烟草绒毡层特异启动子pTA29在棉花中的表达特性

烟草绒毡层特异启动子pTA29 (TA29 promoter)已用于多种植物雄性不育和花粉发育的研究。作为外源特异表达启动子pTA29在棉花中的表达特性尚不清楚,为了研究该启动子在棉花中的表达特异性,本文构建了pTA29:gus融合基因,并将其转入棉花。研究发现在GUS染液中添加10%的乙醇可以抑制棉花花药内源GUS活性。用改良的GUS染液进行组织化学染色表明,pTA29:gus转化植株的GUS活性主要存在于花药中,并在花蕾长为6 mm和15 mm的花药中有2个活性高峰,而在根、茎、胚珠、花瓣、苞叶中未被检测到。与烟草不同,在pTA29:gus棉花转化植株的叶片表皮毛和花粉中也能检测到GUS活性。定量RT-PCR分析表明转化子中gus基因的转录水平与GUS活性一致。上述结果表明,烟草绒毡层特异启动子pTA29可以控制下游基因在棉花花药中优势表达;在利用该启动子进行棉花基因功能以及雄性不育研究时,应注意该启动子在棉花中的表达范围和组织特异性。     

一个棉花纤维伸长期优势表达启动子pGhFLA1的克隆与鉴定

棉花纤维是研究单细胞生长发育的良好模式细胞,寻找在棉花纤维发育时期优势表达的启动子,对于棉花纤维发育的功能基因组研究非常重要。本试验对发掘到的一个在纤维伸长期优势表达基因GhFLA1的启动子进行克隆,并将该启动子融合GUS转化棉花和烟草。转基因棉花的GUS蛋白染色表明,在0~20 DPA(days post anthesis)的纤维中检测到GUS蛋白,同时在柱头、雄蕊、萼片、胚根、子叶和根中也检测到GUS蛋白,但在花瓣、叶片和苞叶中没有检测到。同时GUS定量检测结果显示,pGhFLA1驱动GUS蛋白积累的高峰是在20 DPA的纤维中,其驱动GUS表达的能力是Ca MV 35S::GUS的22倍。转基因烟草组织化学染色显示pGhFLA1可以驱动GUS在叶片及叶片的表皮毛中优势表达,同时在子房、柱头、花药、苞叶、花柄基部、花瓣、种子等生殖器官上也存在GUS蛋白。启动子pGhFLA1在棉花纤维和烟草叶片的表皮毛中优势表达,可用于棉花纤维功能基因组研究,在改良纤维品质育种中具有潜在的应用价值。     

35S启动子甲基化引起棉花转基因沉默

 用带PBI121质粒的农杆菌LBA4404菌株转化泗棉3号胚性愈伤组织,获得的再生植株进一步对gus和nptⅡ基因进行PCR跟踪检测,共得到97株阳性转基因植株。GUS组织化学检测发现,97株转基因幼苗中有10株GUS检测阴性,嫁接后,只成活一株。利用来源于同一愈伤系的GUS检测阳性植株作为对照,对这一GUS检测阴性的植株进行gus基因沉默机理研究。Southern分析表明,该GUS检测阴性植株与GUS检测阳性植株有相同拷贝数。GUS组织化学检测和RT-PCR分析显示,gus基因在GUS检测阴性植株中没有表达,而nptⅡ基因在这两株转基因棉花中都表达。用限制性内切酶-PCR法分析35S启动子区甲基化发现：GUS检测阴性植株35S启动子区TATA box的HapII/MspI酶切位点发生甲基化,而GUS检测阳性植株该位点没有甲基化。以上研究表明,这株gus沉默的转基因棉花可能是由于其35S启动子区甲基化引起的。     

中棉(Gossypium arboreum)光锈导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var. jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能。为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus (uid A)基因融合,构建植物表达载体。用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草。GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,Gacab P驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达。GUS定量分析表明,–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍。上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且–504 ~ –1 bp的启动子缺失体启动活性最高。     

