黄鳝源嗜水气单胞菌DB01分离鉴定及药敏特性研究

从患病的黄鳝(Monopterus albus)体内分离到一株致病菌株DB01,对该菌株进行人工感染、生理生化鉴定及16S r DNA序列分析。结果显示:人工感染黄鳝出现与自然发病相同的症状,表明菌株DB01为发病黄鳝的病原菌。菌株DB01为革兰氏阴性杆菌,无芽孢和荚膜,在兔血平板上能形成明显的β-溶血。序列分析显示,菌株DB01与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的同源性达99%。药敏试验结果显示,菌株DB01对诺氟沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素及氟苯尼考等抗生素高度敏感,五倍子、黄柏、地榆及乌梅等中草药对菌株DB01抑菌作用强。     

黄鳝出血病病原菌的分离与鉴定

为确定四川省部分地区黄鳝(Monopterus albus)出血病病原的种类及耐药情况,从患出血病濒死的黄鳝肝脏、肾脏、脾脏等组织取样进行常规细菌学检查,对分离菌株进行形态观察、生理生化特性和16S rDNA基因分析,并进行动物回归试验及药敏试验.结果分离得到14株病原菌株,经形态特征、理化特性及16S rDNA序列分...     

黄鳝溶血毒素性质的初步研究

通过磷酸缓冲液提取、Sephadex G-50凝胶层析和DEAE Fast Flow离子交换等分离纯化技术,从黄鳝(Monopterus albus)肌肉中分离到具有溶血活性的MAM-Ⅰ-2毒素,并对其性质进行了初步研究。结果表明:MAM-Ⅰ-2能使鸡血发生溶血现象,具有丝氨酸蛋白酶抑制剂和抗凝血活性,对嗜水气单胞菌也有较强的抑制作用。经SDS-PAGE凝胶电泳测定,该毒素蛋白相对分子质量约为43 000。对MAM-Ⅰ-2的前体物质MAM-Ⅰ的研究表明:MAM-Ⅰ除具有MAM-Ⅰ-2的特性外,还对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等细菌以及白色念珠菌有抑制作用;不同来源的红细胞对MAM-Ⅰ毒素的敏感性不同,其中牛红细胞反应最为敏感,其次是兔、鼠和鸡的红细胞。     

不同来源嗜水气单胞菌耐药基因检测

采用PCR方法,对分离于唐山和秦皇岛养殖场的宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)以及鲤(Cyprinus carpio)肝脏的42株不同水产养殖动物的致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了4种耐药基因β-内酰胺类(TEM)、氨基糖苷类(ant(3″)-I)、磺胺类(Sul3)和四环素类(tet(A))的检测。结果表明:42株嗜水气单胞菌均100%携带TEM、ant(3″)-I和Sul3,不携带tet(A)。所检不同水产动物源嗜水气单胞菌均携带TEM、ant(3″)-I及Sul3耐药基因,从分子层面表明该致病菌多重耐药或潜在耐药严重。     

100种中草药体外抑杀嗜水气单胞菌的药效研究

用琼脂扩散法(打孔法)测定了诃子等100种中草药对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的抑制作用,并用二倍稀释法测定抑菌效果较强的48种中草药对嗜水气单胞菌的最小抑菌(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示∶大部分中草药对嗜水气单胞菌有抑制作用,诃子和秦皮的抑杀效果最好,其抑菌圈直径达20 mm以上,MIC和MBC相同,都为3.91 mg/mL(诃子)和7.81 mg/mL(秦皮);红藤、仙鹤草和覆盆子等13种中草药有中等强度的抑菌和杀菌效果;雷公藤等33种中草药抑菌作用弱;而牛蒡子等52种中草药无抑菌作用。     

