运用体内表达技术筛选霍乱弧菌感染成年小鼠体内诱导表达基因

为研究霍乱弧菌体内感染机制,寻找新的抗霍乱药物靶标和候选疫苗。以转座子上无启动子的kan-rpsL融合基因作为体内外双重抗生素报告基因,通过与霍乱弧菌埃尔托型C6706接合建立转座子突变库,经体内外各两轮筛选,获得对卡那霉素(Kan)体内抗性体外敏感、链霉素(Str)体外抗性体内敏感的突变株,即转座子插入位点上游包含了能够在体内被诱导激活的启动子。初步建立了筛选霍乱弧菌体内诱导表达基因的成年小鼠模型,最终获得5株阳性克隆。对转座子插入位点进行序列分析,分别为编码渗透敏感型钾离子通道组氨酸激酶的kdpD,谷氨酸合酶大亚基的gltB1,亮氨酰氨基肽酶的pepB以及核苷渗透酶的nupC。对kdpD基因融合lacZ报告基因进行表达调控研究,发现该基因在LB和霍乱毒素诱导培养基AKI中不能被诱导表达。以上结果表明霍乱弧菌通过调节氨基酸及核酸代谢,感知体内外环境来适应宿主体内环境的变化。     

Convergence of the secretory pathways for cholera toxin and the filamentous phage, CTXphi

Virulence of Vibrio cholerae depends on secretion of cholera toxin (CT), which is encoded within the genome of a filamentous phage, CTXphi. Release of CT is mediated by the extracellular protein secretion (eps) type II secretion system. Here, the outer membrane component of this system, EpsD, was shown to be required for secretion of the phage as well. Thus, EpsD plays a role both in pathogenicity and in horizontal transfer of a key virulence gene. Genomic analysis suggests that additional filamentous phages also exploit chromosome-encoded outer membrane channels.     

一株克氏原螯虾病原——霍乱弧菌的分离鉴定

从尾扇边缘溃烂的克氏原螯虾中分离到一株优势菌LK-18,并对该菌株进行种属鉴定和致病性分析。通过菌落形态观察、16S rRNA测序、血清型分析及基因特性鉴定对细菌的类别进行初步判断,并采用浸泡感染、肌肉注射和腹腔注射等方式进行人工感染实验对细菌的致病性进行评估。经16S rRNA测序分析和4个管家基因（atpA、pyrH、recA、gyrB）串联分析,该菌株最终被鉴定并命名为Vibrio cholerae LK-18。V. cholerae LK-18经PCR鉴定不属于O1和O139血清型,但含hly毒力基因和几丁质分解相关的几丁质酶（chitinase,Chi）基因。人工感染实验虽未能重现烂尾症状,但从克氏原螯虾烂尾组织中分离的V. cholerae LK-18具有致病性,能够引起克氏原螯虾的死亡。研究结果表明霍乱弧菌LK-18是一种致病菌,不仅扩大了非O1/O139群霍乱弧菌的感染宿主范围,同时预警霍乱弧菌有导致克氏原螯虾养殖业暴发疾病的可能,因此要提前做好该疾病的预防工作,从而避免霍乱弧菌感染带来的损失。     

棉花黄萎病菌VdTri15基因的功能验证及致病成因分析

为分析棉花黄萎病菌VdTri15基因的功能,利用基因同源重组原理将强致病力落叶型大丽轮枝菌Vd991菌株的VdTri15基因进行敲除。以Vd991菌株为对照,比较分析敲除突变体与野生型之间在生长速度、外分泌毒素、致病性等方面的差异,探讨VdTri15基因在致病过程中的功能。结果表明,VdTri15突变并不影响病菌的生长,但可引起其致病力减弱,分泌毒素种类发生改变。由此说明,VdTri15基因通过影响相关毒素的合成来影响大丽轮枝菌的致病力。     

Crystalline cholera toxin and toxoid

The exo-enterotoxin of Vibrio cholerae has been obtained in crystalline form. A solution of the crystalline protein was equal in potency to the parent pure toxin in both choleragenicity and skin reactivity. Crystals of the natural toxoid, choleragenoid, resemble those of the toxin in appearance. A solution of crystalline choleragenoid was equivalent to the parent preparation in the flocculation test.     

