缬草内生菌和根际放线菌的分离及安莎类抗生素的筛选

【目的】分离缬草内生菌及根际放线菌,筛选其中含安莎霉素类抗生素生物合成基因的菌株,挖掘其活性次级代谢产物资源。【方法】从缬草根、茎、叶及根际土壤中分离内生菌和根际放线菌,检测其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、核桃溃疡病菌、苹果腐烂病菌、苹果轮纹病菌、油菜菌核病菌、小麦赤霉病菌、棉花枯萎病菌的抑菌效果。设计2种简并引物,用PCR方法从抑菌效果较好的菌株中筛选含安莎霉素类抗生素基因(AHBA)的菌株。分析目标菌株的最佳发酵培养基和最适发酵时长,对发酵分离物进行HPLC和质谱分析,检测其可能的次级代谢产物。【结果】试验共分离到145株菌,其中内生菌27株,占总菌株数的18.6%,根际放线菌118株,占总菌株数的81.4%;33株对病原菌有较好的抑菌效果,占总菌株数的22.8%。筛选到1株含AHBA基因的菌株AJ21,初步鉴定其为链霉菌。菌株AJ21最佳发酵培养基为SPY培养基,最佳发酵时间为6d。菌株AJ21发酵液经分离纯化、HPLC检测和质谱分析,初步确定其含有的安莎霉素类抗生素为放线菌素D。【结论】药用植物缬草内部及根际蕴含丰富的放线菌资源,具有良好的生物学活性。     

桉树根际土壤抑草放线菌的筛选与鉴定

为筛选具有抑草作用的放线菌,通过稀释涂布平板法从桉树根际土壤分离了14株放线菌。其中,A10菌株发酵液稀释50倍后对莴苣根长和株高的抑制率分别为53.93%和29.71%;A10发酵液稀释100倍后对水稻、黄瓜、白菜、黑麦草根长的抑制率分别为10.13%、17.66%、31.70%、18.45%。形态学和16S r DNA鉴定结果表明A10菌株是链霉菌(Streptomyces)。A10菌株最优培养条件为:以葡萄糖或蔗糖为碳源,以酵母浸膏为氮源,培养温度30℃,p H值为6.0。最优条件下,A10菌株发酵液对苜蓿根长抑制率比优化前提高13.55%。A10菌株具有开发为微生物除草剂的可能性。     

川芎内生放线菌活性菌的筛选及鉴定

为了了解川芎内生放线菌抑制常见致病菌的能力,从中筛选活性较强的放线菌资源,采用纸片扩散法测定发酵提取液对5种指示菌的抑菌活性,结合经典分类法和分子生物学法鉴定活性菌种。结果表明,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、黑曲霉(Aspergillus niger)和白色念球菌(Canidia albicans)表现抑制活性的菌株占川芎内生放线菌的百分比分别为83.33%、76.67%、23.33%、30.00%、13.33%;从中选出4株活性较强的放线菌,Blast比对结果表明,菌株F3、F19、F-L-5、F-L-7的16S r DNA序列与Gen Bank已知序列链霉菌属金色类群[Streptomyces sp.(KF126314.1)]、暗灰链霉菌[Streptomyces canus(AB7184118.1)]、肿痂链霉菌[Streptomyces turgidiscabies(FJ883749.1)]、暗色产色链霉菌[Streptomyces phaeochromogenes(KP718589.1)]高度相似,同源性分别为99%、100%、99%、99%。综合鉴定,F3为链霉菌属金色类群,F19为暗灰链霉菌,F-L-5为肿痂链霉菌,F-L-7为暗色产色链霉菌。表明川芎内生放线菌中具有应用潜力的高活性菌株,并鉴定出4株活性菌。     

皂荚内生拮抗细菌的分离筛选及代谢产物分析

为明确抗病细菌在皂荚体内的分布及其抑菌活性,采用组织分离法从皂荚树中分离筛选出12株有拮抗效果的内生细菌,并通过过滤灭菌处理和高温灭菌处理2种方法对其代谢产物进行分析,选出ZJ4、ZJ7两株潜在生防菌,并对其抗菌谱进行了测定。结果显示,ZJ4、ZJ7经高温灭菌处理后抑菌活性明显下降,推测其可能代谢产生对热敏感的蛋白酶类,而且对不同病原菌的抑制作用表现出一定的选择性,对链格孢属的番茄早疫病菌和梨黑斑病菌效果较好。     

