草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶同源基因Cor3低温条件下的表达变化

将草菇(Volvariella volvacea)菌株V23和耐低温诱变菌株VH3的菌丝体在4℃下处理不同时间后,采用荧光定量PCR技术中的双标准曲线法研究了S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶同源基因Cor3的表达变化。结果显示,低温处理后,草菇V23菌株的Cor3基因表达量随处理时间的延长呈不断下降趋势,10h时,其表达量仅为对照的7%。而VH3菌株Cor3基因4℃处理2h表达量明显上升,为对照的1.8倍,处理4h和6h表达量降低,分别为对照的80%和90%,处理8h的表达量又上升,为对照的1.4倍,随后下降,处理10h表达量最低,为对照的60%。根据结果初步推测Cor3基因与草菇低温耐受性具有一定相关性。     

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因上游序列的克隆和分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(sahh)全长序列设计两个嵌套引物,与Takara LA PCR in vitro cloning试剂盒的接头引物结合进行巢式PCR扩增,得到sahh上游调控序列,通过序列分析发现,该序列含有1个TATA盒和4个CAAT盒.应用MatInspector程序分析sahh上游调控序列,发现该区域存在1个耐盐因子,1个热激因子,2个DRE元件和2个ABA应答元件.     

草菇S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的克隆和序列分析

根据草菇(Volvariella volvacea)S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因(SAHH)全长cDNA序列设计引物,以草菇基因组DNA为模板,PCR扩增获得草菇SAHH基因的全长序列,序列分析结果表明,草菇SAHH长度为1868bp,编码430个氨基酸残基,基因由12个外显子和11个内含子组成,将草菇SAHH基因推断的氨基酸序列与其它物种的SAHH基因氨基酸序列进行比较发现,SAHH基因保守性较高。     

应用cDNA-AFLP技术分离草菇冷诱导表达基因

 采用cDNA-AFLP技术筛选获得了5个草菇冷诱导表达基因片段VC1、VC2、VC3、VC4 和VC5。测序结果表明, 5个DNA片段大小分别为247 bp、219 bp、172 bp、350 bp和171 bp。同源性BLAST搜索结果显示, VC1、VC2、VC3、VC4和VC5片段目前都没有同源的核酸序列; VC1片段翻译的蛋白质序列与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa) 的假拟蛋白具有一定的同源性, VC2片段翻译的蛋白质序列与水稻的AMP脱氨酶具有一定的同源性, VC3片段翻译的蛋白质序列与Danio rerio的糖原合酶激酶3α具有较高的同源性, VC4片段翻译的蛋白质序列与Leuconostocm esenteroides的假拟蛋白有一定的同源性, VC5片段翻译的蛋白质序列没有搜索到同源序列。     

草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建

A plasmid containing target DNA and a standard curve for real-time quantitative PCR of the cold-induced Cor3 gene of Volvariella volvacea were constructed. These will provide the basis for further research on Cor3 gene expression at low temperature, and ultimately for assigning a role for the gene in the low temperature autolysis of V. volvacea.     

香蕉中一个新的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及采后表达分析

利用抑制消减文库从香蕉中分离到一个cDNA片断,结合RACE技术获得该基因的全长序列。该全长cDNA共含1 285个碱基,通过Blastx同源性分析结果显示它与香蕉的一个S-adenosyl-L-methionine synthase(SAMS)基因(GenBank序列号为AF004317)具有82%的碱基同源性,编码的氨基酸顺序有93%同源性,但在cDNA的5’和3’非编码区同源性较低。设计特异引物对此基因进行RT-PCR分析表明,正常成熟的香蕉果实,采后当天表达量较高,随后略有降低,至采后12 d又达到一个相对较高值后迅速下降;高锰酸钾处理的果实,整个成熟期该基因均表现一个比较高的表达量;乙烯利处理的果实,采后表达量明显下降且处在一个比较稳定的水平。     

