杨凌番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白基因的克隆与其核心序列分析

以陕西杨凌番茄生产基地感病（TYLCV 症状）番茄植株为材料,分离得到杨凌番茄黄化曲叶
病毒分离物,命名为TYLCV-Yl（GenBank 序列号：KC293824,未公布）;克隆该病毒外壳蛋白全基因序
列CP 及其核心序列tCP;分析核心序列tCP 的特征、 进化特征;运用DNAMAN 多重比较了该病毒外壳蛋
白序列与其他18 个TYLCV-CP 核苷酸序列并且构建了基于CP 基因核苷酸序列的进化树。结果表明：获
得杨凌番茄黄化曲叶病毒（TYLCV-Yl）分离物,确定杨凌番茄黄化曲叶病毒源;获得TYLCV-Yl CP 全
基因序列核心序列tCP,为基于CP 抗TYLCV 奠定基础;tCP 核心序列非常保守,长度为 419 bp,编码
137 个氨基酸,其中在79～97 个氨基酸之间具有1 个跨膜结构;基于CP 基因构建的进化树可将番茄黄
化曲叶病毒分为3 个亚组：TYLCV 亚组Ⅰ,TYLCV 亚组Ⅱ,TYLCV 亚组Ⅲ,其中杨凌番茄黄化曲叶病毒
（TYLCV-Yl）属于TYLCV 亚组Ⅰ。     

河南省烟粉虱传播的番茄病毒病分子鉴定

为了探究河南省番茄主产区是否受到烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒、番茄褪绿病毒和番茄侵染型褪绿病毒的复合侵染,采集叶片边缘卷曲、叶片皱缩、叶脉间黄化褪绿、植株矮化的疑似烟粉虱传播的3种病毒病的番茄植株样品,分别用TYLCV、ToCV和TICV特异性引物对样品进行PCR和RT-PCR检测。结果表明,TYLCV和ToCV的特异性引物分别扩增得到约780 bp和460 bp左右的特异性条带,该条带与TYLCV和ToCV阳性对照大小一致,且与这2种病毒郑州分离物核苷酸序列同源性均在99%以上;TICV特异性引物未扩增出目的条带。说明河南主栽区番茄受到烟粉虱传播的番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的复合侵染。     

PaLCuCNV和TYLCCNV复合侵染引起更严重的番茄黄化曲叶病

 从四川攀枝花市田间采集36份表现严重矮化、黄化和曲叶症状的番茄病株样本,利用双生病毒简并引物PA/PB从所有样本中均扩增得到约500 bp的片段,经全序列测定及分析,检测出中国番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV）和中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）,这两种双生病毒的复合侵染率达97.2%。系统进化分析表明,这两种双生病毒分别与已报道的PaLCuCNV河南番茄分离物（PaLCuCNV-[HeNZMI]）及TYLCCNV云南元谋烟草分离物（TYLCCNV-[Y295]）的核苷酸序列相似性最高,分别为99.1%和97.9%。检测发现,所有分离物均伴随有卫星DNA β分子,全序列测定表明所得9个DNA β分子均为TYLCCNV的卫星TYLCCNB,且与其四川番茄分离物（TYLCCNB-[SC65]）的核苷酸序列相似性最高,为87.7% ~ 94.5%。本文首次报道PaLCuCNV与TYLCCNV/TYLCCNB病害复合体复合侵染番茄引起更严重的番茄黄化曲叶病。     

番茄黄化曲叶病毒石家庄分离物的分子鉴定及序列分析

根据番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）基因组序列的复制酶保守区设计1对引物JC1,对石家庄具有典型番茄黄化曲叶病毒症状的番茄样品进行检测,经PCR扩增得到626 bp的片段,序列分析比对表明其为TYLCV的一部分。根据上述序列设计1对特异引物QC,通过PCR分离石家庄的TYLCV全长序列并进行测序。同时利用已报道的DNA-B的通用引物CR01/CR02进行PCR扩增。结果表明石家庄分离物只含有DNA-A组分,全长为2 781 bp（GenBank登录号：KF612971）,命名为TYLCV-Shijiazhuang。基因组序列比较发现,该分离物与TYLCV-Israel株系相似性为99.0%。基因组序列系统进化分析表明,石家庄病毒分离物与北京分离物TYLCV-Beijing3（GenBank登录号：GU983859）、山东分离物TYLCV-SDSG-XC（GenBank登录号：KC999851）序列相似性很高,均属于TYLCV-Israel分支。     

