里氏木霉Trichoderma reesei固定化细胞酶液水解辐射预处理稻麦秸秆的研究

用1×10~5、3×10~5、5×10~5和10×10~5 Gy的电子束和电子束加4％NaOH复合预处理稻麦秸秆。预处理稻秆200目以上粉末随辐照剂量的增加而增中。用1％纤维素酶水解电子束预处理稻麦秸秆48小时,葡萄糖得率随辐照剂量的增加而增加,10×10~5 Gy照射的比未预处理的增加了70％—80％;而复合预处理稻麦秸秆的葡萄糖得率在5×10~5 Gy以内,随辐射剂量增加而增加,分别为36％和35％,比未处理的10.2％增加了约2.5倍,而用10×10~5 Gy的反而下降。通过辐射聚合在纱布表面覆盖高分子poly(HEA)、poly(HEMA)、poly(HPMA)、poly(A-4G)和poly(A-TMPT),并以此作为固定化里氏木霉细胞的载体。这些载体均能较好地固定化里氏木霉细胞,固定化细胞的滤纸活性(FPA)均高于游离细胞,其中覆盖poly(HPMA)的载体固定化细胞的效果最好,FPA为3.5U/ml,比游离细胞增加了近40％。用这些固定化细胞的酶液水解NaOH和电子束复合预处理的稻麦秸秆,其葡萄糖得率随辐照剂量和水解时间的增加而增加,其中4％NaOH和10×10~5 Gy处理的稻麦秸秆第6天的葡萄糖得率为19％和22％。     

绿色木霉的原生质体制备与转化条件

对绿色木霉(Trichoderma viride)原生质体制备和再生的条件进行了较详细的分析,并在此基础上进行了木霉的转化.结果表明,木霉原生质体形成的合适条件为培养24 h的菌丝用4 mg/mL的Glucanex在磷酸盐缓冲液中(pH 6.98)、30℃、振荡(40 r/min)酶解4 h,原生质体产量达到4.7×107个/mg.原生质体在0.3 mol/L肌醇和0.3 mol/L KCl的CM培养基上再生率为14.5%.对绿色木霉原生质体的激发子基因转化,其转化率为每微克DNA得到1～2个转化子.转化子的PCR鉴定以及激发子抗体的特异酶联免疫测定(ELISA)结果,表明外源基因已转入绿色木霉并有稳定产物表达.     

绿色木霉T206产纤维素酶特性与酶促动力学研究

对分离自霉变玉米穗的产纤维素酶绿色木霉(Trichoderma Viride)T206进行产酶条件、酶学性质及酶促动力学特性研究.结果表明:T206菌株在1%羧甲基纤维素钠为碳源、0.3%蛋白胨和0.2%NH4NO3为氮源,起始pH值为5.0、接种量为6%,28℃培养4 d的条件下产酶量最高.该酶热稳定性强,热变温度为60～80℃,反应的最适温度为50℃,最适pH值为4.5.     

绿色木霉复配有机肥的筛选及对黄瓜枯萎病的防治作用

单独应用绿色木霉控制蔬菜土传病害效果不理想,探索筛选适合的有机肥与绿色木霉复配,达到提高生防菌防病作用的目的。从供试的7种有机肥中,筛选出菇渣和牛粪适合与木霉菌复配。菇渣和牛粪的提取液对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制率分别为74.91%和69.38%,对绿色木霉菌丝生长抑制率分别为-7.90%(促进作用)和4.94%,使黄瓜种子胚根伸长增长率分别为36.75%和28.21%。菇渣、牛粪分别与绿色木霉混合后对黄瓜枯萎病的防效分别为64.98%和63.32%。菇渣和牛粪按1:1混合后再与绿色木霉复配制成菇渣、牛粪木霉有机肥的防效高达85.31%,黄瓜地上部分鲜重和地下部分鲜重分别增加了71.50%和79.55%。菇渣和牛粪与绿色木霉复配可显著提高木霉对黄瓜枯萎病的防病效果和对黄瓜生长的促进作用。     