加州鲈出血病嗜水气单胞菌的分离鉴定、致病性和体外抑菌药物研究

从患出血病的加州鲈(Micropterus salmoides)肝脏组织中分离到一株病原菌(LY4),通过人工回归感染试验确定其致病性,采用API 20E细菌鉴定系统和16S r RNA序列分析对其进行鉴定、纸片扩散法测定其耐药性、并利用二倍稀释法评价35种中草药水提取液对其产生的体外抑菌作用。结果显示:菌株LY4能够产生胞外蛋白酶,对健康加州鲈的半数致死剂量为5.7×105CFU/m L,通过生理生化特性与16S r RNA序列分析确定其为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),药敏试验显示菌株LY4对青霉素、阿莫西林、甲氧嘧啶、四环素、多西环素、呋喃唑酮等抗生素表现出耐药性,五倍子、乌梅、地榆等中草药水提取液对其具有良好的抑菌效果。     

齐口裂腹鱼感染嗜水气单胞菌后血液生化指标与组织病理学研究

为了研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)血液生理生化指标的影响,将180尾齐口裂腹鱼平均分成6组(4、24和48 h对照组;4、24和48 h感染组)。对照组腹腔注射0.2 mL0.65%的无菌生理盐水,感染组腹腔注射0.2 mL 2.5×10~7CFU/mL的嗜水气单胞菌液。分别测定4、24和48 h对照组和感染组齐口裂腹鱼各项血液生理生化指标,并对肾脏、肝脏和肌肉组织进行病理学观察。结果显示:谷丙转氨酶、白蛋白、总胆固醇、葡萄糖、乳酸脱氢酶、钾、钠、氯、钙和磷含量均有显著变化。谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总蛋白、球蛋白、甘油三酯则没有受到显著影响。由此可见,嗜水气单胞菌感染后对齐口裂腹鱼血液指标产生了显著的影响。对病鱼的病理学观察发现病鱼体表多处出现充血出血,溃疡和腹水,尤其是肝脏、肾脏和肌肉组织均出现不同程度的损伤,变性和局部坏死。     

嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟免疫力和抗病力的影响

为研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)灭活疫苗对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(250 g±12 g)免疫力和抗病力的影响,给试验鱼腹腔注射0.2 mL的灭活嗜水气单胞菌悬液(1.0×108cfu/mL)。分别在注射前(0 d)和注射后7、14、21、28、35、42 d取样,测定血液白细胞吞噬活性、血清溶菌酶(LZM)活力、补体C3含量以及头肾和脾脏中IgM、IgT基因表达情况。结果表明:注射嗜水气单胞菌疫苗能显著提高白细胞吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)、LZM活力和补体C3含量,注射后21 d达峰值,PI、LZM和补体C3在42 d仍显著高于对照组。免疫后21 d头肾和脾脏中IgM基因上调表达,35 d达峰值(分别上升24倍和26倍),42 d下降但仍极显著高于对照组。头肾和脾脏中IgT的上调表达比IgM弱得多,头肾35 d达峰值(上升6.2倍),脾脏28 d达峰值(上升6.1倍)。免疫42 d后嗜水气单胞菌攻毒结果表明,嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟有较高的免疫保护作用,免疫保护率达到71.43%。     

嗜水气单胞菌胁迫对黄鳝肝脏等四种组织器官抗菌活性的影响

为研究黄鳝机体对细菌的免疫应答规律及其抗病机理,用不同浓度的嗜水气单胞菌感染健康黄鳝,采用抑菌圈法,检测不同处理时间黄鳝肝脏、肾脏、肠和皮肤等4种组织器官中抗菌肽粗提物对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抗菌活性。结果显示:胁迫后,黄鳝4种组织器官的乙酸提取物对嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等3种菌均具不同程度的抗菌活性,但对枯草芽孢杆菌均无明显抑制作用。各组织器官的抗菌活性规律大体表现为:对金黄色葡萄球菌的抑制作用对大肠杆菌的抑制作用对嗜水气单胞菌的抑制作用。对嗜水气单胞菌的抑制作用表现为:随着感染时间的延长,肾脏提取物的抗菌活性有所增强,皮肤提取物的抗菌活性有所减弱。对大肠杆菌的抑制作用表现为:皮肤提取物最强,肠提取物最弱,随着感染时间的延长,皮肤的抗菌活性变弱。对金黄色葡萄球菌的抑制作用表现为:肾脏和肝脏提取物较强,肠和皮肤提取物较弱。     

