圆果黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1的克隆及利用反义载体转化拟南芥

以圆果黄麻(Corchorus capsularis L.)"179"茎部韧皮为材料,利用同源克隆和RACE技术,克隆黄麻纤维素合成酶基因CcCesA1 5′端500 bp序列外的全部cDNA。其序列长度为2529 bp,编码627氨基酸残基,经Blast基因比对和蛋白质结构分析,确定是黄麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析表明,CcCesA1在植株不同部位表达量具组织差异性,依次为茎部韧皮根叶顶芽麻骨。利用CcCesA1基因部分cDNA序列和3′UTR区,构建黄麻CcCesA1基因反义载体,用测序验证的阳性质粒转化模式植物拟南芥。Southern杂交结果表明,外源基因以单拷贝方式整合进入基因组,转基因拟南芥生长严重受阻,植株变得矮小且茎部易弯曲倒伏,角果数量变少,长度变短,纤维素含量有不同程度的降低,本研究结果表明,所克隆的黄麻CcCesA1基因除了参与植物其他生理代谢过程外,还参与纤维素的生物合成。     

GbTCP10基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

TCP转录因子广泛参与植物细胞生长和增殖调控,本研究构建海岛棉GbTCP10基因沉默和过量表达植物表达载体。以GbTCP10基因pGEM-T Easy-GbTCP10质粒为模板进行PCR扩增,连接至植物表达载体pCAMBIA3301中,再利用冻融法和热激法转到农杆菌GV3101菌株中,通过农杆菌浸染法转化拟南芥植株,初步证明已获得海岛棉GbTCP10基因的拟南芥。利用重叠PCR方法替换拟南芥At-MIR319的成熟链和互补链序列,构建含有amiRTCP10前体的植物表达载体amiRTCP10-pCAMBIA3301,本试验结果有助于进一步研究海岛棉GbTCP10基因的生物学功能和棉花纤维发育机制。     

粉葛查尔酮合成酶基因PtCHS的克隆与植物表达载体构建

查尔酮是植物体形成的一类次级代谢产物,在植物花色形成、育性及抵抗胁迫中发挥重要作用.前期研究发现粉葛与野葛中总黄酮的含量和葛根素的含量差异较大,而查尔酮合成酶是黄酮类化合物合成中的首个关键酶.为了研究野葛与粉葛中的查尔酮合成酶(CHS)基因是否存在差异性,利用同源克隆的方法,根据已报道的野葛(CHS基因序列设计引物,从...     

苎麻纤维素合成酶基因cDNA的克隆及表达分析

以苎麻 [Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.] 栽培种湘苎3号为材料, 通过简并引物RT-PCR结合RACE技术首次成功克隆苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1 5′端450 bp序列以外的全部cDNA 序列, 序列长3 276 bp, 编码一段938个氨基酸的蛋白质。经基因比对及蛋白质结构分析确证是苎麻纤维素合成酶基因。半定量RT-PCR分析显示：BnCesA1在苎麻根、茎、叶和芽组织中均有表达, 其表达量为茎＞叶＞芽＞根, 相对表达量依次为 0.791、0.381、0.319和0.183。从其表达模式可以推测该基因同时参与了苎麻细胞初生和次生细胞壁纤维素的合成。     