Small molecule-induced allosteric activation of the Vibrio cholerae RTX cysteine protease domain

Vibrio cholerae RTX (repeats in toxin) is an actin-disrupting toxin that is autoprocessed by an internal cysteine protease domain (CPD). The RTX CPD is efficiently activated by the eukaryote-specific small molecule inositol hexakisphosphate (InsP6), and we present the 2.1 angstrom structure of the RTX CPD in complex with InsP6. InsP6 binds to a conserved basic cleft that is distant from the protease active site. Biochemical and kinetic analyses of CPD mutants indicate that InsP6 binding induces an allosteric switch that leads to the autoprocessing and intracellular release of toxin-effector domains.     

Structural basis for the activation of cholera toxin by human ARF6-GTP

The Vibrio cholerae bacterium causes devastating diarrhea when it infects the human intestine. The key event is adenosine diphosphate (ADP)-ribosylation of the human signaling protein GSalpha, catalyzed by the cholera toxin A1 subunit (CTA1). This reaction is allosterically activated by human ADP-ribosylation factors (ARFs), a family of essential and ubiquitous G proteins. Crystal structures of a CTA1:ARF6-GTP (guanosine triphosphate) complex reveal that binding of the human activator elicits dramatic changes in CTA1 loop regions that allow nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to bind to the active site. The extensive toxin:ARF-GTP interface surface mimics ARF-GTP recognition of normal cellular protein partners, which suggests that the toxin has evolved to exploit promiscuous binding properties of ARFs.     

多重富集定量PCR(ME-qPCR)同时检测4种食源性病原弧菌

【目的】溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌是4种重要的食源性病原弧菌,能够造成人类多种疾病,建立同时检测这4种食源性病原弧菌的检测方法是保障食品安全的基础。本研究旨在建立同时检测溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌的多重富集定量PCR(multiplex enrichment quantitative PCR,ME-q PCR)方法,并含扩增内标用于指示PCR反应的假阴性,创新一种高通量、高灵敏度、具备定量能力的检测方法,为这4种食源性病原弧菌的检测提供新方法。【方法】以细菌16S r RNA为扩增内标靶序列设计引物,并针对副溶血弧菌的collagenase、溶藻弧菌的gyr B、霍乱弧菌的omp W、创伤弧菌的vvh A,分别设计内、外2对特异性引物,首先将所有内、外引物混合,进行一个循环数较少(10—20 cycles)的高通量多重富集PCR将靶基因富集出来,由于循环数较少,各个基因得到均匀的扩增,每个基因均有4种可能的产物,每1种产物均能作为第二轮巢氏荧光定量PCR的模板,这增加了靶基因从模板中被富集出来的概率,然后将产物稀释后作为模板,利用内引物分别进行巢式荧光定量PCR检测各个基因,最后根据扩增曲线和熔融曲线分析结果。通过设置不同的第一轮多重富集PCR循环数(10、15和20个循环),优化ME-q PCR第一轮循环数。采用14株标准菌株的基因组DNA作为模板,评价ME-q PCR的特异性。并以4种弧菌基因组DNA混合物梯度稀释的样品(100、10、1、0.1、0.01和0.001 ng·μL-1)作为模板,对建立的ME-q PCR进行灵敏度和定量能力的评价。并将该方法应用于已分离到的69株疑似弧菌菌落的鉴定中,与传统生理生化鉴定结果进行对比。【结果】优化后,ME-q PCR的第一轮循环数确定为15,特异性评价结果显示该方法特异性强,灵敏度达0.001 ng,高于普通荧光定量PCR约1个数量级,并能有效指示PCR反应的假阴性,且拥有与普通荧光定量PCR相同的定量能力,扩增效率和R2符合定量的要求;将建立的ME-q PCR方法应用于69株疑似弧菌菌株的鉴定,24个绿色菌落为副溶血弧菌,22个黄色菌落为溶藻弧菌,1个黄色菌落为创伤弧菌,没有检出霍乱弧菌,其结果与生理生化鉴定结果一致。【结论】该方法能够定量、快速准确地检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌这4种食源性病原弧菌,灵敏度高,并能有效指示PCR反应的假阴性,结果无需凝胶电泳,适用于食品中4种常见病原弧菌的快速筛检。     