不同水温条件下嗜水气单胞菌对鲫感染力的研究

通过注射攻毒的方式研究了15、20、25、30、35℃水温条件下嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)对鲫(Carassius auratus gibelio)感染力。试验组每尾鱼(体重47.6 g±15.5 g)腹腔注射6×106cfu嗜水气单胞菌菌液,对照组注射等体积的无菌PBS。研究结果显示:在相同的试验条件下,水温35℃时发病最快,试验鱼出现典型的出血症状,死亡率高达100%;其次是30℃组和25℃组,死亡率均为76.67%;15℃组死亡率仅3.33%。此结果与天然条件下鲫鱼细菌性败血症的流行病学特征相吻合,为该病的预报与防控提供了科学依据。     

黄鳝性腺抑制差减文库的构建和分析

应用抑制性差减杂交技术构建了黄鳝(Monopterus albus)Ⅳ期卵巢和间期性腺的差减cDNA文库.正向差减杂交以间期性腺为试验方,Ⅳ期卵巢为驱动方;反向差减杂交以Ⅳ期卵巢为试验方,间期性腺为驱动方.将获得的差减cDNA片段连接质粒载体,然后转化大肠杆菌DH5α,最后获得的正、反向差减文库分别含461、678个重组子.经PCR扩增鉴定插入片段范嗣为200～2000 bp.随机选取正、反文库共100个阳性克隆测序分析,得到90个有效基因片段,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对.进一步从文库中选取2个基因用于半定量RT-PCR,对文库质量进行验证.结果表明,所建文库能够达到富集这两期性腺差异表达基因的目的.黄鳝性腺差减文库的构建,为进一步分离、鉴定黄鳝性腺发育和性逆转的相关基因奠定了基础.     

黄鳝质量安全风险分析

黄鳝(Monopterus albus)养殖产业近年发展较快,已在中国18个省、自治区、直辖市进行养殖,连续10年产量超过30万t.黄鳝养殖方式主要为池塘网箱养殖,其特殊的生态养殖方式对水环境污染小,影响黄鳝产品质量安全的原因主要为养殖环境及投入品.养殖环境中的重金属、农药残留等通过食物链及其他途径影响黄鳝产品质量.在...     

Effects of low dietary protein level on serum oestradiol,testosterone and sex reversal in rice field eel,Monopterus albus (Zuiew)

We investigated the effects of low dietary protein in isocaloric diets on sex reversal of Monopterus albus by evaluating the oestradiol (E₂) and testosterone (T) concentrations, gonadosomatic index (GSI), sex ratio and gonad structure at the histological level. Fish (9.50 ± 1.50 g average initial weight; n=3 per group) were fed with five practical diets containing 100, 150, 200, 250 or 400 g kg^?1 crude protein to apparent satiation for 15 months. Serum E₂ and T concentrations were determined by radioimmunoassays. E₂ concentrations and GSI significantly increased while T concentrations decreased as the dietary protein level was raised. Fish fed 400 g kg^?1 of dietary protein had significantly higher E₂ concentrations and GSI than those fed with lower dietary protein levels. The T concentrations of fish fed 100 g kg^?1 of dietary protein was significantly higher than that of fish fed higher dietary protein levels. The shift of sex ratio towards more male and intersex fish was observed with decreasing dietary protein levels. Therefore, low dietary protein level may promote sex change from female to male in M. albus. This study provides important information for successful reproductive management and may be exploited for aquaculture of this species.     

三种体色黄鳝的RAPD分析

采用20个随机引物对洞庭湖区三种不同体色的黄鳝群体(分别以A、B、C区分)进行随机扩增多态性DNA分析。结果12个引物的扩增效果良好,统计学分析表明,黄鳝A与黄鳝B的遗传距离较小(0 054107)且与A、B两个群体内的遗传距离(分别为0 045000、0 038217)相近,说明黄鳝A、B两个群体的遗传差异不明显;而黄鳝C与黄鳝A的遗传距离(0 123654)以及黄鳝C与黄鳝B的遗传距离(0 134074)均明显大于黄鳝A与黄鳝B的遗传距离,且由引物S326和S462扩增出的5条特异性谱带可以作为区分黄鳝C与黄鳝A、B两个群体的遗传标记,说明黄鳝C与黄鳝A、B两个群体之间遗传差异性十分明显。     