西葫芦种皮纤维素合成酶基因CpCesA的克隆及表达分析

裸仁西葫芦因其种皮退化无需脱壳而备受关注,纤维素是植物细胞壁的主要组成成分,是影响西葫芦种皮形成的重要因素,而纤维素合成酶(CES)在植物纤维素合成过程中起关键作用。为深入探究西葫芦CpCesA基因对种皮形成的调控机制,本研究通过克隆获得CpCesA的基因序列,利用生物信息学方法分析其结构和编码蛋白的理化性质。利用实时荧光定量PCR检测种皮不同发育时期和西葫芦不同组织部位CpCesA的表达模式。通过克隆获得CpCesA开放阅读框序列全长2 952 bp,生物信息学分析表明,其编码的蛋白质在葫芦科作物中有很强的保守性,且具有纤维素合成酶家族蛋白的保守结构域,属于质膜蛋白。实时荧光定量PCR结果显示：在种子发育过程中,Cp Ces A在裸仁西葫芦种皮中的表达量比有壳西葫芦普遍显著偏低,有壳西葫芦在授粉后10 d CpCesA表达量达到最高,而裸仁西葫芦则在授粉后20 d达到最高后开始下降。不同品种种皮发育相同时期、同一品种不同发育时期Cp CesA表达量表现均不同,这表明CpCesA与西葫芦种皮的发育和形成有着密切关系。组织表达分析表明,Cp CesA在两种西葫芦叶片、茎、根、花瓣等不同组...     

马尾松纤维素合成酶基因PmCesA1的克隆及其分析

植物纤维素合成酶(Ces A)是林木中纤维素合成过程中的重要酶,与木材形成密切相关。本研究以马尾松嫩枝的总RNA反转录得到的c DNA为模板,利用反转录PCR和RACE技术克隆得到马尾松Ces A1基因的全长c DNA序列,命名为Pm Ces A1。序列长度为3 142 bp,包含有一个长为2 955 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码984个氨基酸。序列分析表明:Pm Ces A1序列与已报道的火炬松(Pinus taeda)Ces A1基因(AY789650.1)的相似性达99%。对Pm Ces A1所编码蛋白的氨基酸序列聚类分析,结果显示马尾松与松科植物具有较近的亲缘关系。采用实时定量PCR测定了Pm Ces A1在马尾松的嫩枝、叶和根中的表达量,发现以嫩枝中的表达量最高(2.53)。本研究获得的全长基因可以用来构建正义表达载体,再通过遗传转化得到转基因植株,可进一步分析该基因在植株内的表达情况和作用机制,为马尾松纤维素合酶的研究和获得高纤维得率的马尾松良种提供帮助。     

富有柿果ACC合成酶基因RNA干扰植物表达载体的构建

分析克隆的柿果ACC合成酶基因的序列,根据其与表达载体pSMAK311上的酶切位点设计2对带酶切位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增柿果ACC合成酶基因片段。双酶切PCR回收产物以及表达载体,将酶切产物定向连接构建成反义表达载体;在此基础上构建该酶基因的shRNA表达载体,由此转录的mRNA因两端序列反向互补而成发夹式RNA,因此,可应用于RNA干扰研究。将所构建好的载体转化农杆菌EHA101用于后续的遗传转化研究。     

马蓝色氨酸合成酶基因的克隆、序列及表达分析

通过对马蓝转录组数据分析,从马蓝叶片cDNA中克隆得到了色氨酸合成酶基因完整的编码序列(CDS),长度为807 bp,命名为BcTSA(GenBank登录号:MG857654),可编码269个氨基酸,并对其蛋白质理化性质、结构域、跨膜区、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、编码蛋白的二、三级结构、亚细胞定位进行了分析。蛋白序列多重比对结果显示与其他植物的TSA蛋白序列具有一定的同源性,并通过qRT-PCR法检测BcTSA基因在不同器官的表达与外源激素茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)诱导表达情况。推测其编码的蛋白为亲水蛋白,相对分子质量为28.9 kD,理论等电点(pI)为5.65,无跨膜区;亚细胞定位分析结果显示,BcTSA定位在叶绿体中的可能性大,没有信号肽;有18个磷酸化位点,存在6个潜在的糖基化位点,二级结构主要由α-螺旋构成;BcTSA氨基酸序列与其它15种物种氨基酸序列的保守区域达到81.35%的相似性;BcTSA基因在马蓝不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,根中最低;另外,发现BcTSA基因响应外源诱导子对代谢的调控。BcTSA基因的克隆与序列分析,有助于研究BcTSA基因的功能,对提高马蓝有效成分的含量具有重要意义。     