草菇gpd基因的克隆、序列分析和其启动子的推测以及冷诱导对其表达方式的影响

草菇3-磷酸-甘油酯脱氢酶（GPD）基因全长1489bp,含有9个内含子。gpd全长cDNA含有1157核苷酸,包含1个编码337个氨基酸的1011 bp开放阅读框和1个95 bp 3’端非翻译区。在1220 bp的5’端侧翼区内检测到启动子元件,该元件含有2个TATA框和3个CAAT框,分别位于开始密码子ATG上游第80、559、333、340和406 bp位点。Southern杂交分析表明,草菇基因组含有1个拷贝的gpd基因。Northern杂交分析表明,gpd基因的表达不受冷胁迫诱导。     

番茄S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SlSAMDC1的克隆与序列分析

 以蔓陀罗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶全长cDNA序列为信息探针, 筛选NCBI番茄EST数据库, 依据同源EST信息,经人工拼接、RT-PCR及RACE技术验证,获得了1个新的SAMDC基因家族成员,命名为SlSAMDC1(GenBank登录号：EF550528),并利用染色体步移技术克隆了879 bp的上游调控区域。SlSAMDC1 cDNA序列全长1 847 bp, 5′-UTR和3′-UTR分别长523 bp、241 bp;存在3个ORF(微型uORF、小型uORF和主ORF),主ORF编码360个氨基酸的SAMDC酶原;SlSAMDC1基因组序列全长3 648 bp,有3个内含子,均位于5′-UTR,所有内含子的剪切位点均符合真核生物“GT-AG”规则。SlSAMDC1基因与其它植物来源SAMDC基因同源性较高,与人、大肠杆菌以及酵母的同源性较低。表达谱分析发现,SlSAMDC1基因在番茄根、茎、叶、花蕾、果实等器官中均表达,果实中的表达量相对较高。生物信息学分析表明,SlSMDC1基因的上游调控序列存在多个顺式作用元件,如W-box、TATA-box、CAAT-box等。     

番茄S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因SlSAMDC1的克隆与序列分析

以蔓陀罗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶全长eDNA序列为信息探针,筛选NCBI番茄EST数据库,依据同源EST信息,经人工拼接、RT—PCR及RACE技术验证,获得了1个新的SAMDC基因家族成员,命名为SISAMDC1（GenBank登录号：EF550528）,并利用染色体步移技术克隆了879bp的上游调控区域。SISAMDC1 eDNA序列全长1847bp,5′-UTR和3′-UTR分别长523和241bp;存在3个ORF（微型uORF、小型uORF和主ORF）,主ORF编码360个氨基酸的SAMDC酶原;SISAMDC1基因组序列全长3648bp,有3个内含子,均位于5′-UTR,所有内含子的剪切位点均符合真核生物“GT-AG”规则。SISAMDCl基因与其它植物来源SAMDC基因同源性较高,与人、大肠杆菌以及酵母的同源性较低。表达谱分析发现,SISAM-DCl基因在番茄根、茎、叶、花蕾、果实等器官中均表达,果实中的表达量相对较高。生物信息学分析表明,SISMDC1基因的上游调控序列存在多个顺式作用元件,如W—box、TATA—box、CAAT—box等。     

荔枝败育胚S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分析

 从荔枝‘桂味’的败育胚中提取总RNA，利用GeneRacer^TM Kit将RNA经去磷酸化反应、去mRNA的帽子结构及RNA Oligo连接，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，分别用SSH分离得到的胚败育相关差异表达s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的部分cDNA序列(599 bp)设计出3’和5’端基因特异引物，进行PCR末端扩增。荔枝败育胚的s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列全长为1515 bp，编码393个氨基酸，与其它物种的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核苷酸序列同源性在79%~82%之间，氨基酸序列同源性在88%～91%之间。结果表明所获得的基因为与荔枝胚败育相关的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因。关键词：     

草菇厚垣孢子研究

本文研究了草菇厚垣孢子的萌发条件及对不良条件的抵抗力.试验结果表明,草菇厚垣孢子萌发最适温度为40℃,培养基PH为7,对培养基的营养状况无要求;草菇厚垣孢子与菌丝体均不耐干旱;菌丝体可耐45℃3d,但50℃处理24h便失活,而厚垣孢子可耐50℃处理24h.在4℃处理14d后,厚垣孢子的萌发率没有下降,而菌丝体完全失活,厚垣泡子耐酸能力比菌丝体强。     

Construction of a Plasmid and a Standard Curve for Real-time Quantitative PCR of the Cold-induced Cor3 Gene from Volvariella volvacea

A plasmid containing target DNA and a standard curve for real-time quantitative PCR of the coldinduced Cor3 gene of Volvariella volvacea were constructed. These will provide the basis for further research on Cor3 gene expression at low temperature, and ultimately for assigning a role for the gene in the low temperature autolysis of V. volvacea.     