中棉(Gossypium arboreum)光诱导基因Gacab启动子在转基因烟草中的功能缺失分析

分离了金华中棉(Gossypiun arboreum var.jinhua)光诱导基因cab 5'上游的调控序列1 009 bp,并对其功能进行了分析,证明获得的这一DNA片段具有驱动光诱导表达的功能.为了进一步分离具有最大转录活性的最小光诱导启动子,根据光诱导表达调控元件所在的位置,构建了Gacab P和197 bp、504 bp、779 bp的5'端缺失体,并将这些缺失体分别与gus(uid A)基因融合,构建植物表达载体.用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草.GUS组织化学分析表明,转基因烟草的T1代种子在光下培养时,只有Gacab P驱动gus基因在转基因烟草的叶片表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达;当转基因烟草的T1代种子在暗中萌发及培养时,GacabP驱动gus基因在转基因烟草中无表达,其他3个启动子驱动gus基因在转基因烟草的整个植株中均有表达.GUS定量分析表明,-504～-1 bp的启动子缺失体启动活性最高,比CaMV35S启动子高0.6倍.上述结果表明只有全长的Gacab启动子具有光诱导和绿色组织特异表达特性,且-504～-1 bp的启动子缺失体启动活性最高.     

浮萍rbcS启动子组织特性研究

SSU5C启动子(全长1 438 bp)是从浮萍基因组中新克隆的一个rbc S(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase small subunit)启动子。本研究将SSU5C启动子与GUS基因融合,成功构建植物双元表达载p SSU5C-IGUS,并利用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因植株,探究SSU5C启动子在烟草中的组织表达特点。GUS检测结果表明:在T1烟草的营养器官中,SSU5C启动子主要驱动GUS基因在烟草叶片和叶柄、茎等绿色组织中表达,而在根部不表达;在生殖器官中,GUS基因主要在花冠裂片以及花药和柱头中表达。本研究首次发现浮萍rbc S启动子不仅在绿色组织中表达,而且在生殖器官中的花冠裂片以及花药和柱头中表达,这一发现可为SSU5C启动子在植物基因工程中的应用奠定基础。     

陆地棉GhRACK1启动子的克隆与缺失分析

在基因工程发展中,有应用前景的纤维特异表达启动子的缺乏是制约棉花纤维品质改良的主要因素之一。本研究利用反向PCR的方法克隆到陆地棉纤维优势表达基因GhRACK1的上游启动子GhRACK1-P。GhRACK1-P全长为1987 bp,含有TATA-box、CAAT-box、MYB2和I-box等顺式作用因子和调控元件。根据调控元件的分布对GhRACK1-P进行不同程度的缺失,获得了p1、p2、p3和p4缺失体;构建不同缺失体和全长GhRACK1-P的植物表达载体并通过农杆菌介导法导入烟草,获得不同类型转基因烟草。GUS组织化学染色结果表明,全长启动子GhRACK1-P只能驱动gus基因在转基因烟草的幼根及根毛中表达,其它缺失体驱动gus基因在转基因烟草的花粉、叶片和根中表达,为组成型表达启动子。由于根毛与棉花纤维具有相似的发育机理,推测全长GhRACK1-P可能为纤维优势表达启动子。研究结果为棉花纤维品质改良基因工程提供了新的调控元件。     

拟南芥AT2G14260基因功能及其表达特异性分析

拟南芥AT2G14260基因编码脯氨酸亚氨基肽酶，基因芯片表达谱数据显示该基因响应高盐、低温等非生物胁迫。为研究其功能和表达特性，本研究采用野生型和突变体植株pip-1进行低温、干旱和盐胁迫处理，结果显示在正常培养基中野生型与pip-1植株表型没有区别。而在逆境处理下pip-1植株的根比野生型明显短，且在干旱胁迫下，突变体的叶子比野生型植株明显变黄萎蔫。在正常环境、冷、干旱、盐胁迫下，野生型植株脯氨酸含量的平均值分别是突变体的1.11、1.23、1.10和1.34倍，这说明AT2G14260基因对提高非生物胁迫的耐性具有一定的作用。同时分离了该基因的启动子，构建了表达GUS基因的载体并转化拟南芥，结果表明该启动子在正常环境中不表达。胁迫处理时从两叶期开始在根、叶、茎中表达，到达花期后，干旱处理下的花瓣、花枝和冷处理下的花柱头中也有表达。GUS相对活性试验也证明对胁迫的响应能力。可见AT2G14260基因启动子是逆境胁迫诱导表达启动子，同时具有组织表达特异性，因此，AT2G14260基因及其启动子在转基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