稀释接种法和二次发酵法制备的绿色木霉生物有机肥肥料效应比较研究

生物有机肥中的功能性微生物是生物有机肥肥效的核心,生物有机肥的制造工艺决定了功能性微生物的数量和应用效果,绿色木霉兼具的促生和生防功能现已被广泛应用于生物有机肥的制备中。分别采用稀释接种法和二次发酵法在不同腐熟度(种子发芽指数GI值为50%、80%、100%)的堆肥物料接种绿色木霉制备生物有机肥,采用盆栽试验,研究两种工艺类型的生物有机肥在辣椒根系定殖能力及其对辣椒疫病的防控作用。结果发现,施用生物有机肥24 d后,经过二次发酵法生产的生物有机肥(分别在堆肥物料GI值为50%、80%和100%时接种绿色木霉进行二次发酵生产的生物有机肥)的绿色木霉在辣椒植株根系定殖量分别为1.5×105、2.3×105和1.02×105 CFU/g,按照稀释接种法生产的生物有机肥(分别在堆肥物料GI值为50%、80%和100%时,按照稀释倍数接种绿色木霉生产的生物有机肥)的绿色木霉定殖量分别为0.29×105、0.72×105和0.24×105 CFU/g;在GI值为80%的堆肥物料条件接种绿色木霉,经过二次发酵生产的生物有机肥,绿色木霉在辣椒根际定殖能力最强;经过二次发酵的生物有机肥处理的辣椒疫病防治效果显著高于按照稀释倍数接种绿色木霉制成的生物有机肥处理,且以GI值为80%的堆肥物料条件生产的生物有机肥的辣椒疫病防治效果最好。研究结果发现,以GI值为80%的堆肥物料接种绿色木霉后,采用二次发酵方式生产的生物有机肥,7 d后的绿色木霉菌增殖量为3.91倍,表现出功能性微生物最好的增殖和定殖效果。综上所述,在制备绿色木霉生物有机肥时的最佳方法是在腐熟度为80%的堆肥物料中接种绿色木霉进行二次发酵,可以提高绿色木霉的定殖效果,也可以提升绿色木霉生物有机肥的抗病效果。     

绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因的定点突变及酶学性质的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGⅠ基因eg1亚克隆到表达载体pSE380,构建出重组质粒pSE380-eg1,转化到大肠杆菌JM109中表达,利用金属亲和层析对EGI进行纯化,纯化后的酶比活力达到3.8U/mg,其最适反应温度为48℃,最适pH为5.2。同时对EGⅠ的氨基酸残基G291位进行随机定点突变,筛选到一株突变酶G291S,其比活力为野生酶的2.2倍,Km值为野生酶的0.66倍,最适反应温度和最适反应pH值未发生改变。     

一种绿色木霉纤维素内切酶基因的克隆及其定点突变对酶活力的影响

纤维素资源是地球上最丰富的可再生资源,纤维素酶的酶活力和生产成本制约着纤维素的利用.本研究从多年户外放置的朽木(Populus bonatii)中分离出一株真菌G-1,经18S rDNA序列分析鉴定为绿色木霉(Trichoderma viride).从G-1中分离出一种纤维素内切酶基因(endoglucanase,EG;GenBank登录号:HM116999.1).通过重叠引物延伸法对EG进行定点突变,得到一个突变序列EG-mut,将EG和EG-mut分别插入分泌型表达载体pPIC9K,并导入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris),筛选到两个菌株,经刚果红染色和DNS法对酶活性测定,显示其内切酶的活性分别达到20.915 U/mL和24.110 U/mL,酶活力高于本实验中得到的其它重组菌株.结果表明某些定点突变可以揭示影响酶活的重要功能域.     