不同来源黄鳝(Monopterus albus)繁殖力的比较分析

比较不同来源黄鳝(Monopterus albus)的个体繁殖力,研究了其个体繁殖力分布特征、变化规律及与生物学指标的关系.以怀卵量作为绝对繁殖力的表征参数,对雌性黄鳝进行解剖测定.结果显示,野生黄鳝绝对繁殖力(F)为181-729粒,人工培养黄鳝F值为165-589粒,人工繁育黄鳝F值为135-352粒;野生黄鳝基于体重的相对繁殖力(FW)为5.4-11.8粒/g,人工培养黄鳝FW为3.5-9.3粒/g,人工繁育黄鳝FW为4.96-8.55粒/g;野生黄鳝基于体长的相对繁殖力(FL)为5.8-17.2粒/mm,人工培养黄鳝FL为4.85-15.00粒/mm,人工繁育黄鳝FL为4.35-9.03粒/mm,不同来源黄鳝在F、FL、FW上均有极显著差异(P＜0.01).来源和体色均不同的黄鳝其F和FL均具有极显著差异,而FW差异不显著;所有黄鳝的F和野生黄鳝的FL与体长、体重生物学指标密切相关,其余F、FL和FW与各生物学指标均相关性较小.研究表明,野生黄鳝的F、FL和FW均高于人工培养和人工繁育的黄鳝,怀卵量优势明显.     

Effects of dietary vitamin C on growth,antioxidant activity,and immunity in ricefield eel (Monopterus albus)

A 10-week feeding trial aimed to investigate the effects of dietary vitamin C (l -ascorbic acid) on growth, antioxidant activity, and immunity in ricefield eel, Monopterus albus. Six diets were formulated with different levels of vitamin C supplementation (0.1, 17.5, 34.8, 68.6, 139.7, and 278.5 mg/kg). The results indicated that the weight gain (WG) of the M. albus fed the diets with vitamin C was remarkably higher than that of the M. albus fed the control diet (p < .05), and the quadratic analysis showed an optimal vitamin C level of 80.66 mg/kg. Compared with the control group, serum lysozyme activities, the complement pathway, red blood cell counts, white blood cell counts, immunoglobulin M, and phagocytosis percentage were significantly increased (p < .05) in the treatment groups, and superoxide dismutase activity, serum glucose, and malondialdehyde content were significantly decreased (p < .05) in the treatment groups. The challenge trial with Aeromonas hydrophila showed that the M. albus fed the diets with vitamin C had remarkably reduced cumulative mortality compared with those fed the control diet (p < .05), and mortality in the 68.60 mg/kg diet group was the lowest. Based on WG, the optimal vitamin C supplementation level for M. albus was estimated to be 80.66 mg/kg.     

黄鳝血清白蛋白的纯化及抗体制备

通过阴离子交换层析和凝胶过滤层析,从黄鳝血清中得到其血清白蛋白,命名为MAA-serum,分子量为67kDa,为单链非糖蛋白,其N末端氨基酸序列为GHKKW。用0.5mg/只MAA-serum作为免疫源免疫大白兔,经3次免疫后,抽取大白兔血液,分离血清,饱和硫酸氨沉淀,获得抗MAA-serum的多克隆抗体。经ELISA方法测定该抗体与黄鳝血清白蛋白的免疫反应,抗体滴度为1∶100000。经初步研究发现黄鳝皮肤中也有大量血清白蛋白分布,该抗体为进一步研究MAA-serum在皮肤中的分布及生物学功能打下基础。     

黄鳝内脏铁型超氧化物歧化酶的纯化

经丙酮分级沉淀,DEAE-琼脂糖离子交换层析和Sephacry1S-200凝胶过滤,从黄鳝内脏中分离纯化获得铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD),并对其部分性质进行分析鉴定。获得该酶的比活力为1500U mg,提纯倍数为368 5,回收率为24 7%。该酶最大紫外吸收波长为280nm。聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电点聚焦电泳结果表明纯化酶蛋白呈一条带,测得该酶分子量约为87kD,亚基分子量约为14 5kD;等电点为pH7 1。