棉花GhRDL1基因启动子分析

通过PCR法扩增出陆地棉GhRDL1基因ATG上游1.2 kb的片段,将该片段融合GUS报告基因进行棉花、拟南芥及烟草转化。分析显示,GhRDL1基因启动子是一个棉纤维或表皮毛特异的启动子,能够驱动靶基因在单细胞的表皮毛(如棉纤维和拟南芥表皮毛)表达;在烟草表皮毛中,GUS基因在多细胞的腺毛(包括顶端的腺体细胞和柄细胞)和非腺毛中皆有表达。表明GhRDL1基因启动子是一个多功能的表皮毛特异启动子,可以用于棉花基因工程改良和植物次生代谢工程的研究。     

拟南芥热激启动子AtHSP70b的克隆与功能分析

从拟南芥Columbia生态型(Arabidopsis thaliana)的基因组DNA中扩增出热激启动子AtHSP70b基因,并检测其热激表达的严谨性。将热激启动子AtHSP70b插入到pSAU2008的gus基因及NOS终止子上游,构成热激启动子控制GUS报告基因的表达盒“AtHSP70b-GUS-Tnos”,并将其插入到pVCT2020中得到表达载体pV-HSP70bGUS。通过冻融法将其导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404,并转化烟草(W38)获得再生植株,通过PCR检测鉴定,表明“AtHSP70b-GUS-Tnos”表达盒已整合到烟草基因组中。并转化烟草检测启动子的表达活性。序列分析表明,克隆的启动子长度204bp与目前已经发表的启动子序列完全一致。GUS组织化学法检测证明启动子AtHSP70b在烟草中具有高温诱导表达的能力。但在常温下也有不同程度的表达,因此需要对该启动子进行序列改造以增强其热激表达的严谨性。     

Agrobacterium-mediated genetic transformation and production of semilooper resistant transgenic castor (Ricinus communis L.)

Summary Semilooper resistant transgenic castor plants were produced through Agrobacterium-mediated genetic transformation method. Two castor cultivars, Jyothi and VP1 were transformed using the super-binary vector pTOK233 carrying gus A and hpt genes. Putative transformants were regenerated following selection on the hygromycin containing medium. GUS positive primary transformants, when subjected to Southern analysis, revealed stable integration of gus A into their genomes. In the T₁ generation, a monogenic segregation ratio of 3 GUS positive: 1 GUS negative plants was observed. Furthermore, transformation experiments were carried out with the Agrobacterium pSB111 super-binary vector carrying a synthetic delta endotoxin gene cryIAb and the herbicide resistance gene bar both driven by cauliflower mosaic virus 35S promoter. Putative transformants were regenerated through selection on the phosphinothricin containing medium and Basta tolerant transformants were subjected to molecular analysis. PCR analysis revealed the presence of both bar and cryIAb genes in the Basta tolerant primary transformants. Southern analysis of PCR positive plants with cryIAb probe showed a 3 Kb band upon HindIII digestion and a > 6 Kb band with BamHI digestion, thus suggesting stable integration of cryIAb intact expression cassette and independent nature of the transformants. The primary transformants subjected to ELISA disclosed varied levels of Cry protein. These transgenics expressing cryIAb – when bioassayed against freshly hatched semilooper larvae – induced substantial (> 88%) insect mortality. Southern analysis of 2T₁ plants revealed the presence of cryIAb gene, indicating stable inheritance of the transgene into the next generation. In T₁, all the Southern-positive plants for cryIAb invariably exhibited tolerance to Basta, denoting co-segregation of both bar and cryIAb genes. Transgenics, expressing cryIAb exhibited ample resistance against the castor semilooper.     