中国小麦叶锈菌群体的毒性基因分析

 1986-1991年间，利用已知抗叶锈病基因的小麦近等基因系（或单基因系）作鉴别寄主，首次采用毒性基因频率、毒性因子（FV）、毒性值（VV）和Shannon-Wiener多样性指数等反映群体水平的参数，对我国小麦叶锈菌的毒性基因结构、频率、时间动态、空间格局及不同生理小种毒性基因的异质性等进行了比较分析。结果表明，毒性基因 V2a、V9、V15、V19、V24、V28、V29的出现频率较低（小于30%），其对应的抗性基因为目前我国小麦叶锈菌的有效抗病基因；V1、V3ka、V10、V26的频率处于升高的趋势，V2a、V15的频率有下降的趋势；不同地区叶锈菌群体的毒性因子、毒性值和毒性基因组合的多样性明显不同，我国和北美的叶锈菌至少存在4-5个毒性基因的差异；不同生理小种的毒性基因结构差异显著，叶中3号不具备V26基因，叶中34号不具有V1、V14a、V17和V27基因，而叶中4号携带有这些毒性基因。文中还对利用近等基因系作鉴别寄主的优点进行了讨论。     

Genomics happens

Cholera has been the scourge of humankind for centuries. Although most of the time Vibrio cholerae, the microbe that causes this disease, is a free-living organism inhabiting aquatic environments, it can invade human hosts causing severe diarrhea and often death. As DiRita explains in his Perspective, sequencing of the entire V. cholerae genome is revealing new facets of the pathogenesis of this dangerous microbe.     

北方四省小麦叶锈菌群体毒性基因及其频率、分布和组合研究

利用Ｂｒｏｗｄｅｒ和ｗｏｌｆｅ分别提出的毒力频率法比较了河北、山东、河南和陕西４省小麦叶锈菌群体毒性基因及其频率、分布和组合，为相应抗性基因及其组合的利用和布局提供依据。结果表明：Ｖ２ａ、Ｖ３ｃ等７个基因在４省的相对频率均在１４．７１％以下，属于稀少毒性基因；Ｖ２ｄ，Ｖ３ｃ等７个基因的频率均高于５０．９６％，属于优势毒性基因；Ｖ１１，Ｖ２０，Ｖ２７，和Ｖ３２的频率为１５．８７～４９．１５，属于中间类型；Ｖ１，Ｖ２ｂ等１１个毒性基因的频率在４省间则有较大的差异。各省应因地制宜地采用毒性基因频率较低的相应的抗性基因。在毒性基因组合方面，在６个优势毒性基因中，Ｖ３Ｒｇ，１０，１７，２３，２６和Ｖ３Ｂｇ１０，１４ａｂ，１７，２６在４省均为优势组合，频率均在９．６８％以上。     

PB2蛋白E627V突变可增强H7N9病毒对小鼠的致病力

【背景】低致病性H7N9病毒自2013年在我国首次出现以来,研究发现其对家禽均呈现低致病力,对哺乳动物模型小鼠也不表现任何的致病力。但是,2015年在湖南分离的1株低致病性H7N9病毒(简称HuN/S40726),却对哺乳动物小鼠表现为高致病力。分析、推测导致该病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。【目的】为了揭示该病毒致病力的变化原因以及对哺乳动物致病性增强的机制,提供人类H7N9病毒感染、危害增强风险预警,展开该研究。【方法】选取2013年低致病性H7N9病毒代表株(简称SH/S1053)和上述湖南HuN/S40726病毒,开展了哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析。然后以HuN/S40726病毒为模式毒株,利用反向遗传学技术,成功建立了病毒的反向遗传操作系统;利用基因点突变技术定点突变了HuN/S40726病毒PB2蛋白的627位氨基酸,救获了重组病毒r HuN/S40726、r HuN/S40726-PB2/627E和r HuN/S40726-PB2/627K。通过小鼠感染模型评估了以上3株重组突变病毒对哺乳动物的致病力,分析了PB2蛋白627位氨基酸的突变对小鼠致病力的差异。然后通过构建HuN/S40726病毒及其突变病毒的聚合酶复合表达质粒系统,以SH/S1053病毒为背景毒株构建聚合酶复合表达质粒系统作为对照,使用双荧光素酶法检测了PB2蛋白627位氨基酸的不同突变体在293T细胞中的聚合酶活性,进一步分析PB2蛋白627位氨基酸影响病毒毒力的内在机制。【结果】通过哺乳动物致病力对比试验以及可能导致病毒发生致病力变化的相关基因位点对比分析,推测导致HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力改变的原因可能在于该病毒PB2蛋白E627V的改变。重组救获病毒和突变株对小鼠致病性试验结果显示,PB2蛋白E627V的改变显著的增强了HuN/S40726病毒对小鼠的致病力,使得病毒MLD50由≥6.5 log10EID50变化为3.5 log10EID50,病毒毒力增强了至少1 000倍以上。聚合酶活性试验结果表明,无论是在33℃还是37℃下,PB2蛋白E627V的改变,显著提高了HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,与病毒对小鼠的致病性增强呈正相关性。【结论】PB2蛋白627位氨基酸(V)决定了HuN/S40726病毒对小鼠的高致病力。PB2蛋白E627V的改变能够显著增强HuN/S40726病毒在哺乳动物细胞中的聚合酶活性,是引起HuN/S40726病毒对哺乳动物致病力的重要因素。     