柽柳根际土壤放线菌的分离及拮抗活性筛选

【目的】分析柽柳根际土壤放线菌物种多样性,研究其抗菌活性,为新疆主要农牧业病害的防控奠定菌种基础。【方法】选择新疆南疆地区10种柽柳根际土壤的放线菌资源,采用四种培养基,通过菌株16SrDNA测序,采用平板对峙法筛选抗菌活性。【结果】分离出294株菌株,鉴定的150株,分属于7个纲12个目16科24个属,另有9个潜在新种,以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、解淀粉欧文氏菌、伤寒沙门氏菌、白色念珠菌、链格孢菌、棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌为靶标菌。【结论】筛选出68株活性放线菌。柽柳根际土壤放线菌的分离丰富了微生物资源及菌种的储备。     

洋葱内生菌的筛选及其次级代谢产物分析

通过组织块分离法、梯度稀释涂布法和划线分离法,从健康紫皮和白皮洋葱中筛选得到内生菌,采用平板对峙培养法测定其对10株供试指示菌的抑菌活性,再以洋葱提取液为对照,对各拮抗菌株的发酵液进行薄层层析和高效液相色谱分析。结果表明,从2种洋葱中共筛选出87株内生菌,其中内生细菌68株,内生放线菌3株,内生真菌16株。通过抑菌试验,发现12株内生细菌对3至9种指示菌具有抑菌活性,占分离菌株总菌数的23.08%,其中YD–21、YD–23、YD–26、YD–27、YD–32、YD–38、YD–37、YD–22共8株菌株的抗菌谱较广,对9种供试指示菌均具有抑菌活性。薄层层析检测结果表明,菌株YD–27发酵产物在Rf值为0.73处有与洋葱提取液层析带迁移率相同的显色带,液相色谱分析结果表明其属于黄酮类物质。菌株YD–27能发酵产生黄酮类或产生与黄酮类类似的化合物,表明洋葱内生菌具有合成黄酮类次级代谢产物药物的潜力。     

元江芦荟根际放线菌的分离与鉴定

开展元江芦荟根际放线菌的研究,为促进元江芦荟的生长及品质的改良提供理论基础。采用涂布平板法对芦荟根际放线菌进行分离纯化,再对纯化的放线菌进行形态显微结构观察、生理生化及系统发育树构建分析。结果表明,从元江芦荟根际土壤中共分离鉴定出3株放线菌,属于链霉菌属的小链霉菌(Streptomyces parvus)、早期链霉菌(Streptomyces praecox)及克兰斯基链霉菌(Streptomyces krainskii)。研究结果将为芦荟病害的生物防治提供应用资源。     

一株辣椒内生拮抗放线菌的筛选及初步鉴定

为筛选防治辣椒土传病害的优良生防菌种资源,从多年连作重茬的辣椒健康植株根系内分离到一株内生拮抗放线菌PES-A23。研究结果表明:该菌株抗菌谱较广,对辣椒疫霉菌、辣椒炭疽病菌、辣椒镰刀枯萎病菌、油菜菌核病菌、香梨腐烂病菌、水稻稻瘟菌、白色假丝酵母、金黄色葡萄球菌均具有显著抑制效果,通过16s rDNA测序、进化树分析初步鉴定为鲤链霉菌(Streptomyces carpaticus)。     

木薯根际放线菌的分离鉴定及其抑菌活性分析

通过涂布平板法,对木薯根际土壤样品进行放线菌的分离培养和筛选,得到2株拮抗尖孢镰刀菌古巴专化型4号小种的放线菌(MS13、MS14)。形态特征观察、生理生化特性检测、16S rDNA序列分析等结果表明,菌株MS13属于细链孢菌属(Catenulispora),菌株MS14属于链霉菌属(Streptomyces)。皿内抑菌试验表明,菌株MS13、MS14对11种病原菌中的多数皆有较好的拮抗作用,具有较好的抑菌广谱性;但它们对不同属或同一属不同种靶标菌的抑菌效果各不相同,又具有明显的抑菌特异性。     

柑橘溃疡病生防内生细菌的筛选、鉴定及其活性代谢产物的稳定性

通过皿内检测和离体叶片法筛选到一株柑橘溃疡病生防内生细菌GN232,对其进行了分类鉴定,并对其抗细菌活性代谢产物的特性进行了研究。形态特征、培养特性、生理生化特性和16S rDNA序列分析表明,该内生细菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis);发酵滤液活性测定结果表明,菌株GN232抗细菌活性代谢产物在中性环境下稳定,对温度不敏感,紫外线照射25 min后发酵滤液抑菌活性降低,胰蛋白酶对发酵滤液活性无明显影响;此外,该菌株发酵上清液和农用链霉素混用后对溃疡病菌的抑制效果较单独发酵滤液、农用链霉素的抑菌效果分别提高26.8%和20.7%。     