受多逆境诱导表达的GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析

WRKY蛋白属于锌指型转录调控因子,参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,克隆Gh WRKY64(KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列,并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,该区域含18个组织器官表达及诱导表达关键元件,分别为6个ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件,4个CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个OSE2ROOTNODULE病菌诱导元件、2个GTIGMSCAM4盐调控元件和2个W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与GUS基因融合,构建p BIW64:GUS植物表达载体,通过农杆菌介导叶盘转化法获得12个转基因烟草株系。选择GUS表达量最高的p BIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。GUS组织化学染色显示,苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有GUS活性,开花期在转基因烟草植株根、叶及叶柄均检测到GUS活性,特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深,在茎和花组织上未检测到GUS活性。对该转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理,诱导48 h后,转基因烟草幼苗根和叶片的GUS染色比未诱导处理的对照明显加深。结果表明,Gh WRKY64上游1064 bp长度的DNA序列,具有启动子的相关顺式作用元件,且为病原菌诱导型启动子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。     

蛋白激发子基因pemG1转化三生烟中及其对TMV抗性的提高

通过根癌农杆菌(Agrobactrium tumefaciens)介导转化法,将含有稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的植物表达载体pCAMBIA2300-Ubi-pemG1-Ocs转化三生烟(Nicotiana tobacum cv. Samsun NN),获得了转基因植株。用PCR检测抗卡那霉素烟苗确认阳性转化株,用Southern、Northern和Western杂交进一步证实了pemG1基因的整合、转录和表达。对T2代转基因阳性株进行烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus)接种试验。接种5 d后发现,与非转基因对照相比,表达pemG1的烟草叶片枯斑数量减少,表明稻瘟菌蛋白激发子基因pemG1的表达提高了转基因烟草对TMV的抗性。     

哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系orf160的克隆及遗传转化

以哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系及其保持系、恢复系为材料,克隆并测序线粒体功能基因的侧翼序列。通过生物信息学分析,在atp4下游发现一个哈克尼西棉细胞质不育系特有的orf160。orf160全长480 bp,N端与atp6序列部分同源,C端序列与核序列部分同源;编码的159个氨基酸序列,与膜蛋白、细胞周期蛋白具有部分同源性。以含有线粒体导肽的GFP瞬时表达载体转化后,在洋葱表皮的细胞膜上观察到绿色荧光,表明线粒体定向载体正常表达。构建酵母和植物表达载体,分别转化酵母、烟草和拟南芥;同对照相比,转基因酵母菌斑畸形且生长缓慢;转基因拟南芥和烟草种子大部分畸形,T₁和T₂代植株的结实率和种子发芽率降低,花粉着色比野生型浅。结果表明,orf160基因的表达影响受体正常发育。     

rd29A启动子的克隆及提高烟草抗逆性的研究

根据GenBank上公布的rd29A基因序列(D13044),利用PCR方法从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA中扩增得到了rd29A基因的启动子片段.序列分析表明,该片段与D13044有99%的同源性,它包括了DRE等4种完整的顺式作用元件.与GUS基因融合构建双元植物表达载体pBI-rd.转基因烟草的GUS活性组织染色分析及Northern杂交分析均表明,3种胁迫处理均可诱导GUS基因大量表达.其中,15%PEG和0.5%NaCl胁迫处理的转基因烟草比0℃低温处理的转基因烟草的GUS表达量高,而未经胁迫处理的转基因烟草的GUS基因只有少量表达.这些结果表明,rd29A属胁迫诱导型启动子,当植物遭受逆境胁迫时,rd29A启动子可以驱动下游目的基因超量表达,这就为通过基因工程途径提高植物抗逆性奠定了基础.