构建了kfiA突变株,利用NMR检测发现kfiA缺失突变株的荚膜多糖特征峰消失,又通过染色体重组技术,把kfiA基因插入了EcN突变株的基因组中,核磁共振检测重新发现了荚膜多糖特征峰。[结论]kfiA基因是EcN菌株荚膜多糖合成途径的一个关键基因,参与了荚膜多糖合成。λ-red重组系统与染色体重组技术同样适用于EcN菌株,可为后续的菌株改造提供参考。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1 821～+61 bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1 882 bp的片段,并构建了9个pGL3-mGH promoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110 bp以内,启动子区-218～-110 bp和-429～-218 bp间存在正向调控元件。     

酿酒酵母抗氧化酶系统对NaCl和Na_2CO_3胁迫的生理响应

[目的]研究酿酒酵母SOD和CAT对NaCl和Na2CO3胁迫的生理响应。[方法]采用分光光度法,测定不同浓度NaCl和Na2CO3胁迫条件下酵母菌SOD和CAT的活性指标;采用比浊法,测定不同浓度NaCl和Na2CO3胁迫对酵母铜/锌超氧化物歧化酶缺失菌株（sod1Δ）和过氧化物酶缺失菌株（ctt1Δ）生长的影响。[结果]随着NaCl和Na2CO3胁迫浓度的升高,酵母细胞内SOD和CAT活性呈现上升趋势;与野生型菌株相比,NaCl和Na2CO3胁迫对sod1Δ和ctt1Δ基因缺失菌株产生更加明显的生长抑制作用。[结论]SOD和CAT在酿酒酵母抵抗NaCl和Na2CO3胁迫中发挥重要作用。     

甘露聚糖酶基因3'端缺失研究

[目的]初步研究甘露聚糖酶基因3’端对甘露聚糖酶功能的重要性。[方法]以甘露聚糖酶的二级结构为基础,用PCR扩增的方法获得3’端特异性缺失的甘露聚糖酶DNA片段,连接到载体上,表达并鉴定酶的活性。[结果]删除甘露聚糖酶基因3’端246bp后甘露聚糖酶依然具有酶活性。[结论]甘露聚糖酶基因3’端的部分序列不是酶具有功能所必需的。     

大豆查尔酮异构酶基因的克隆及粟酒裂殖酵母表达载体的构建

利用RT-PCR克隆Ⅱ型大豆查尔酮异构酶基因(CHI1A),然后将目的片段与克隆载体pMD18-T质粒相连接,检测后将目的基因重组于粟酒裂殖酵母表达载体pESP-2的MCS序列之中,使用电击法将重组质粒转化进入粟酒裂殖酵母中,用PCR和双酶切的方法来检测试验结果,表明获得了CHI1A完整开放阅读框(670bp),与已报道序列(NO:AY595413)的同源性达到99%。PCR和酶切鉴定表明,CHI1A已导入到酵母表达载体中。查尔酮异构酶基因的克隆、粟酒裂殖酵母表达载体的构建,为该基因的应用提供了依据。有望利用基因工程技术将该基因重组于酵母基因组中并表达目的蛋白,以此来催化合成黄酮和异黄酮类化合物。     

甘蔗渣淀粉功能降解菌筛选及s2g5-1和s3g4-8的鉴定

[目的]筛选甘蔗淀粉功能降解菌,并对菌株s2g5-1和s3g4-8进行鉴定。[方法]利用多种选择性培养基,从自然发酵不同阶段的甘蔗渣中分离到多种淀粉分解菌,并对其进行初筛和复筛。[结果]获得了淀粉降解功能菌株s2g5-1和s3g4-8。通过形态、生理生化和分子综合鉴定得出s2g5-1和s3g4-8菌株均为解淀粉芽孢杆菌。[结论]该研究结果为甘蔗渣工厂化应用提供了理论依据。     

蛹虫草无性型蛹草拟青霉的电泳核型分析

采用等高锁状均质电场(CHEF)凝胶电泳技术,对蛹虫草无性型-蛹草拟青霉(Paecilomyces militaris Liang)进行电泳并分析其核型.以温汉逊氏酵母(Hansenula wingei)及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)菌株的染色体DNA大小作为分子量标记,3株蛹草拟青霉基因组中各包含7条染色体DNA,其大小都在2 Mb至5.7 Mb之间.实验结果表明各菌株间核型不完全相同,存在一定的差异,呈现多态性.     

关中平原地区平菇优良菌株的筛选

[目的]筛选出适合关中平原地区栽培的优质高产平菇菌株。[方法]对5株平菇菌株的菌丝生长状况、菌丝的栽培性状、农艺性状、生物学效率、子实体产量等主要指标进行综合评价。[结果]德丰5号菌株满袋时间短,子实体产量高,抗逆性强,生物学效率高。该菌株的满袋时间为25 d,子实体平均产量为1 798.09 g,平均生物学效率为148.8%。[结论]德丰5号最适合在关中平原地区栽培。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析(英文)

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1821~+61bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1882bp的片段并构建了9个pGL3-mGHpromoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110bp以内,启动子区-218~-110bp和-429~-218bp间存在正向调控元件。     

中华补血草Syntaxin基因的克隆(英文)