植物根际微生物次级代谢产物研究进展

植物根际是微生物生长的特殊微生态环境,根际微生物在种类和数量上不同于非根际微生物。近年来,通过根际微生物途径分离到一些活性物质,其中有一些新结构化合物,并在多方面具有较高生物学活性。植物根际微生物是一类值得深入研究与开发的微生物资源。     

人参根际防病促生放线菌的筛选及其活性

为开发防病促生生物菌肥种质资源,采用对峙培养法从人参根际土壤中分离具有拮抗植物病原真菌活性的放线菌,鉴别培养基筛选,结合分光光度计法,定性定量测定其产吲哚乙酸(IAA)、溶磷和产铁载体等促生活性,并对该放线菌进行生理生化和分子鉴定。结果表明,获得1株具有较强植物病原真菌拮抗活性的放线菌菌株,与淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)的亲缘关系最近,将其命名为淡紫灰链霉菌菌株DC-A;同时该菌具有较强的产IAA、溶磷和产铁载体促生活性,可以为后续防病促生菌剂的研制提供新的材料。     

苦苣菜内生菌的筛选及其次级代谢产物分析

为开发陕北野生苦苣菜内生菌资源,发现潜在药用活性成分和新的医药先导化合物。以苦苣菜健康植株的根、茎、叶为材料,采用平板对峙培养法测定其对11株供试指示菌的抑菌活性,以苦苣菜提取液为对照,对各拮抗菌株的发酵液进行薄层层析、硅胶柱层析和高效液相色谱分析。从中共筛选出95株内生菌,通过抑菌试验发现其中20株对1种或多种指示菌具有抑菌活性,占分离菌株数的21.05%,其中UG-004、UG-036、UY-085、CY-009、CJ-014、CG-033和CG-035 7株具有较强谱抑菌活性。薄层层析检测结果表明,菌株CG-035的发酵产物在R_f为0.35处有与苦苣菜提取液的层析带迁移率相当的显色带。并通过高效液相色谱分析确定其主要成分为黄酮类物质。菌株CG-035能发酵产生黄酮类或其类似化合物,表明苦苣菜内生菌在次级代谢产物方面具有研究潜力,这为内生菌在微生物药物研究方面提供了理论依据。     

1株高活性三尖杉内生真菌的筛选及代谢产物

为了获得抗菌活性较好的菌株,以9种植物病原真菌为指示菌,采用滤纸片法对分离自三尖杉茎、叶、种皮的61株内生真菌进行抗菌活性研究,分离得到抗真菌活性物质并对菌株发酵液的乙酸乙酯提取部分进行化学成分预试验.结果表明:筛选出1株高活性菌株Se01,经形态学鉴定和18S rDNA序列分析,确定为曲霉属(Aspergillus piperis),其代谢产物主要有生物碱、甾体、萜类、有机酸、内酯、蒽醌类、氨基酸、糖等成分.这些物质大多有较强的活性,能为植物抗病提供来源.     

水稻根际促生菌的筛选鉴定及促生能力分析

植物根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR）可分泌植物生长激素,促进土壤养分循环,是生物肥料重要的种质资源。本文从水稻根际土壤分离纯化根际促生菌,进行菌株鉴定,测定其促生能力。经过16S rDNA测序比对,筛选得到解磷菌4株（Bacillus pumilus LZP02,Bacillus aryabhattai LZP08,Staphylococcus epidermidis LZP10,Bacillus ginsengisoli LZP05）,溶磷菌3株（Bacillus megaterium LZP03,Bacillus oryzaecorticis LZP04,Bacillus ginsengisoli LZP07）,解钾菌3株（Bacillus aryabhattai LZP01,Bacillus subtilis LZP06,Bacillus licheniformis LZP09）。养分转化能力测试结果表明,Bacillus aryabhattai LZP01和Bacillus subtilis LZP06解钾能力较好;Bacillus pumilus LZP02和Bacillus huizhouensis LZP05解磷能力较强;Bacillus megaterium LZP03和Bacillusginsengisoli LZP07溶磷能力较好。对养分转化能力较强的菌株进行激素分泌能力测定,结果表明6种菌株均能产生生长素、赤霉素,均具有合成铁载体的能力。综合分析菌株养分转化与激素分泌能力发现,Bacillus megaterium LZP03、Bacillus huizhouensis LZP05和Bacillus subtilis LZP06促生能力较强,具有较强的开发利用潜力。研究成果为水稻微生物肥料的开发与生产提供了理论和技术支持。     

