新型疫苗佐剂研究进展

佐剂是增强和调节疫苗抗原免疫反应的免疫刺激物,与抗原一起使用能产生更强的免疫反应。佐剂能激活机体的天然免疫系统,当佐剂和抗原同时或预先注射到机体内,可改变抗原的形态并延长抗原在体内的滞留时间,促进单核吞噬细胞对抗原的递呈能力及刺激淋巴细胞增殖分化,从而增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂的发展史长达一百多年,目前使用最广泛的疫苗佐剂是铝佐剂,传统的灭活疫苗在很大程度上依靠以铝盐为主的复合物作为主要佐剂。但近年来,随着基因工程技术和生物技术的飞速发展,重组疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗等新型疫苗逐步被开发出来,这些新型疫苗与传统疫苗相比往往存在免疫应答能力差等问题,早期的抗原不纯导致传统的铝盐佐剂已无法满足需要。为解决新型疫苗免疫原性差的问题,科研人员致力于开发广谱且高效的新型疫苗佐剂用来增强新型疫苗的作用。新型疫苗佐剂种类繁多,功能各不相同且机制较为复杂,可分为新型油乳佐剂、脂质体佐剂、CpG寡核苷酸佐剂、细胞因子佐剂、纳米佐剂、多糖佐剂及复合系统类佐剂等。笔者对疫苗佐剂的发展史、作用机制及新型疫苗佐剂的分类进行分析和评述,以期为新型疫苗佐剂的研制及开发提供参考。     

不同佐剂对口蹄疫灭活疫苗稳定性的影响

为了进一步提高口蹄疫疫苗的稳定性并打破国外佐剂垄断现象,研究近年来市面上不断出现的新型佐剂的性能,给口蹄疫疫苗生产厂家筛选国产新型疫苗佐剂提供数据支持,试验以南京威尔药业集团股份有限公司的Well佐剂和SEPPIC公司的ISA 201佐剂为研究对象,以目前口蹄疫疫苗生产厂家常规使用的ISA 206佐剂为对照,配制口蹄疫灭活疫苗后检测其物理性状、免疫效果及稳定性,从而评价佐剂效果。结果表明,Well佐剂和ISA 201佐剂的疫苗稳定性和免疫效果均低于ISA 206佐剂。     

口蹄疫纳米乳疫苗免疫持续期的试验研究

试验用同一批次相同抗原含量的口蹄疫病毒灭活抗原,分别采用纳米乳佐剂和ISA206佐剂配制口蹄疫O型、A型双价灭活疫苗,并对仔猪进行免疫,免疫后6个月内用液相阻断ELISA方法检测O型、A型免疫抗体效价(lg)。结果:免疫后6个月内纳米乳疫苗免疫猪产生的抗体lg平均值均高于ISA206佐剂疫苗,抗体水平在免疫后1个月达到最高。免疫后第6个月,纳米乳疫苗O型抗体lg平均值为2.19,A型抗体lg平均值为2.175,按液相阻断ELISA试剂盒的判定标准免疫猪抗体lg≥1.8,具有99%以上保护效力,纳米乳疫苗属于完全保护范围,而ISA206佐剂疫苗属于不完全保护范围。     

不同类型的免疫佐剂在口蹄疫疫苗中的应用研究

对本实验室研制的纳米佐剂M12,赛比克公司的纳米佐剂IMS1313、羟基磷灰石凝胶佐剂HA以及赛比克公司的矿物油佐剂ISA206,配制口蹄疫O型灭活疫苗,通过相关物理性状检测,比较4种佐剂的乳化效果。结果显示,4种佐剂乳化的疫苗物理性状均达到质量标准。对小鼠的免疫试验,分别免疫16g雌性BALB/C小鼠10只,免疫后每隔7d采集血样,共计90d,进行液相阻断ELISA试验,结果显示,自制M12纳米佐剂免疫平均抗体效价最高,且持续在较高水平。     