AtTPS03基因RNA干扰载体的构建及拟南芥转化

本研究以拟南芥DNA为模板,将罗勒烯合成酶AtTPS03基因的一个目的片段克隆到T-载体上.对克隆片段测序后,进行Blast比对,结果目的片段的序列与GenBank上报道的序列同源性达到100%.根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向连到干扰载体pFGC5941查尔酮内含子的两侧,经限制性酶切和PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体P-2AT03.利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥.收获的种子在含草丁膦的培养基上筛选抗性苗,通过对抗性苗的PCR检测,已成功获得了12株转基因苗.这些转基因苗为进一步研究罗勒烯和罗勒烯合成酶的功能奠定了良好基础.     

Response to selection for plant height in X-ray treated population of jute (Corchorus capsularis L.) cv. JRC 212

Summary X irradiation of dry seeds of Corchorus capsularis L. cv. JRC 212 induced variations in plant height as evidenced by the high values of genotypic variance and heritability estimate in M₃ generation. Selection on the basis of line mean of plant height in M₃ generation was effective in increasing plant height as well as fibre yield in M₃ generation. A higher response for plant height rather than for fibre yield itself was observed in lower irradiation dose while responses for these two traits were almost similar in higher dose. An average of 12% increase in fibre yield was achieved in M₆ generation when all top five lines were selected. The top two lines, had 17% and 16% higher fibre yield than that of control.     

两种苎麻纤维素合酶基因cDNA序列的克隆及表达

从苎麻转录组数据出发, 利用Blast工具从中分析出与多种植物纤维素合酶高度相似的片段CL789和Unigene20360。根据片段信息设计特异性引物, 从苎麻[Boehmeria nivea (Linn.)Gaud.]栽培种湘苎3号中克隆纤维素合酶核心片段, 并利用5'及3'RACE技术获得2个片段的全长cDNA。两者都具有典型的纤维素合酶特征结构域, 表明为2个苎麻纤维素合酶基因CesA的cDNA序列, 分别命名为BnCesA2和BnCesA3。BnCesA2基因编码区全长度3240 bp, 编码1 079氨基酸多肽; BnCesA3基因编码区全长3120 bp, 编码1039氨基酸多肽。对BnCesA2和BnCesA3基因在湘苎1号、湘苎3号、湘潭大叶白和城步青麻苎麻品种木质部和韧皮部荧光定量PCR分析显示, 2个基因在不同品种苎麻的木质部及韧皮部都有表达, 但表达量存在着一定差异, 整体而言BnCesA2具有更高的表达水平, 其木质部和韧皮部的表达都为BnCesA3的2~5倍。推测BnCesA2和BnCesA3都参与了苎麻细胞壁的次生合成。     

苦瓜(Momordica charantiaL.)McGS1基因的克隆及结构预测

本研究以热研3号苦瓜总RNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得苦瓜谷氨酰胺合成酶基因,并命名为McGS1。生物信息学分析表明:苦瓜McGS1基因全长1 302 bp,其中CDS序列长度为1 071 bp,编码356个氨基酸;蛋白分子量为39.14 kD,等电点(pI)为5.49,元素组成为:C1751H2685N479O525S9,N末端主要为疏水性的氨基酸,而C端亲水性氨基酸较多;利用软件进行预测发现该蛋白没有跨膜区,说明它不是一个跨膜蛋白,同时发现该蛋白不存在信号肽;其蛋白质二级结构中,α-螺旋占28.37%,延伸链占17.42%,β-折叠占5.34%,无规则卷曲占48.88%;同源性比对发现苦瓜McGS1蛋白与甜瓜和黄瓜中的GS1蛋白亲缘关系最近,相似度分别达到了94.66%和95.22%。本研究结果可为进一步研究谷氨酰胺合成酶基因在苦瓜氮代谢中的调控作用提供理论参考。     