番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定

2013 年秋季，在山东寿光设施番茄植株上采集到叶片脉间褪绿黄化、叶片边缘卷曲、叶片皱缩，后期叶片变厚、变
脆，并伴随着植株矮化的疑似番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染的样本。分别利用番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis
virus， ToCV）外壳蛋白基因（CP）序列引物CP-F/CP-R 和番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV）特异
引物TY1-R/TY1-F、TY2-R/TY2-F、TY3-R/TY3-F 对其进行检测、扩增，分别得到774 bp（GenBank 登录号KC709510）
和2 781 bp（GenBank 登录号KJ546418）的核苷酸序列。经序列测序后表明，KC709510 与GenBank 已登录的番茄褪绿病毒
ToCV-BJ （KC311375）分离物相似性为99.6%，KJ546418 与GenBank 已登录的番茄黄化曲叶病毒TYLCV-SDWF-L7（KC999850）
分离物相似性为99.6%。     

我国6个省份番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染率及序列系统发育分析

于2017～2019年在我国6个省份的番茄主产区，采集疑似番茄褪绿病毒（tomato chlorosis virus，ToCV）和（或）番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染的番茄样本，利用特异性引物进行RT-PCR 或PCR 扩增，将符合预期条带大小的PCR 产物测序后进行系统发育分析。结果表明，我国6 个省份番茄ToCV 和TYLCV 的复合侵染率为25.29%，其中山东省两种病毒复合侵染率最高，为46.43%。序列分析结果表明，测定的ToCV CP 基因序列与已报道的对应序列同源性在98.30% 以上，ToCV CP 基因序列没有发生明显的遗传分化；TYLCV 基因组部分序列与已报道的对应序列同源性在96.00% 以上，没有发生明显的遗传分化。     

番茄黄化曲叶病毒基因间区缺失突变体在北京的发现与证实

在北京发现两种致病性有差异的番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）毒株,得到两个不同的TYLCV分离物BJ03和BJ04,并对它们进行了全长扩增测序。TYLCV-BJ03全长为2 781 bp,TYLCV-BJ04全长为2 740 bp。进化树分析显示,这两个毒株分别属于以色列株系TYLCV-IL进化分支下中国的两个不同亚群。二者核酸序列的同源性为99.15%,主要差异在基因间区（intergenic region,IR）。BJ04比BJ03的IR区在互补链方向TATA-box与保守的9核苷酸序列之间缺失41个碱基。通过针对缺失片段设计的特异引物验证,进一步证实了TYLCV的IR区缺失突变体的存在。在对温室中不同发病番茄样本的检测中,同时检测到被两种毒株单独侵染和复合侵染的植株。     

重组酶聚合酶扩增技术在番茄黄化曲叶病毒检测中的应用

番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）是引起番茄黄化曲叶病毒病的病原,在生产中造成严重危 害,开发快速准确的检测方法对该病害的防控具有重要意义。依据番茄黄化曲叶病毒DNA-A 基因序列,设计用于重组酶聚 合酶等温扩增（RPA）检测的特异性引物,建立了TYLCV 的重组酶聚合酶等温扩增检测方法,并分析该方法的特异性和灵 敏度。结果表明,建立的TYLCV-RPA 方法可从TYLCV 阳性的番茄样品中扩增出343 bp 的特异性条带,反应条件为37 ℃ 恒温下40 min,扩增时间短,对设备要求低,且与番茄其他病毒无交叉反应,特异性好,灵敏度可达到PCR 方法的10 倍, 适用于TYLCV 的快速检测。     