哈茨木霉A25-2纤维二糖水解酶I基因的克隆及其编码催化功能域的序列在绿色木酶HP35-3中的表达

本研究从哈茨木霉（rrichoderma harzianMm）A25—2总RNA中利用RT—PCR的方法扩增到其纤维二糖水解酶I基因的cDNA序列,并对该基因编码的氨基酸序列进行分析,得到cbhI基因中编码催化功能域的序列。将催化功能域编码序列克隆到表达载体pCP—GH中,用PEG—CaCl2介导的原生质体转化方法将重组质粒转化到绿色木霉（Trichoderma viride）HP35—3中,筛选得到12个转化子。以P-NPC为底物,测定了该12个转化子的酶活力,获得比活力最高的转化子Tv／CDHI-CBM-5,其纤维二糖水解酶活力是HP35—3的3．8倍。SDS—PAGE分析表明,绿色木霉表达了导入的含A25—2纤维二糖水解酶I催化功能域的编码序列。     

~(60)Co辐照诱变对姬松茸菌丝生长及其细胞形态结构的影响

本文报道了经不同剂量60 Coγ射线辐照对姬松茸菌丝生长、扭结和细胞形态结构的影响。结果表明 ,采用 0 2～ 0 5kGy低剂量辐射后的姬松茸菌丝 ,细胞壁比对照厚 ,而且细胞出现重度质壁分离。随着辐照剂量增大其细胞壁则变薄 ,而且细胞出现轻度质壁分离。经高剂量辐射后 ,姬松茸菌丝生长速度减缓 ,菌丝生长呈稀弱状 ,但与对照相比 ,采用低剂量辐射则有利于促进菌丝生长和提前扭结 ,其子实体增产率达 34 8%。     

里氏木霉RUT-C30内切β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

摘要：以里氏木霉（Trichoderma reesei）RNA为模板，采用RT-PCR扩增的方法获得不带自身信号肽man1基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pPIC9K-man1，重组质粒SacⅠ线性化后用PEG（聚乙二醇）法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中，通过PCR和表型鉴定表明man1基因已经整合到毕赤酵母染色体上。经大量筛选，获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株RMAN23。将此菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵，测定酶活最高达470IU /mL，同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

辐射聚合离子性水凝胶固定化酵母细胞

在低温(-78℃)下,通过辐照使2-丙烯酰胺2-甲基丙磺酸(TBAS)和聚乙二醇二甲基丙烯酸醇系列单体聚合,获得了具有离子性的水凝胶载体。用这些载体固定化酵母细胞的乙醇生产力均比游离细胞高,其中用poly TBAS-14G固定化细胞的乙醇生产力是游离细胞的4.5倍,每小时糖的转化率达50％。固定化酵母的活性随聚乙二醇二甲基丙烯酸分子中乙二醇数目的增加而增加。固定化酵母具有较高活性的原因是这些高分子载体具有一定的多孔性、膨胀性,载体带有电荷并具有一定的机械强度,固定化细胞能较好地繁殖,使载体内具有较高的细胞密度。     

瑞氏木霉碳源阻遏相关基因Cre1的分子改造

为了提高瑞氏木霉（Trichoderma reesei）纤维素酶的活力,用类似基因改组的方法改造其碳源阻遏相关基因cre1。以瑞氏木霉基因组DNA为模板PCR扩增cre1基因,用DNaseⅠ消化cre1基因后,回收50-100 bp的DNA片段,用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行无引物PCR,并将PCR产物转入瑞氏木霉原生质体,通过测定滤纸酶活的方法筛选突变菌株,并在NCBI上比对分析突变菌株的cre1基因。结果表明,筛选获得1株纤维素滤纸酶活比出发菌株提高0.7倍的突变菌株cre2-3。cre2-3菌株在液体培养基中呈棉花状,而出发菌株呈小颗粒状,菌株cre2-3发酵液的颜色比出发菌株的更黄亮。推测cre1基因与瑞氏木霉菌株的生长代谢有关。     

里氏木霉FS10-C对伴矿景天吸取修复镉污染土壤的强化作用

为提高伴矿景天对Cd污染土壤的修复效果,通过盆栽模拟试验,研究了木霉(Trichoderma)对伴矿景天生和Cd修复效率的影响.结果表明:Cd的加入抑制了伴矿景天的生长;伴矿景天在Cd含量为5 mg/kg模拟污染土壤中对Cd提取效率最高.在不同Cd污染水平下,里氏木霉(T.reesei)FS10-C使伴矿景天地上部干重比对照组增加了17.1％ ～42.5％,显著提高伴矿景天地上部对Cd的积累;在15 mg/kg Cd处理下,里氏木霉FS10-C处理组植物地上部Cd积累量高于对照组46.2％但对于土壤中NH4OAc提取态Cd含量影响不显著.说明里氏木霉FS10-C能提高伴矿景天对Cd的抗性,增加其生物量,从提高其修复效率.因此,里氏木霉FS10-C具有强化伴矿景天修复Cd污染土壤的应用潜力.     