蛋白和核酸合抑制剂对氮素诱导甜菜谷氨酰胺合成酶基因表达的影响

谷氨酰胺合成酶(GS)家族是甜菜等高等植物体内氨态氮同化酶, 也是氮利用与循环的核心构件。为了揭示在氮素诱导下, 放线菌素D(AMD)和放线菌酮(CHM)对甜菜GS基因调控表达的影响。采用半定量RT-PCR技术, 对甜菜的胞液型谷氨酰胺合成酶基因(GS1)和质体型谷氨酰胺合成酶基因(GS2)进行mRNA的表达检测, 同时进行GS活性的测定。结果表明, 甜菜幼苗经过低浓度AMD处理2~6 h, GS活性略有增加, 9 h后, 高和低浓度AMD处理下的GS活性都下降, 且随着浓度的增加下降幅度加大, 同时GS1mRNA和GS2mRNA的相对量随浓度的增加而下降。CHM处理甜菜幼苗9 h后, 随着浓度的增加和处理时间的延长, GS活性下降幅度增加, 但GS1mRNA和GS2mRNA的相对量在不同CHM浓度处理间变化不显著。     

紫花苜蓿锌指蛋白基因RNAi表达载体的构建及在苜蓿的转化

根据紫花苜蓿锌指蛋白MsZFN基因(GenBank登录号为EU624138)序列,设计两对含有酶切位点的特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,分别合成用于构建干扰载体的正反义片段,将正反义片段分别插入表达载体pART27的相应位置,构建成含有发夹结构的RNAi载体pART-F-R。利用农杆菌介导方法,将pART-F-R转化到紫花苜蓿中,经过PCR检测,获得了3株转基因植株。经过RT-PCR检测,证明转基因植株中MsZFN基因表达量明显低于未转基因的植株。结果表明,已构建成功具有发夹结构的RNAi载体pART-F-R,它可有效的抑制紫花苜蓿MsZFN基因。     

油菜柠檬酸合酶基因的克隆及在逆境下的表达

柠檬酸合酶是植物多种代谢途径的限速酶, 及代谢变化的标志酶。为了解油菜柠檬酸合酶基因的生理功能, 以甘蓝型油菜叶片cDNA为模板, 设计特异性引物, 获得一编码柠檬酸合酶基因的cDNA序列, 全长1 659 bp, ORF区含476个氨基酸残基, 序列比对显示其蛋白序列与拟南芥有较高的同源性(96.0%), 氨基末端含一线粒体靶信号。聚类分析表明, 油菜柠檬酸合酶基因与其他植物内该基因高度同源。对油菜幼苗进行植物生长调节物质、高温和低温、强光照和弱光照、盐、菌核病、干旱和水渍等处理, 采用半定量PCR法对油菜叶片柠檬酸合酶基因的表达模式进行检测, 发现在盐胁迫、暗光和强光的处理下, 柠檬酸合酶基因的表达基本没有变化;在水渍、干旱、IAA和6-BA胁迫下, 其表达有所升高, 但出现峰值的时间不同, ABA对表达模式的影响与IAA相反;感染菌核病后其表达降低;对GA₃的应答呈鞍型。对部分处理采用荧光定量PCR验证, 其结果与半定量PCR结果基本一致。     

白菜型冬油菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的克隆、表达及其活性分析

抗坏血酸过氧化物酶(APX)是一种在逆境条件下清除细胞内氧自由基、增强植物抗逆性的关键酶。本研究根据已发表植物抗坏血酸过氧化物酶基因APX的同源保守序列设计引物, 采用RT-PCR扩增超强抗寒白菜型冬油菜陇油7号的DNA, 获得APX基因开放阅读框, 长度为753 bp, 编码250个氨基酸残基, 推导的氨基酸序列具有APX蛋白的典型特征。生物信息学分析显示, 与已报道的大白菜的APX氨基酸序列同源性达到99%, 该酶蛋白具有高度的进化保守性, 其保守序列属于植物的POD超家族, APX相对分子质量和理论等电点依次为27.7 kD和5.58;APX基因无信号肽, 是一个亲水性蛋白, 可推测其定位于细胞质中;二级结构预测表明陇油7号的APX是由不规则卷曲和α-螺旋组成的稳定蛋白。实时荧光定量PCR和酶活性分析显示, 该基因表达和酶活性受低温胁迫诱导, 表明该基因在白菜型冬油菜陇油7号适应低温胁迫过程中发挥重要作用。     