Separation of type 2 toxins of Vibrio cholerae

Choleragenic toxin was separated from vascular permeability factor by ion-exchange chromatography of supernatants of dialyzed peptone cultures of Vibrio cholerae. The choleragenic toxin eluted from columns of QAE-Sephadex with low-ionicity systems is free of permeability factor activity. Further elution of these columns with 0.5M NaCl removes both the permeability factor and residual choleragenic toxin. When this latter material is chromatographed on columns of carboxymethyl-Sephadex, the permeability factor toxin is eluted by 0.02M phosphate buffer and is free of choleragenic activity. Therefore, choleragenic and permeability factor activities of the type 2 cholera toxins are different and can be separated by these procedures.     

1993年中国对虾暴发性流行病细菌病原学研究

１９９３年中国对虾发生了暴发性流行病。自病虾体内分离出多株细菌，主要是弧菌属和微球菌属。感染实验表明弧菌毒力强，球菌毒力相对弱。未除菌病虾组织浆悬液组比除菌病虾组织浆悬液组死亡快，证明细菌尤其是弧菌可加速暴发性流行病病虾的死亡，１６种不同药物敏感试验结果表明细菌对目前常用抗生素敏感性显降低。     

Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae

The mosaic-structured Vibrio cholerae genome points to the importance of horizontal gene transfer (HGT) in the evolution of this human pathogen. We showed that V. cholerae can acquire new genetic material by natural transformation during growth on chitin, a biopolymer that is abundant in aquatic habitats (e.g., from crustacean exoskeletons), where it lives as an autochthonous microbe. Transformation competence was found to require a type IV pilus assembly complex, a putative DNA binding protein, and three convergent regulatory cascades, which are activated by chitin, increasing cell density, and nutrient limitation, a decline in growth rate, or stress.     

溶珊瑚弧菌hapR基因的敲除及功能研究

溶珊瑚弧菌(Vibrio coralliilyticus)是多种珊瑚的致病菌。hapR是弧菌群体感应系统核心的泛调控基因。前期实验中发现,溶珊瑚弧菌在感染佳丽鹿角珊瑚时,致病力与其接种密度密切相关,推测溶珊瑚弧菌的群体感应系统可能是调控其毒力的关键因子。笔者利用同源重组技术成功构建了溶珊瑚弧菌hapR缺失株△hapR-Vc450和回补株ChapR-Vc450,表型测试结果表明,hapR的缺失影响溶珊瑚弧菌的菌落形态,但不影响细菌的运动性和鞭毛结构;hapR缺失后,细菌最大生长量明显减少,但生物膜的形成量显著增加;用溶珊瑚弧菌人工感染鹿角珊瑚,结果显示,hapR缺失后菌株毒力增加,表明hapR在溶珊瑚弧菌中可能具有与霍乱弧菌hapR相似的功能,可以抑制毒力基因的级联激活。     

蜡蚧轮枝菌高产毒素菌株的筛选

通过比较6株蜡蚧轮枝菌(V3450、Vp28、V l6063、V0175、V342和V341)对烟粉虱3龄若虫的毒力和6株菌株代谢浓缩液对烟粉虱1龄若虫的忌避作用和毒杀作用,筛选出高产毒素菌株.结果表明:6株蜡蚧轮枝菌的LC50分别为2.57×105、6.03×105、6.03×105、1.70×106、7.41×106、1.66×107孢子.mL-1,表明菌株V3450、Vp28、V l6063的毒力比另外3株高;6株菌株代谢浓缩液对烟粉虱1龄若虫的忌避率分别为76.40%、78.22%、73.54%、52.7%、40.80%、53.33%,死亡率分别为80.27%、71.90%、66.66%、50.86%、40.57%、46.67%,表明菌株V3450、Vp28、V l6063的产毒能力比另外3株强,由此筛选出V3450、Vp28、V l6063为高产毒素菌株.     

