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本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),建立了一种快速、准确和灵敏的接骨木镰孢的检测技术。通过比对接骨木镰孢与其近源种之间的候选靶标序列,选取TEF1-α(translation elongation factor 1-α,翻译延伸因子)基因作为靶标,设计并筛选出一套对该病原菌具有种特异性的LAMP引物,建立了检测接骨木镰孢的 LAMP 体系。该体系在反应前加入染料羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB),经62℃恒温反应70 min之后,可根据肉眼观察到的反应物的颜色判定结果。特异性分析结果表明,仅接骨木镰孢的DNA经检测后呈天蓝色的阳性反应,而其他供试菌株的DNA均呈紫色的阴性反应。该方法对DNA的最低检测限为100 pg·μL-1。在采自内蒙古和黑龙江的28份马铃薯干腐病疑似病害样本中,检测到14份阳性样品。该方法的建立为接骨木镰孢的检测及其所致病害的诊断提供了快捷准确的技术。 相似文献
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小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus(FreMV)是侵染兰花的主要病毒,严重影响其观赏价值。本研究根据FreMV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示设计引物能特异扩增FreMV,与其他4种病毒(菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus、黄瓜花叶病毒Cucumber mosaic virus、建兰花叶病毒Cymbidium mosaic virus和齿兰环斑病毒Odontoglossum ringspot virus)不发生反应;该方法灵敏度为RT-PCR的10倍。田间检测20份样品中,RT-LAMP和RT-PCR检测结果一致,检出率为60%。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染FreMV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。 相似文献
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逆转录环介导等温扩增技术检测南方菜豆花叶病毒 总被引:3,自引:0,他引:3
根据南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了4组RT-LAMP引物,通过引物筛选试验,确定SB1组引物为最佳引物,并进行了引物特异性与灵敏度检测试验,最终建立了南方菜豆花叶病毒的RT-LAMP检测方法。灵敏度检测试验显示,RT-LAMP方法比普通RT-PCR法灵敏度高10倍,而检测时间明显缩短,整个反应过程只需40 min。此外,体系中加入钙黄绿素,反应结束后,可裸眼观察颜色变化来判定结果。本研究所建立的SBMV RT-LAMP方法具有快速、稳定、灵敏、特异、操作简单的特点,适合于SBMV的现场快速检测。 相似文献
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环介导等温扩增技术检测大丽轮枝菌 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),通过比对分析大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)与其相近种不同靶标序列间的差异,选取Gpd(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因作为靶标基因,设计并筛选了四条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和两条环引物,建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的大丽轮枝菌的检测方法,并进行了特异性、灵敏度实验及田间发病组织的检测。该方法在62 ℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。特异性试验中,仅含有大丽轮枝菌菌株DNA的反应管扩增后呈天蓝色的阳性反应,而其他供试菌株均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为100 pg·μL-1,在土壤中检测的灵敏度为10个孢子/0.25g土壤。该技术能够检测出棉花发病组织中的目标菌,对采自江苏和山东的24份疑似病害样本进行检测,11份为阳性。该方法的建立为大丽轮枝菌的检测及其所致病害的诊断提供了新的技术。 相似文献
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为建立简便、快速和灵敏的小麦白粉菌Blumeria graminis f.sp.tritici(Bgt)分子检测技术体系,基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术,以BGT96224V316_LOCUS1725基因(GenBank:VCU40465.1)为靶标序列,设计并筛选特异性引物,建立小麦白粉菌的LAMP检测方法,并对其特异性、灵敏度和应用效果进行测定。结果表明,基于筛选出的1套特异性引物建立的LAMP方法能够从8种白粉菌属菌株和1种腐生菌中特异性地检测到小麦白粉菌;对小麦白粉菌DNA样品的检测灵敏度可达到300 fg/μL;对发病叶片的检测显示该LAMP方法能从人工接种的小麦叶片中准确检测出小麦白粉菌,检出时间为接种4 h及以上。综上,本研究建立了一种小麦白粉菌的LAMP检测方法,具有简便快捷、灵敏度高等特点,丰富了小麦白粉菌的检测体系。 相似文献
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《植物检疫》2019,(2)
本文建立了基于重组酶介导核酸扩增(RAA)技术快速鉴定新菠萝灰粉蚧(Dysmicoccus neobrevipes)反应体系,并利用该技术开展了口岸截获粉蚧的检测与鉴定。通过分析河南口岸常截获的17种粉蚧线粒体COI基因序列,设计筛选了基于RAA技术的新菠萝灰粉蚧的特异性引物,并对其进行条件优化。结果表明线粒体COI基因能准确区分新菠萝灰粉蚧与其他16种粉蚧;新菠萝灰粉蚧RAA特异性引物能稳定扩增出片段大小为323 bp单一条带,最适宜扩增温度为恒温39℃,扩增时间为20~30 min,检测DNA浓度限值为1.6×10~(-3)μg/mL。本文利用RAA技术建立的新菠萝灰粉蚧快速鉴定方法,耗时短,灵敏度高,重复性好,适用于一线口岸初筛鉴定。 相似文献
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为建立简便、快速和灵敏的小麦纹枯病菌——禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis的分子检测技术体系,基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)为靶标序列,设计并筛选特异性引物,建立禾谷丝核菌的LAMP检测方法,并对其特异性、灵敏度和应用效果进行测定。结果表明,基于筛选获得的4条禾谷丝核菌特异性引物建立的LAMP方法能够从15种植物病原菌中特异性地检出禾谷丝核菌,近缘种立枯丝核菌Rhizoctonia solani和引致早期症状易混淆病害的病原菌禾顶囊壳菌Gaeumannomyces graminis、麦根腐平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana和禾谷镰孢菌Fusarium graminearum均未检出;该LAMP方法在日光下的灵敏度为10-1 ng/μL,在蓝光下的灵敏度为10-3 ng/μL;对发病组织的检测显示该LAMP方法能从人工接种的小麦发病组织中... 相似文献
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本研究采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP),建立了一种快速、简便的烟草环斑病毒检测方法。根据TRSV外壳蛋白编码基因上的8个位点,共设计了6条引物,通过RT-LAMP扩增得到特征性的梯度条带。特异性试验表明,引物对TRSV的检测具有良好的特异性;灵敏度试验显示RT-LAMP比普通RT-PCR高10倍。通过反应温度和时间的优化,该方法只需在水浴锅中60℃等温扩增60 min,整个检测周期约1.5 h,结果采用SYBR green I染色显示,易于观察和判定。 相似文献
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本文根据玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis )的UmPep1、UmPit2和UmSee1基因各设计4套环介导等温扩增(LAMP)引物,从中筛选出1套引物对LAMP反应体系进行3因素(Bst DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、内外引物浓度比)3水平的优化试验。并对优化的U. maydis LAMP反应体系进行特异性、灵敏度及田间检测可行性试验。特异性试验表明,该方法能特异性检测U. maydis,而与其他病原菌的DNA没有交叉反应;灵敏度试验表明,该反应体系的最低检出限为44 fg·μL-1 pEasy-Pep质粒DNA,制作的标准曲线可对U. maydis进行定量分析。该方法也适用于在U. maydis侵染前或侵染早期对田间样品进行检测,对现场采集的172份田间样品进行检测,其中140个样品显示为阳性。本研究所建立的LAMP体系具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点,并能在45 min内完成对田间样品的检测,是快速、定量检测U. maydis的有效手段。 相似文献