番茄黄化曲叶病毒病发生程度影响因子分析及防病措施

2008年番茄黄化曲叶病毒病在江苏省丰县秋延迟及越冬棚室番茄上普遍发生,一般减产10%-50%,部分重病棚甚至绝收,严重地威胁着当地的番茄生产。番茄黄化曲叶病毒病是由番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)侵染所致。番茄在开花以前遭受番茄黄化曲     

品种品牌推介——抗番茄黄化曲叶病毒病粉果番茄品种

近年来,番茄黄化曲叶病毒病（TYLCV）在我国由南向北迅速蔓延,给当地番茄生产造成严重损失。选择抗病品种是防治番茄黄化曲叶病毒病的根本措施之一。经过育种专家的不懈努力,抗TYLCV番茄新品种选育工作取得了较大的进展,一批抗TYLCV、果实粉红色、果型较大、商品性好的番茄品种已推向市场,种植面积迅速扩大。编辑部通过对番茄主要产区进行调查和咨询有关育种专家,从中筛选出了一些在一定的区域推广面积较大,且市场反映相对较好的品种,并请入选品种的育成单位或种子销售单位提供各品种的特点、栽培区域和面积、产量、品质等资料,供读者参考。由于番茄黄化曲叶病毒株系较多,容易发生变异,与TYLCV近似的其他双生病毒也能侵染番茄,所以种植者在选择品种时一定要先根据当地的气候条件、土壤环境、茬口安排、栽培方式、管理水平及市场消费需求等进行试种,筛选出对当地特定的病毒分离物有抗性的品种后再进行大面积推广。此外,如果还没有找到合适的抗TYLCV番茄品种,也可以通过茬口安排进行避病栽培,如番茄黄化曲叶病毒病主要在夏秋季发生严重,春季栽培则可选用适合当地种植的不抗TYLCV的番茄品种,夏秋季种植其他种类的蔬菜。     

胡葱黄条病毒吉林毛葱分离物全基因组序列测定与分析

使用RT-PCR方法从吉林省疑似感染胡葱黄条病毒(Shallot yellow stripe virus,SYSV)的分蘖洋葱(毛葱)叶片中获得了SYSV吉林毛葱分离物SYSV-JL(MN607702)的全基因组序列。SYSV-JL的全长序列为10?427 nt,与GenBank已登录的3条SYSV全长或近全长序列在多个基因上保持着较高的序列一致性,但在P1基因上核苷酸和氨基酸序列一致性较低,分别为69.5%～84.2%和60.9%～76.9%,进一步通过变异分析发现,P1基因包含369个变异位点,表现出较为明显的高变异特征。系统发育分析显示,不同SYSV分离物具有较为明显的地区差异,SYSV-JL分离物与多个中国分离物系统发育关系较近。     

豇豆轻斑驳病毒海南分离物全基因组序列测定及分子特征

从海南采集疑似感染豇豆轻斑驳病毒（Cowpea mild mottle virus，CpMMV）的豇豆病叶，采用RT-PCR 结合测序获得其全基因组序列，CpMMV 海南分离物（KY420906）基因组全长8 193 bp，与其他CpMMV 分离物的同源性为63.00%～83.22%。系统发育分析结果表明，CpMMV 海南分离物单独聚为一个亚簇；重组分析结果表明，CpMMV 基因组有一个重组事件，断点为3 212～3 592 bp。     

瓜类蚜传黄化病毒在南疆的检测及系统进化

2019年从南疆7个县/市采集表现瓜类蚜传黄化病毒(Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV)侵染典型特征的47份甜瓜叶片样品,通过RT-PCR进行CABYV的检测,从县/市各选出1份代表性样本,进行特异性片段的克隆、测序,以及核苷酸多样性、蛋白序列和系统发育分析。结果显示,28份样本呈现CABYV阳性,检出率为59.57%,巴楚县、阿克苏市、莎车县、伽师县、疏勒县、疏附县、洛浦县的检出率分别为80.00%、28.57%、83.33%、60.00%、37.50%、71.42%、66.67%。克隆测序获得了707 bp的核酸序列,核苷酸多样性值在0.012～0.018之间,所有序列均具有2个开放阅读框(ORF)。ORF1编码199个氨基酸的外壳蛋白(CP),各县/市的序列相似性为99.07%。ORF2编码191个氨基酸的运动蛋白(MP),各县/市的序列相似性为98.80%。基于CP和MP序列构建的系统发育树表明,各县/市得到的所有CP和MP均聚在亚洲分支。CABYV在南疆甜瓜主产区普遍发生,且不同区域核苷酸变异很低,这些地区的CABYV与中国及日本分离物的亲缘关系较近,而与欧洲及中国台湾分离物的亲缘关系较远。     