角果木内生真菌代谢产物的分离鉴定

通过多种色谱分离方法对角果木根部真菌Fusarium sp.JG13代谢产物的化学成分进行研究,从其发酵液中分离得到6个化合物,利用波谱等方法分别鉴定为Sorbicillin(1),2′,3′-Dihydrosorbicillin(2),Sohirnone A(3),5′-hydroxyprenyl salicylate(4),N-(2-Hydroxyphenyl)-acetamide(5),2-(E-3-heptneyl)-3,6-dihydroxy-5-(3-methyl-2-butenyl)benzaldehyde(6).所有化合物均为首次从角果木真菌发酵产物中分离得到.     

核桃内生放线菌的分离、鉴定及抗菌活性

分别从生长于云南楚雄的核桃根、茎、叶中分离内生放线菌,并对分离菌株进行纯化、保存。通过对分离菌株生长特性、形态观察、分子分类等研究,对菌株进行初步鉴定与抗菌活性研究。结果表明,共分离得到42株内生放线菌,其中从根中分离11株、从茎中分离12株、从叶中分离19株,分离菌株均属于链霉菌属。试验内生放线菌菌株SA8对拟盘多毛孢、链格孢、德氏孺孢、灰葡萄孢、疫霉这5种病原菌均有抑菌作用。     

油茶根际土壤解磷菌的筛选、鉴定及培养条件

从油茶根际土壤中分离筛选出7株溶磷细菌,根据透明圈法和钼锑抗比色法综合分析,最终得出菌株4-Y-06溶磷活性最强。通过菌落形态特征、生理生化特征、16S r DNA序列和系统发育分析等研究,初步鉴定菌株4-Y-06为嗜气芽孢杆菌。同时,研究了不同碳源、氮源、C/N、p H、以及温度等不同培养条件对菌株4-Y-06溶磷效果的影响。结果表明:解磷菌4-Y-06在碳源为蔗糖、氮源为硫酸铵、C/N为40:1、p H 7.0~7.5、30℃条件下解磷效果最好。     

两株放线菌次生代谢产物的分离和鉴定

通过对两株放线菌的菌落形态特征、培养特征及16S rDNA序列分析,将菌株TRM 46399、TRM 44550分别鉴定为Streptomyces xinghaiensis S187(T)(相似度为98.16%)和Streptomyces enissocaesilis(相似度为100%)。链霉菌TRM46399和TRM44550的发酵产物经D101大孔树脂富集,硅胶柱色谱、凝胶柱色谱等方法进行分离,得到三个单体化合物;利用~1H NMR和~(13)C NMR数据解析,分别鉴定为染料木素、β-腺苷和大豆苷元。     

再生稻根际促生菌的分离、筛选与鉴定

[目的]对再生稻根际土壤开展根际促生菌的分离、筛选与鉴定,为开发和生产促进再生稻腋芽萌发的微生物肥料提供资源和技术支持.[方法]采用稀释分离法从再生稻根际土壤中分离根际促生菌,以无菌培养基处理为对照,通过盆栽试验筛选具有促进再生稻腋芽萌发生长作用的根际促生菌,并进行促生菌株的16S rDNA鉴定和促生活性测定.[结果]从再生稻根际土壤中分离获得4株菌株(ZSD1、ZSD2、ZSD3和ZSD4),革兰氏染色结果表明,ZSD1菌株为革兰氏阴性菌,ZSD2、ZSD3和ZSD4菌株为革兰氏阳性菌.再生稻促生盆栽试验结果显示,ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株具有促生能力,与对照相比,ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株处理的再生稻分蘖数分别多61.76%、45.59%和102.94%,单株产量分别为13.17、11.68和16.83 g,分别比对照提高66.08%、47.29%和112.23%,差异达显著水平(P<0.05),ZSD3菌株的促生效果最佳,其次为ZSD1菌株.促生活性测定结果显示,ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株均具有解磷、解钾、固氮和产生长素(IAA)的能力,其中解磷和产IAA能力排序为ZSD1菌株>ZSD2菌株>ZSD3菌株,固氮和解钾能力排序为ZSD3菌株>ZSD1菌株>ZSD2菌株.16S rDNA序列比对结合形态生物学分析结果表明,ZSD1菌株为沙雷氏菌(Serratia),ZSD2菌株为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis),ZSD3菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).[结论]分离筛选出的ZSD1、ZSD2和ZSD3菌株具有较强的促进再生稻腋芽生长效应,以ZSD3菌株的促生能力最强,可为今后开发再生稻生物菌肥提供菌种资源.