木霉的空间诱变效应

本文对产纤维素酶的木霉菌孢子和斜面培养菌体搭载中国第18颗返回式卫星后,菌落形态和产酶能力的变化进行了研究。实验结果表明,搭载菌株的菌落形态发生变异,菌株的生长周期出现了缩短或延长的现象。对搭载的木霉菌株进行筛选,获得3株产酶能力大幅度提高的优良突变菌株,产酶能力提高了50%以上,且性状遗传稳定。     

辐射技术制备固定化蛋白酶

本文探讨了在低温条件下,~(60)Co-γ射线诱导亲水性单体丙烯酸羟乙酯、疏水性的聚乙二醇二甲基丙烯酸酯系列单体聚合固定化蛋白酶的方法,研究了单体的分子结构,单体性质对固定化蛋白酶活性和热稳定性的影响。实验结果表明,采用单官能团单体(HEA)制备的固定化蛋白酶相对活性高于双官能团单体,固定化酶相对活性随疏水性单体聚乙二醇二甲基丙烯酸酯中乙二醇数的增加而增加。对于亲水性单体HEA固定化蛋白酶的相对活性则随单体的冷却速率的增加而增加。固定化蛋白酶的热稳定性随单体的亲水性而变化。     

低温辐射聚合法固定糖化酶

本文应用低温辐射技术诱导不同亲、疏水性高分子玻璃态单体聚合固定黑曲糖化酶,研究了不同实验条件对辐射聚合固定化黑曲糖化酶相对活性的影响。结果表明,在4种亲疏水性程度不同的破璃态高分子单体(2-hydroxyethyl methylacrylate和Polyethylene glucol dimethacrylate 9G,4G,2G)中,亲水性的9G、HEMA的固定化效果较好;在高分子单体浓度为50％,相应聚合物载体空孔率为32％时,固定化糖化酶与底物10次反应的平均活性产率最高,达70％左右;当辐照温度为-78℃。辐照剂量为3×10~4Gy,pH为4.5时,可以得到相对活性较高的固定化黑曲糖化酶。文中还对影响固定化糖化酶相对活性的原因进行了探讨。     

土壤微生物对施入肥料氮的固持及其动态研究

采集长期定位试验（１４年）土壤（棕壤）进行盆栽试验,并应用同位素＾１５Ｎ示踪技术研究了土壤中微生物对肥料氮的固持及其动态,结果表明,施肥后５天土壤微生物对施入人肥氮的固持达达到最高,除单施氮肥处理的固持量占施入人肥氮量的５．４％外,其余各处理均天１３．３％－１５．４％间,施肥后土壤微生物量氮的增加主要来自化肥氮,后者占微生物体总氮量的６４．１％－８７．３％,在作物生长期间微生物固持的化肥氮逐渐释入     

钙离子胁迫诱导大豆根尖细胞凋亡

用生长中的大豆根尖细胞为材料,经不同浓度CaCl2和不同时间处理,通过对凋亡细胞的形态观察和基因组DNA分析,探究CaCl2处理浓度和时间对根尖细胞凋亡影响。结果表明:利用CaCl2溶液作诱导剂处理生长的大豆根尖细胞,能引起细胞凋亡。在凋亡过程中,凋亡细胞的形态结构发生变化,DNA降解成大小不等的片段;细胞凋亡率与诱导剂处理浓度和时间正相关;在处理浓度为0.2mol/L和时间为12h时,凋亡率接近50%。因此,降低大豆根尖细胞凋亡率CaC12胁迫浓度应0.10mol/L。