河南部分地区番茄黄化曲叶病毒和番茄褪绿病毒复合侵染的分子鉴定

为调查河南省部分地区番茄病毒病危害情况,于2019年10月采集16份表现黄化、曲叶症状的番茄植株,利用分子生物学技术对其进行鉴定。结果表明:供试样品均被TYLCV(Tomato yellow leaf curl virus)侵染,31.75%的样品被TYLCV和ToCV(Tomato chlorosis virus)复合侵染;DNA全序列比对分析发现,供试样品中分离的TYLCV河南菌株与TYLCV-Is等地区的核苷酸序列同源性均达到94%以上,其中TYLCV-HN-AY-1分离物与TYLCV-Almeria(NC004005.1)序列相似性最高,为99.5%;对供试样品TYLCV抗病基因分子检测发现,部分番茄样品含有Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a,表明部分TYLCV株系已突破Ty-1、Ty-2、Ty-3/Ty-3a的抗性。该结果对指导河南省番茄的安全生产具有重要意义。     

番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）基因介导抗病性研究进展

番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）已经遍布世界各地,也是限制我国番茄主产区生产的主要因素,由于TYLCV易变异,常规育种单一基因抗性难以持久,本文总结了国内外利用TYLCV病毒来源基因（V1、C1等）介导抗性的研究,并且分析了其产生广谱抗性的原因。     

番茄黄化曲叶病毒的实时荧光定量PCR 检测

番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellow leaf curl virus disease,TY LCVD）是目前为害番茄生
产的重要病害,准确检测TYLCV 含量是深入研究该病毒致病机理以及抗病育种的基础。根据TYLCV 的
DNA 保守序列设计引物,基于SYBR Green I 检测模式,构建了TYLCV 实时荧光定量PCR 检测体系,并
且对接种病毒30 d 后的感病番茄植株中的TYLCV 进行检测。结果显示,1ng·μL^-1 感病番茄总DNA 中
约含有3.47×10⁶ 个病毒拷贝。利用实时荧光定量PCR 法比普通PCR 法的灵敏度提高100 倍。     

感染北京地区大葱的胡葱黄条病毒外壳蛋白基因的克隆及分析

以感染胡葱黄条病毒（Shallot yellow stripe virus,SYSV）的大葱为材料,通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）获得包含SYSV-CP全部编码序列、NIb蛋白基因5′端的部分序列和3′UTR的2个基因片段,分别命名为SYSV-CP1和SYSV-CP2,它们的编码区碱基数均为774 bp,均编码258个氨基酸|在该编码区内存在2个碱基的差异,编码的蛋白存在1个氨基酸的差异。系统进化树分析表明：SYSV分离物可以区分为两个主要群体,SYSV-CP1和SYSV-CP2位于第Ⅱ组内,它们与来自浙江的SYSV的分离物亲缘关系最近,表现出一定的地理分布相关性。     

云南番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定

在云南省元谋县发现大量下部叶片褪绿黄化,顶叶卷曲畸形的番茄植株。将叶片采集带回实验室,采用番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）和番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）的特异性引物分别扩增得到774和400 bp的目标条带,测序比对发现其与ToCV的KR184676.1和TYLCV的FJ012359.1序列相似度均为99%,确认这两条带对应的两种病毒分别为ToCV和TYLCV,明确该番茄植株被ToCV和TYLCV复合侵染。同时发现云南地区有B型和Q型两种烟粉虱存在,且Q型的比例高于B型,二者均可携带ToCV和TYLCV。ToCV首次在云南省发现,其由沿海向内陆蔓延的过程中与TYLCV的复合侵染已蔓延至西南地区,值得高度重视和警惕。