口蹄疫A型油佐剂和leo佐剂弱毒灭活疫苗免疫持续期的研究

用实验室配制的口蹄疫油佐剂和leo佐剂A型弱毒灭活疫苗各免疫6月龄健康敏感牛（乳鼠中和抗体滴度小于1：4）5头，免疫后每月采血一次，分离血清；采用固定病毒稀释血清的方法，通过乳鼠中和试验检测免疫牛血清中的口蹄疫A型中和抗体的产生与消长情况，用karber法计算中和效价，绘制动态曲线图。结果显示，口蹄疫弱毒灭活疫苗免疫牛，可以产生高滴度的血清中和抗体，免疫牛血清中和抗体效价均在免疫后1个月左右达到高峰。油佐剂疫苗免疫的牛，血清中和抗体效价比较高，但下降比较迅速；leo佐剂疫苗免疫的牛，血清中和抗体效价比较低，但下降比较平缓。     

磷酸钙作为O型口蹄疫多肽疫苗佐剂的研究

为了探索磷酸钙(calcium phosphate,CaP)作为多肽疫苗佐剂的可行性,本研究以O型口蹄疫多肽疫苗为抗原,采用共沉淀法制备CaP-多肽复合物,测定包封率。将制备好的疫苗,分别在0、14、28 d腹腔注射免疫Wistar大鼠,尾静脉采血检测口蹄疫抗体水平。结果显示,CaP可包裹一定量的O型口蹄疫多肽,包封率达到50%,免疫大鼠后油佐剂组抗体效价在14 d达到26,42 d增至210并可维持35~42 d;CaP组在21 d后陆续产生抗体,抗体水平较油佐剂低,为27~28。结果表明,CaP作为佐剂相对游离多肽可以提高O型口蹄疫多肽疫苗免疫效果,但抗体水平相对油佐剂低。     

不同佐剂制备牛口蹄疫O型灭活疫苗的效力评价试验

本研究采用两种不同佐剂分别与同种抗原乳化制备成两批牛口蹄疫O型灭活疫苗(对应代号分别为A和B),并对其物理性状、安全性、效力等方面进行检验.结果表明,A疫苗的保护率高于B疫苗,佐剂对疫苗的保护率有一定的影响.     

纳米铝胶佐剂增强猪细小病毒灭活疫苗猪体免疫的效果

将20头35日龄断奶仔猪随机分为4组,将制备的纳米铝胶佐剂猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)灭活疫苗肌肉注射免疫接种,并以常规铝胶佐剂PPV灭活疫苗组、市售PPV油乳剂灭活疫苗组为疫苗对照,生理盐水组做阴性对照,应用HI和ELISA检测接种猪的体液免疫水平,流式细胞仪检测免疫猪的细胞免疫水平。体液免疫检测结果显示,PPV纳米铝胶佐剂疫苗组能显著提高机体产生抗体的速度,在首免后第2周产生有效保护抗体水平显著高于油乳剂疫苗和常规铝胶佐剂疫苗组(P0.05),在第3周其抗体水平达到峰值;细胞免疫检测结果显示,3种疫苗均能诱导机体产生细胞免疫应答,但各组之间差异不显著(P0.05)。结果表明,以纳米铝胶为佐剂制备的猪细小病毒灭活疫苗,能显著提高机体的免疫水平,并较早刺激机体产生抗体,具有较好的免疫保护效果。     

新型纳米乳佐剂在口蹄疫疫苗中的应用研究

本研究创制新型纳米佐剂与口蹄疫O型灭活抗原按1:1比例配制疫苗,并对该疫苗的物理性状、安全性以及免疫效果进行系统研究,结果表明,新型纳米佐剂疫苗流动性佳,易注射,稳定性好,免疫副反应小以及免疫效果均优于商品化ISA206佐剂疫苗,为纳米乳疫苗的后期研究与应用提供依据。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫佐剂的比较试验

以猪圆环病毒2型(PCV2)遗传标记毒株为毒种,经细胞培养传代,优化了病毒增殖条件,获得较高滴度的病毒培养物用于PCV2灭活疫苗的研制。为了比较不同免疫佐剂的效果,本试验对国产矿物质白油和铝胶两种佐剂以及赛比克公司提供的MONTANIDETMISA206、ISA15VG、IMS1315VG3种佐剂配制的灭活疫苗进行了猪体免疫试验。通过临床观察、血清抗体效价测定,确认ISA15VG佐剂配制的疫苗在增强免疫效果方面优于其它佐剂。按5种佐剂免疫效果排序为ISA15VG、IMS1315VG、铝胶、ISA206、国产白油。ISA15VG佐剂属于水包油剂型,可刺激接种动物产生快速免疫应答反应,抗体产生效价高、持续时间长,有可能成为新型PCV2灭活疫苗佐剂的候选。     

