伯氏疏螺旋体TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法的建立及对新疆地区蜱的检测

为建立一种TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法,来快速、特异地检测伯氏疏螺旋体,根据GenBank发表的伯氏疏螺旋体16SrRNA序列,应用分子生物学软件进行比对,选取保守序列设计特异性引物及TaqMan-MGB探针,并优化荧光定量PCR反应体系及条件,分别对大肠杆菌、沙门氏菌及钩端螺旋体进行扩增;构建伯氏疏螺旋体标准株16SrRNA基因片段阳性质粒,10倍系列稀释后进行real-time PCR扩增,测定该方法的敏感性。结果可见:仅伯氏疏螺旋体出现阳性扩增,而大肠杆菌、沙门氏菌及钩端螺旋体扩增均为阴性;该方法对阳性质粒的检测限约为100 copies/μL。应用该方法对新疆地区的100份蜱DNA样本进行检测,发现7份为伯氏疏螺旋体阳性。结果表明,本研究建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法具有较高的特异性及良好的敏感性,为今后伯氏疏螺旋体的快速诊断及流行病学调查提供了技术支撑。     

莱姆病螺旋体感染对蜱的4个功能基因的转录影响

为探索蜱及蜱传病的防控新策略,了解病原与媒介硬蜱相互作用的分子机制,本研究以莱姆病病原伯氏疏螺旋体感染后对长角血蜱4个功能基因的转录影响进行了研究。将不同浓度梯度的伯氏疏螺旋体显微注射到长角血蜱体内,分不同的时间段提取蜱的总RNA,反转录成cDNA后,用实时荧光定量PCR检测蜱基因的表达水平。结果显示:伯氏疏螺旋体感染对蜱半胱氨酸蛋白酶抑制剂1(HLcyst-1)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂3(HLcyst-3)、卵泡抑素(FRP)、凝血酶抑制剂(Hemalin)4个功能基因的转录均产生了显著影响,但存在时间和剂量相关性,感染后第4天显著诱导了长角血蜱HLcyst-1基因的表达,抑制了Hemalin基因表达。     

吸血蓖子硬蜱成虫唾腺莱姆病螺旋体重度感染的发现

为了解莱姆病螺旋体在蜱体内的发育生物学,采用直接免疫荧光试验、银染色法组织学及电子显微镜观察螺旋体,结果显示,感染莱姆病螺旋体的饥饿蓖子硬蜱雌虫未吸血与吸血0．5和1天唾腺中无螺旋体。在吸血开始后2天出现唾腺的轻度感染,3天出现唾腺的中度感染,4天和5天出现重度感染。这些结果表明,莱姆病螺旋体媒介蜱唾腺的感染程度随吸血时间的延长而迅速增高,并可在缓慢吸血期的中后期形成重度感染。莱姆病螺旋体在吸血期媒介唾腺内的大量存在,特别是重度感染的发现,为该病原螺旋体由蟀向脊椎动物宿主传播的唾液分泌途径假设提供了有力证据。本研究对莱姆病螺旋体在吸血蟀唾腺内分裂增殖的可能性进行了讨论。     

蜱传性疾病--莱姆病螺旋体研究进展

莱姆病是一种蜱传性人兽共患病,在我国北方各省广泛流行,其病原体为伯氏疏螺旋体。莱姆病可使皮肤、心脏、关节和神经系统等多种组织器官受损。本文综述了莱姆病螺旋体的形态、种下分类、生化特征、传播媒介和贮存宿主等方面的研究进展"     

埃里希氏体病和莱姆病双重荧光定量PCR诊断方法的建立

埃里希氏体病及莱姆病均为由蜱传播的虫媒性传染病,为建立同时诊断埃里希氏体病和莱姆病的诊断方法,本研究选择埃里希氏体的groEL基因及伯氏疏螺旋体的ospA基因为检测对象,建立同时诊断埃里希氏体病和菜姆病的双重荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性、稳定性、与以往的普通PCR方法的一致性进行了研究.结果 显示,本方法仅...     