[目的]对中华补血草Syntaxin基因进行克隆。[方法]以中华补血草叶片为材料,提取总RNA并进行反转录反应。依据已知Syntaxin基因5’端EST序列信息设计巢式引物,以反转录得到的cDNA为模板,利用2轮PCR扩增cDNA3’末端(3’RACE),获得Syntaxin基因3’端序列。[结果]获得1090bp的DNA片段。分析表明,该片段编码LsSyntaxin全长基因,其中开放阅读框长816bp,编码271个氨基酸。该基因编码的Syntaxin蛋白相对分子量为30254.3Da,理论等电点为5.55。[结论]为研究Syntaxin基因在补血草中的功能及其在补血草泌盐过程的作用奠定了基础。     

甘蔗渣淀粉功能降解菌筛选及s2g5-1和s3g4-8的鉴定

[目的]筛选甘蔗淀粉功能降解苗,并对菌株s2g5-1和s3g4-8进行鉴定。[方法]利用多种选择性培养基,从自然发酵不同阶段的甘蔗渣中分离到多种淀粉分解菌,并对其进行初筛和复筛。[结果]并对其进行了获得了淀粉降解功能菌株s2g5-1和s3g4-8,及其最适培养基改良NA培养基和淀粉培养基,并进行了培养基优化。通过形态、生理生化和分子综合鉴定得出s2g5-1和s3g4-8菌株均为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。[结论]该研究结果为甘蔗渣工厂化应用提供了原论依据。     

施氏假单胞菌75mRNA差异显示PCR方法的建立

为丰富原核生物基因表达差异的研究方法,将应用于真核生物中的差异显示PCR方法应用于原核生物基因差异表达的研究,以1株有机磷农药乐果的降解茵施氏假单胞茵(Pseudomonas stutzer)75为研究材料,以5’末端依赖性的RNA外切酶(Terminator Exonuclease)降解其中的16S rRNA和tRNA,并用随机引物替代锚定引物,改良真核生物差异显示PCR,建立原核生物mRNA差异显示PCR的试验体系.以LB培养基培养的菌株为对照组,以无机盐培养基(乐果为唯一碳源)为试验组.结果表明:提取总RNA,通过5 ’-磷酸基团依赖的核酸外切酶降解法获得mRNA,经逆转录,用双随机引物扩增获得253个差异基因,16S rRNA、tRNA的污染较少,其中之一为硫酸盐运输蛋白基因.     

副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统1内杆状蛋白基因vscI的功能分析

[目的]Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretion systems,T3SS)在副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)致病过程中发挥重要作用.本试验旨在探讨T3SS1内杆状蛋白基因vscI的功能.[方法]以副溶血弧菌POR-1菌株为研究对象,构建vscI缺失株ΔvscI与回补株CΔvscI,检测野生...     

生物净化槽中除磷菌的筛选鉴定与工艺优化

[目的]筛选出1株专性除磷菌并优化其培养条件。[方法]利用筛选及分离培养基从采自崇明岛使用的生物净化槽的菌种中筛选出专性除磷菌并优化其培养条件。[结果]筛选出的菌株C-7为杆菌,革兰氏染色反应呈阳性,茵落呈灰白色,圆形,鞭毛侧生。培养温度为35℃时,菌株C-7的除磷效率最高。培养液的总磷（TP）去除率在前4d里逐渐增大,至第5天达最大值,此后基本保持稳定。鉴定结果表明,该菌株为枯草杆菌。该菌株生长的最佳初始pH值和初始温度分别为6．5～7．0和30～35℃,5d后培养液中TP的降解率达20．3％。崇明岛厌氧净化槽一生态浮床组合工艺对磷平均去除率为79．4％,厌氧净化槽对去除’IP的贡献率为53％。该菌株在最佳环境条件下的除磷率可达20．3％。[结论]该研究为农村地区的生活污水处理提供了技术支持。     

Cdh1和Num1过表达菌株的构建

[目的]研究Cdh1和Num1之间是否存在相互作用,构建用于Cdh1和Num1免疫共沉淀试验的过表达菌株。[方法]首先在酵母菌株YWL630中用GAL1和3HA对CDH1进行标记,构建GAL1-3HA-CDH1 NUM1-GFP菌株,再利用酵母四分体解离的方法使菌株YWL63和YWL490分别与该菌株杂交并进行四分体解离,从而得到所需菌株。[结果]成功构建不同基因型和配型的重组酵母菌株,其中YT52成功过表达了约340 kD的Num1,YT53成功过表达了340 kD的Num1和75 kD的Cdh1,YT57成功过表达了75 kD的Cdh1。[结论]经过同源重组的方法成功标记CDH1并诱导蛋白过表达,通过酵母四分体解离的方法构建用于Cdh1和Num1互作试验的过表达菌株,为揭示APC/C是否介导Num1的降解及机制奠定基础。     

Bacillomycin D合成酶系NRPS硫酯酶结构域位移对脂肽合成的影响

[目的]本文旨在研究解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)fmbJ菌株中Bacillomycin D合成酶系非核糖体肽合成酶(NRPS)硫酯酶TE结构域位移对脂肽合成的影响。[方法]通过温敏型质粒pKS2介导的同源重组将fmbJ菌株中Bacillomycin D合成酶系NRPS硫酯酶TE结构域分别前移至模块5和模块6末端，然后对fmbJ突变菌株的发酵产物进行高效液相色谱(HPLC)、液相质谱(LC-MS)以及黄曲霉菌抑菌试验分析，并且使用AlphaFold蛋白结构数据库预测NRPS合成酶系末端PCP-TE双结构域的三维结构，以及分析双结构与两者之间的相互作用关系。[结果]在突变菌株fmbJ-M5-TE_Long的发酵液中检测出线性脂五肽(C_14-15β-NH₂FA-Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu)和环状脂五肽[C_14-15β-NH₂FA(Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu)],在突变菌株fmbJ-M6-TE_Long...