2014年安顺市口蹄疫疫苗免疫效果调查报告

为了解家畜口蹄疫疫苗免疫效果,安顺市疫控中心实验室对全市范围内家畜免疫血清进行了抽样调查,采用VP1结构蛋白抗体ELISA及液相阻断ELISA检测对群体抗体进行检测。结果表明,猪0型口蹄疫合成肽疫苗及0型口蹄疫佐剂灭活疫苗抗体检测合格率分别为89.0%和76.5%,猪0型口蹄疫佐剂灭活疫苗抗体合格率低于猪0型口蹄疫合成肽疫苗;牛羊0型口蹄疫及亚洲Ⅰ型双价疫苗抗体检测合格率分别为82.2%和87.2%,均达到国家规定标准。此次调查为安顺市疫苗选用及制定免疫方案提供依据,为下一步防控措施提供指导。     

2011-2015年安顺市家畜口蹄疫免疫效果调查分析

为了解安顺市近5年家畜口蹄疫免疫效果,采用VP1结构蛋白抗体ELISA及液相阻断 ELISA方法对全市家畜口蹄疫免疫血清进行免疫抗体监测。结果表明：2012、2013年猪O型口蹄疫合成肽疫苗抗体检测合格率极显著下降( P<0.01),2012年猪O型口蹄疫佐剂灭活疫苗及牛O型口蹄疫－亚洲Ⅰ型双价苗抗体检测合格率极显著下降( P<0.01);羊O型口蹄疫－亚洲Ⅰ型双价苗抗体检测合格率总体呈逐年上升趋势( P<0.01),猪O型口蹄疫合成肽疫苗比猪O型口蹄疫佐剂灭活疫苗保护率高。     

猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫效果试验

为了更好地了解猪口蹄疫O型合成肽疫苗与灭活疫苗免疫后抗体水平之间的差异．在梅小市选择2个规模化养猪场,每个猪场分2组,对试验猪分别免疫猪口蹄疫O型合成肽疫苗和猪口蹄疫O型灭活疫苗．对接种疫苗的试验猪进行免疫应激观察,结果显示：注射合成肽疫苗试验猪未出现不良免疫副反应．说明用合成肽疫苗临床使用的安全性较高;采用猪O型口蹄疫VP1抗体检测试剂盒和正向间接血凝试验分别对使用上述两种口蹄疫疫苗免疫21d后的猪血清进行检测,结果表明：免疫猪口蹄疫O型合成肽疫苗用猪O型口蹄疫VP1抗体检测试剂盒检测．抗体阳性合格率达到92．50％,免疫猪口蹄疫O型灭活疫苗用正向间接血凝试验检测,免疫合格率为35．83％,说明猪口蹄疫O型合成肽疫苗接种后的免疫效果明显优于传统灭活疫苗。     

新型兽用疫苗佐剂的研发

现代疫苗大部分是由化学合成多肽或基因工程重组抗原组成的,其免疫原性相对较弱,需要借助免疫佐剂来提高疫苗的免疫效果,具体来讲,免疫佐剂能够提高机体对抗原的适应性免疫应答。现从纳米粒子佐剂、天然佐剂、脂质体、细胞因子分析新型兽用疫苗佐剂的研发和应用。     

猪流行性腹泻灭活疫苗佐剂筛选

为探究不同佐剂对猪流行性腹泻灭活疫苗免疫效果的影响,选用水包油佐剂A(O/W)、油包水佐剂B(W/O)和双相佐剂C(W/O/W)3种不同佐剂配制疫苗,分别接种3～5日龄仔猪后攻毒,综合评价不同佐剂的免疫效果。结果显示：A、B佐剂组疫苗免疫猪的抗体水平低于C佐剂组;攻毒后进行猪流行性腹泻病毒检测发现,仅C佐剂组试验猪全部呈阴性;剖检所有疫苗免疫组试验猪均未发现脏器病变。结果说明：双相佐剂制备的灭活疫苗免疫效果明显优于水包油和油包水佐剂疫苗,且安全性较高,可优先选择双相佐剂制备猪流行性腹泻灭活疫苗。本研究为猪流行性腹泻疫苗制备、生产提供了技术支撑。     