莱姆病诊断技术研究进展

莱姆病是一种经硬蜱传播的新发人畜共患病,可引起人类的慢性游走性红斑及心脏、神经、关节等多系统受损的疾病,造成病人不同程度的活动障碍和肢体瘫痪。该病在世界范围内广泛分布,我国许多地区是该病的自然疫源地。因此,莱姆病越来越引起人们的重视。伯氏疏螺旋体是引起莱姆病的病原体,因其培养周期长、抗原结构复杂给莱姆病的诊断带来了一定的困难。本文对莱姆病病原体的直接检测、免疫学检测、分子生物学检测和一些新的诊断技术进行了概述。     

莱姆病的现状及防治

莱姆病(lymedisease)亦称莱姆疏螺旋体病(lymeborreliosis),是20世纪70年代发现的以蜱作为传播媒介,由伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)感染所致的人畜共患传染病,其特征有慢性游走性红斑(ECA),同时伴随发热多汗、头疼、颈强直、肌疼、关节疼等症状。通过对该病的现状的分析,提出防治措施,开展有关疫苗的研究。     

采用PCR方法对我国蜱伯氏疏螺旋体感染的流行病学调查

通过调查我国已有的4种蜱伯氏疏螺旋体的感染情况,以进一步阐明莱姆病在中国的分布与流行状况。本研究通过筛选扩增伯氏疏螺旋体外膜蛋白A(OspA)基因片段的通用引物,获得1对特异性引物,优化反应条件后建立用于检测蜱体内伯氏疏螺旋体的PCR方法,其扩增片段大小为307 bp。该方法可检测出10 pg的阿氏疏螺旋体(Ba)、1 pg的伽氏疏螺旋体(Bg)和0.01 pg的狭义伯氏疏螺旋体(Bb)的3种不同基因型的伯氏疏螺旋体的OspA基因组DNA,表明其敏感性较好,适用于蜱感染伯氏疏螺旋体状况的调查。本研究从我国7个省采集到的667只蜱,进行伯氏疏螺旋体感染的流行病学调查,分类鉴定表明这些蜱分属革蜱属、血蜱属、牛蜱属和扇头蜱属。PCR检测所获数据表明它们的感染率分别为4%(10/264)、6%(11/137)、31.4%(59/185)和31%     

伯氏疏螺旋体鞭毛基因的PCR单链构象多态性分析

应用多聚酶链反应单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）技术分析了甘肃地区伯氏疏螺旋体和国际标准株Ｂ３１的鞭毛基因,发现甘肃不同宿主的２株伯氏疏螺旋体的鞭毛基因是一致的,属间一型螺旋体,而与Ｂ３１株明显不同,证明甘肃地区分离株与Ｂ３１株在鞭毛基因上不属同一型螺旋体。     

聚合酶链技术在莱姆病蜱传播途径研究中的应用

采用聚合酶链技术（ＰＣＲ）对采自甘肃省肃南县皇城区的草原革蜱进行了伯氏疏螺旋体传播途径的研究。结果，从３６组草原革的成蜱标梧检测到９组阳性一，阳性率为２５６．０％从３２组幼蜱中检测到７组阳性，阳经为２１．９％；从８组蜱卵中检测到２组阳性，阳性率为２５．０％；还从蜱叮咬的１４份羊皮肤红斑组织中检测到６是性，阳性率为４２．８％，从而证明 的革蜱是该地区莱姆病的传播媒介，既可水平传播，也可垂直传播。     

Detection of Invasive Borrelia burgdorferi Strains in North‐Eastern Piedmont,Italy

Following reports of human cases of Lyme borreliosis from the Ossola Valley, a mountainous area of Piemonte, north‐western Italy, the abundance and altitudinal distribution of ticks, and infection of these vectors with Borrelia burgdorferi sensu lato were evaluated. A total of 1662 host‐seeking Ixodes ricinus were collected by dragging from April to September 2011 at locations between 400 and 1450 m above sea level. Additional 104 I. ricinus were collected from 35 hunted wild animals (4 chamois, 8 roe deer, 23 red deer). Tick density, expressed as the number of ticks per 100 m², resulted highly variable among different areas, ranging from 0 to 105 larvae and from 0 to 22 nymphs. A sample of 352 ticks (327 from dragging and 25 from wild animals) was screened by a PCR assay targeting a fragment of the 16S rRNA gene of B. burgdorferi s.l. Positive samples were confirmed with a PCR assay specific for the 5S‐23S rRNA intergenic spacer region and sequenced. Four genospecies were found: B. afzelii (prevalence 4.0%), B. lusitaniae (4.0%), B. garinii (1.5%) and B. valaisiana (0.3%). Phylogenetic analysis based on the ospC gene showed that most of the Borrelia strains from pathogenic genospecies had the potential for human infection and for invasion of secondary body sites.     