2003-2004年我国小麦叶锈菌致病类型苗期鉴定及毒性分析

为明确小麦叶锈菌的毒性基因谱,对2003-2004采自我国的117株小麦叶锈菌菌株进行了致病性鉴定及毒性基因分析。结果表明:2003-2004年,117株小麦叶锈菌被划分为104个致病类型,其中优势类型为PHSS、PHTT和FHSS,其出现频率分别为4.27%、3.42%和2.56%。毒性基因V2 a、V9、V24、V3 a、V19、V38、V39、V40、V41、V42、V43和V46的毒性频率<30%,其对应的抗性基因为有效抗病基因,特别是V38的毒性频率为0,其对应的抗性基因有很好的抗叶锈性。V1、V3 ka、V30、V18、V14 ab、V15、V20、V21、V23、V28、V29、V32、V33+34、V36、V44和V45的毒性频率都在30%~60%之间,表明其对应的抗叶锈基因尚有一定的利用价值;V2 c、V3、V16、V26、V11、V17、VB、V10、V14 a、V2 b、V3 bg、V14 b、V25、V33、V34和VT3的毒性频率都>60%,表明其对应的抗叶锈基因在2003-2004年生产上单独使用几乎没有利用价值。     

水稻基腐病菌HrpX/HrpY在致病性中的功能分析

【目的】由Dickeya zeae引起的水稻基腐病是水稻上重要细菌病害之一,迄今对该病原细菌的致病性调控研究尚不完善。论文旨在分析水稻基腐病菌（Dickeya zeae）双组分调控系统HrpX/HrpY的序列特征,研究该系统在水稻基腐细菌中的功能作用以及与下游基因的调控关系。【方法】对HrpX/HrpY序列进行生物信息学分析,构建带有反向筛选标记基因scaB的自杀重组质粒pKNG-ΔhrpX和pKNG-ΔhrpY,通过三亲转化方法分别将重组质粒导入野生型菌株EC1中,通过2次等位基因同源重组筛选获得基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY;比较突变体与野生菌的生长速率、胞外酶活性、毒素活性、运动性、菌膜形成能力,以及对水稻的致病性和对烟草的过敏性反应（HR）;进一步提取细菌总RNA,采用实时荧光定量PCR研究HrpX/HrpY双组分系统对下游基因表达量的影响。【结果】水稻基腐病菌EC1基因组中,hrpX和hrpY均为单拷贝,hrpX编码区长1 473 bp,编码490个氨基酸,hrpY长642 bp,编码213个氨基酸,hrpX和hrpY两者之间相隔32 bp,具有相同的转录方向,在功能上具有相关性。其中,HrpX是一个结合在膜上的组氨酸蛋白激酶,HrpY是存在细胞质中的效应调节蛋白,HrpX/HrpY两者构成双组分系统,并对下游hrp基因的表达具有调控作用。进一步通过遗传操作手段,成功构建了基因缺失突变体ΔhrpX和ΔhrpY,表型测定结果表明,突变体ΔhrpX和ΔhrpY的运动性减弱、菌膜形成能力降低、对水稻种子萌发的抑制作用减弱,且降低了对水稻的致病力,但ΔhrpX和ΔhrpY的生长速率、胞外酶和毒素的活性变化不明显,也不影响其在烟草上的HR。实时荧光定量PCR结果显示,突变体菌株ΔhrpX和ΔhrpY相对野生菌EC1表达量明显下降的基因有hrpA、hrpF和hrpN,而对毒素合成基因zmsA表达量的差异不明显,HrpX/HrpY双组分系统对hrp基因簇中大部分下游基因都有正调控作用,且HrpY的调控作用更加明显。【结论】HrpX/HrpY是水稻基腐病细菌中的一个双组分系统,调节病原细菌的运动性、菌膜的形成和病菌的致病力,正向调控一些下游hrp基因的表达。     

稻瘟病菌粗毒素对水稻品种的毒性与产毒菌株致病力间的关系

分别用稻瘟病菌及其制备的粗毒素注射心叶和穗苞，结果表明，粗毒素对水稻叶部及穗部的毒性与产毒菌株对水稻的致病力基本相似．水稻品种与病菌小种之间的分化性互作，仅在个别品种与粗毒素的组合中表现出来．这种分化性互作是特殊情况还是较普遍存在的现象，仍然有必要进一步查明．粗毒素对水稻品种叶都与穗部毒性的一致性比病菌致病力的一致性更显著．