猪瘟猪O型口蹄疫高致病性猪蓝耳病疫苗联合免疫试验报告

为了评价猪瘟、口蹄疫、猪蓝耳病疫苗联合免疫效果,采用猪瘟脾淋苗、猪O型口蹄疫缅甸98灭活疫苗和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗对33～50日龄健康仔猪同时分点注射进行联合免疫,用正向间接血凝试验和ELISA试验检测其免疫效果。结果表明,3种疫苗联合免疫具有较高安全性,猪瘟脾淋苗、猪O型口蹄疫缅甸98灭活疫苗(浓缩)和高致病性猪蓝耳病灭活苗同时分点注射,对猪瘟脾淋苗和猪O型口蹄疫缅甸98灭活疫苗免疫效果无明显的免疫抑制或干扰作用,但对高致病性猪蓝耳病灭活苗免疫效果有显著的抑制或干扰作用。猪瘟脾淋苗、猪O型口蹄疫缅甸98灭活疫苗可进行联合免疫,但高致病性猪蓝耳病灭活疫苗应单独免疫。     

猪丹毒丝菌灭活疫苗免疫佐剂的筛选

旨在筛选适宜于猪丹毒丝菌灭活疫苗的佐剂。以分离鉴定出的猪丹毒丝菌1a型HG-1株灭活菌体为抗原分别配制矿物油佐剂疫苗（简称矿物油疫苗）、氢氧化铝胶佐剂疫苗（简称铝胶疫苗）、ISA201双相油乳佐剂疫苗（简称ISA201疫苗）、GEL02水溶性聚合物佐剂疫苗（简称GEL疫苗）、IMS1313水溶性纳米佐剂疫苗（简称IMS1313疫苗）共5种佐剂的灭活疫苗。小鼠免疫保护试验结果表明,二免14 d后使用约为4 LD₅₀的HG-1株对小鼠进行腹腔攻毒,矿物油疫苗和GEL疫苗的保护率分别为100%（7/7）和71%（5/7）,其他三种佐剂疫苗的保护率均为14%（1/7）。本研究进一步选择铝胶疫苗和GEL疫苗进行猪体对比试验;仔猪安全性试验结果表明,两种佐剂疫苗的副反应均较小;免疫保护试验结果表明,两次免疫后使用约为16 LD₁₀₀的HG-1株对免疫仔猪进行耳缘静脉攻毒,两种佐剂疫苗的保护率分别为60%（3/5）和100%（5/5）。本研究最终选择GEL佐剂作为开发猪丹毒灭活疫苗的最适佐剂。     

牛口蹄疫O型-亚I型双价灭活疫苗、A型灭活疫苗和牛口蹄疫三价灭活疫苗免疫效果比对试验

本试验对现用奶牛口蹄疫O型、亚洲I型、A型三价灭活疫苗与奶牛口蹄疫O型、亚洲I型二价灭活疫苗及口蹄疫A型灭活疫苗的免疫效果进行了对比分析,结果显示,不同的疫苗的免疫效果不存在显著差异,但三价苗一免多效,省工省时,可缩短防疫周期。     

奶牛口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗免疫效果对比试验

为了解兰州地区奶牛口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的免疫效果,科学评价免疫质量以及合理制定口蹄疫疫苗免疫程序,本研究应用液相阻断ELISA和O型正向间接血凝检测方法分别对目前兰州地区使用的4种口蹄疫二价灭活疫苗的免疫效果进行了对比。结果表明,兰州地区使用的4种口蹄疫O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的O型和亚洲Ⅰ型口蹄疫保护性抗体诱导能力参差不齐,其中以B公司O型-亚洲Ⅰ型二价灭活疫苗的抗体诱导能力最强,其他3个公司的疫苗则相对较差。     

疫苗佐剂的研究发展和前景展望

佐剂对于疫苗的免疫效果具有至关重要的作用,本文对目前常用佐剂及纳米佐剂的类别及其免疫机制的研究发展进行了系统性的综述。纳米技术作为一门新兴的科学技术,在佐剂的应用和研究发展中具有十分可观的潜质。