实时荧光定量PCR检测猪细小病毒

根据已报道的猪细小病毒基因组序列,设计并合成了引物和探针,从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中提取DNA,经PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌JM109,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行PCR和测序鉴定,表明目的片段已经成功克隆.将104～108拷贝反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,系统自动分析软件显示Ct值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系.动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,标准曲线的灵敏度为102拷贝.本方法的建立为猪细小病毒感染的早期诊断奠定了基础.     

锡林郭勒盟草原莱姆病疫源地调查

本项研究于2000年5月—2001年5月从内蒙古锡林郭勒盟地区，不同草原景现带牛、羊体表和草地采集草原血蝉1800只，用直接荧光抗体法检查蜱带菌情况，带菌率为7.5%(6/80)。晴视野显微镜检查蜱带菌情况，带菌率为2%（2/100）；用间接荧光法进行血清流行病学调查，结果证实，调查点的牛和野鼠均存在莱姆病螺旋体感染，其感染率分别为10%和20%，都高于当地人群平均感染率（7.09%)，上述研究证实内蒙古锡林郭勒盟地区人畜及野生动物均有莱姆病螺旋体感染。     

Real-time PCR方法和PCR方法检测虾白斑综合征病毒

由白斑综合征病毒引起的虾白斑综合征是国际兽医局（OIE）规定的必须上报的水生动物二类疫病。本研究首先通过设计新的PCR引物，提高了PCR检测白斑综合征病毒的阳性检出率。为进一步提高白斑综合征病毒检测的灵敏度，本研究采用TaqMan探针技术建立了快速检测白斑综合征病毒的real-time PCR方法，通过与常规PCR方法比较，证实其检测灵敏度显著提高。     

基于TaqMan探针的Real-time PCR定量检测空肠弯曲杆菌

空肠弯曲杆菌 (Campylobacterjejuni ,C .jijuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态 (Viablebutnonculturable ,VNC) ,所以传统的生化鉴定结果并不一定可靠 ,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。在本文基于LightCycler为平台 ,建立一种基于TaqMan探针的Real_timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时 ,发现所有空肠弯曲杆菌 (11株 )都呈阳性 ,所有其它弯曲菌 (3株 )和其它菌株 (5株 )都是阴性。整个检测过程 6 0min内可以完成 ,检测限度为5CFU ,标准曲线的相关系数为 0 .988。结果表明荧光定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法 ,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

根据沙门菌保守的fimY基因序列设计合成了引物和TaqMan探针，建立了快速检测沙门菌的实时荧光定量方法，并对反应条件进行了优化，组装成快速检测试剂盒。通过对临床样品的检测，该试剂盒的检测灵敏度达4.5CFU（25μL反应体系），比常规PCR高100倍，而且稳定性良好，至少可以冷冻保存9个月。结果表明，所建立的沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，适于大量样品的检测。     

实时荧光PCR检测牛边缘无浆体方法的建立及应用

根据牛边缘无浆体表面蛋白4的保守基因序列设计特异引物AMOC9/AMOC5、AMOC10/AMOC12和特异性探针MP,首次建立了牛边缘无浆体的实时荧光PCR检测方法,检测DNA的最低限度为200 fg。对中央无浆体、绵羊无浆体、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、羊莫氏巴贝斯虫、山羊泰勒虫、温氏附红细胞体、东方巴贝斯虫、刚地弓形虫和伊氏锥虫进行检测,无荧光检测信号。本研究用所建立的方法检测采自江苏和哈尔滨的180份抗凝血（奶牛和肉牛）,其阳性率为8.9%。结果表明,建立的实时荧光PCR检测牛边缘无浆体的方法具有较高的特异性和敏感性,可用于牛边缘无浆体病的流行病学调查、检疫和监测。     

实时荧光定量PCR技术在生物饲料中的应用

生物饲料技术主要指通过微生物发酵,有效降解转化饲料中的抗营养因子,促进养分的消化吸收,分泌小肽、有机酸等功能物质,菌群演变是其重要内容。目前,发酵菌群的定量数据大多通过传统的依赖于培养的微生物学方法获得,由于其局限性,发酵饲料的微生物生态学尚未被很好地了解。因此,本文主要介绍了实时荧光定量PCR技术的原理和分类,综述了近年来实时荧光定量PCR技术在生物饲料研究领域中的应用及注意事项,为该领域的深入发展提供理论依据。