草菇厚垣孢子的研究

研究了草菇厚垣孢子在不同的C/N比的培养基中产生的数量。结果表明 ,不同的C/N比对草菇厚垣孢子的形成有一定的影响 ,其最佳的C/N比为 30～ 4 0。草菇品种间产生厚垣孢子的数量的差异并不显著。另外 ,本试验首次定量分析了厚垣孢子的产量数 ,对常规性分析方法进行了改进。     

草菇蛋白酶的分离与纯化

草菇是我国食用菌主要栽培品种之一,属于典型的高温真菌,低温将诱导草菇细胞内的蛋白质降解,导致草菇菌丝自溶、死亡。蛋白酶在草菇低温自溶过程中起了重要作用。草菇子实体经破碎、(NH_4)_2SO_4分步沉淀、Sephadex G-150凝胶过滤,获得草菇蛋白酶样品,为草菇的低温自溶与蛋白酶之间关系的研究奠定了基础。     

草菇染色体核型的鉴定

利用等高锁状同源电场凝胶电泳（CHEF）,获得草菇的电泳核型.综合两组脉冲电泳的电泳条件、溴化乙锭染色以及DNA杂交分析结果,草菇染色体DNA至少可分为9个谱带.这一结果和以前用光学显微镜观察草菇的染色体数目的结果相一致.以混浊酿酒酵母和粟酒裂殖酵母等的相对迁移率为基准,草菇染色体长度估计在1.32～5.4Mb之间,染色体组总长约25Mb.     

草菇基因枪法遗传转化体系的建立

 草菇菌株V1308对潮霉素、卡那霉素、遗传霉素、膦丝菌素的抗性测验结果表明, 该菌株对潮霉素敏感, 而对其它三者不敏感。进一步测定结果显示, 潮霉素的最低筛选浓度在PDSA固体培养基上为75 μg·mL ^{- 1} , 在PDSB液体培养基中为50μg·mL ^{- 1}。以含有35S启动子、gus报告基因、潮霉素抗性基因的质粒pCAMB IA1301为表达载体, 采用基因枪法对草菇菌丝体进行遗传转化。结果表明, 基因枪的最佳轰击参数为: 氦气压力1 100 Psi, 真空压力87.88 kPa, 靶距离6 cm, 轰击次数1次。Southern杂交结果显示, gus基因已整合进V1308基因组中。GUS组织化学检测结果证明, gus基因在V1308菌丝体中获得了表达。草菇出菇试验结果显示, 转基因草菇和对照都能正常形成子实体, 子实体组织分离长出的菌丝体经GUS组织化学检测, 证明了外源基因gus能够在转基因草菇的菌丝体中稳定表达。     

草菇蛋白酶的鉴定

草菇是我国食用菌主要栽培品种之一,属于典型高温真菌。低温将诱导草菇细胞内的蛋白质降解;造成草菇菌丝自溶、死亡。蛋白酶在草菇低温自溶过程中起了重要作用。在分离、纯化草菇蛋白酶的基础上,采用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白酶的分子量为23KD,并测定了蛋白酶不同温度下的活性变化曲线,为草菇低温自溶与蛋白酶之间关系 的研究奠定了基础。     

草菇开伞相关基因反义表达载体构建

以质粒pCAMBIA1301和pBI121为基础构建草菇表达载体pCB。把已克隆的草菇开伞相关基因DNA片段正反向插入pCB,获得pCB—opn15和pCB—opn39,经测序证实,pCB—opn15为正向插入,pCB—opn39为反向插入。