大豆谷氨酰胺合成酶基因的分类及根瘤特异表达GmGS1β2基因功能的初步分析

从Phytozome数据库中获得包括大豆在内的12种植物的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)氨基酸序列,利用MEGA5.10软件进行多序列比对、构建进化树。进化分析表明,植物GS可以分成胞质型(GS1)和质体型(GS2)两大类,GS1可进一步分成分5个亚类,包括双子叶植物为主的I、II和III亚类、低等植物类(IV)和单子叶植物类(V)。这5亚类中,第II类是豆科植物特有的一类,大豆的4个GS1 (GmGS1β1/2和GmGS1γ1/2)属于该亚类;利用qPCR在大豆盛花期分析GS1基因的组织表达特异性,结果表明不同类型GmGS1基因在表达部位和表达丰度上存在较大差异,而同一类基因之间具有相似的表达规律;4个豆科植物特有的GS1基因在大豆根瘤中都有较高的表达量,其中位于大豆第18染色体上的GmGS1β2基因表达丰度最高;利用原核表达系统体外表达GmGS1β2蛋白,诱导出分子量大小与理论预测值一致的目标蛋白,酶活性分析表明GmGS1β2可以与底物发生催化反应,具有谷氨酰胺合成酶活性,推测该基因在大豆根瘤氮素同化代谢中具有重要作用。     

紫花苜蓿G6PDH基因的克隆与超表达载体构建

为了研究G6PDH在紫花苜蓿抗低温胁迫中的作用,以‘青大1号’紫花苜蓿为材料,利用基因克隆、RACE技术获取‘青大1号’紫花苜蓿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)基因,并进行生物学信息分析和超表达载体的构建。结果显示,成功克隆了一个紫花苜蓿G6PDH基因,该基因c DNA全长2 260 bp,含有1个长度为1 752 bp的开放阅读框,编码583个氨基酸。MsG6PDH与鹰嘴豆、大豆、羽扇豆等序列一致性达到88%以上;在进化上,Ms G6PDH与同为豆科植物的绿豆、野大豆、大豆亲缘关系最近。经预测,Ms G6PDH蛋白二级结构中,α-螺旋占37.91%,β-折叠占5.66%,无规则卷曲占40.31%,并预测得到其三级结构。分析MsG6PDH编码的氨基酸序列得知,Ms G6PDH蛋白分子量为65.71 k D;理论等电点为8.25;不稳定系数为44.54,为不稳定蛋白,并且属于亲水性蛋白。此外,还同时成功构建了该基因的植物超表达载体pPZPY112-MsG6PDH。本研究将为明确G6PDH在紫花苜蓿响应低温的信号转导途径中的作用提供理论依据。     

甘蓝型油菜含MATH结构域基因BnMT-1干扰载体的构建及遗传转化

本研究以甘蓝型油菜湘油15种子不同发育时期抑制差减文库为研究对象,设计特异性引物扩增得到一个与油脂代谢相关,含MATH结构域的基因片段,长度为327bp,命名为BnMT-1。根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向插入到表达载体pFGC5941.nap查尔酮内含子两侧,经限制性内切酶酶切和质粒PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体PP-MT。采用根癌农杆菌法将PP-MT干扰载体转入甘蓝型油菜中,对转化植株基因组DNA的PCR检测表明,干扰载体已转入到甘蓝型油菜中,共获得了两株转基因植株。这为进一步研究BnMT-1基因在甘蓝型油菜中的功能打下了基础。