油棕病毒诱导的基因沉默体系的建立及优化

为开展油棕油脂代谢调控相关基因鉴定研究,以油棕八氢番茄红素脱氢酶基因（phytoene desaturase gene,PDS）作为报告基因,探索以病毒载体TRV为载体在油棕胚状体上应用病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）的可能性,并对油棕胚状体VIGS体系的相关参数进行优化。结果显示：以EHA105为菌种、侵染菌液OD600=0.5、侵染时间5 min、乙酰丁香酮（AS）质量浓度20 mg/L、共培养48 h、侵染后培养时间为12 d能取得最佳的基因沉默效果。在此基础上,利用优化后的VIGS体系对油棕二酰甘油酰基转移酶基因（diacylglycerol acyltransferase gene,DGAT）进行沉默,取得了预期的基因沉默效果。     

棉花病毒诱导基因沉默体系构建

探索了病毒诱导基因沉默载体在棉花上的应用,由烟草脆裂病毒(TRV)改造的pTV00载体,构建了棉花标记PDS基因病毒诱导基因沉默的载体,成功建立了棉花病毒诱导基因沉默体系。     

病毒诱导的基因沉默

    "病毒诱导的基因沉默"(virus-induced gene silencing,VIGS)一词最早用于描述被病毒侵染的植物的"恢复"现象,是一种植物抗病毒侵染的自然机制,现在已被开发成通过插入目的基因片段的重组病毒抑制植物内源基因表达的遗传技术,用于基因功能分析VIGS由小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)驱动,siRNA单链与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex,RISC)结合后,特异性地和与siRNA同源的靶标RNA结合,并降解RNA模板已有源于15种不同类型病毒的VIGS载体得到开发和应用在VIGS栽体中插入的目的片段、重组VIGS病毒载体的植物导入方法、沉默处理时的寄主生育期、沉默处理后的植物培育条件等均显著影响VIGS的效率作为一种新型的基因鉴定和功能研究技术工具,VIGS具有无需事先知道目的基因全长序列、获取表型迅速、无需构建转基因植株等诸多优点,已越来越广泛地被应用于植物基因功能研究     

辣椒病毒诱导基因沉默接种方法的优化

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,简称VIGS)技术在候选基因功能验证方面起着非常重要的作用。以辣椒八氢番茄红素脱氢酶基因(简称PDS)为目标基因,分析表达载体转化农杆菌的菌液在LB液体培养基和诱导培养基(IM)中D600 nm值的变化趋势。结果表明,当LB液体培养基中菌液D600 nm值为1.15时,后续利用IM培养菌液的效率最高,PDS基因沉默效果明显;优化了农杆菌接种方法,可为辣椒利用VIGS技术进行候选基因的功能验证提供参考。     

病毒诱导基因沉默的研究进展

对病毒诱导的基因沉默(VIGS)的发现、载体的开发、作用机理和优势的研究,以及VIGS在植物基因功能鉴定上的应用和展望进行了综述.     

病毒诱导的基因沉默技术研究进展

病毒诱导的基因沉默技术(VIGS,Virus-induced gene silencing)是一种重要的生物技术,本文详细总结了VIGS技术的原理及发展、病毒载体的演化及其在植物抗病基因功能中的应用等方面的研究进展.     

利用病毒诱导的基因沉默技术沉默TSWV的NSm基因

【目的】番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)在全球范围内严重危害农业生产,病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术主要用于植物内源基因的功能研究,而其沉默植物外源病毒基因用于病毒防控鲜有报道。本研究利用VIGS技术在辣椒中沉默植物外源病毒TSWV的NSm基因,为辣椒产业防控TSWV病害奠定技术基础。【方法】以辣椒(Capsicum annuum L.)为研究材料,首先构建辣椒PDS基因的沉默载体pTRV2-PDS以评估该沉默载体在辣椒中的有效性,再构建TSWV NSm基因的沉默载体pTRV2-NSm评估该沉默载体对TSWV NSm基因的沉默效果。【结果】构建的沉默载体pTRV2-PDS在辣椒中有效,沉默载体pTRV2-NSm可以高效沉默TSWV的NSm基因,NSm的表达量仅为对照组的4.6%,且表现出对TSWV的抗性。【结论】构建的沉默载体pTRV2-NSm可以沉默TSWV的NSm基因,并使辣椒对TSWV产生一定的抗性。     

茄子高频再生体系的建立与优化

为建立并优化茄子高频再生体系,研究以茄子品种哈农杂茄2号和哈农杂茄3号为材料,利用不同的外植体和植物生长调节剂组合,探讨影响茄子再生频率的主要因素。结果表明:茄子最佳再生子叶最适分化培养基为MS 0+6-BA 1mg·L-1+KT 2mg·L-1;下胚轴最适分化培养基为MS 0+KT 2mg·L-1,再生苗最佳生根培养基为1/2MS+IAA 0.1mg·L-1,且下胚轴的分化效率高于子叶。     

茄子AFLP技术体系的优化与建立

以12个不同的茄子(Solanum melongena L.)高代自交系为试材,通过对AFLP反应体系中的几个关键因素进行优化,建立了适宜茄子的AFLP体系.结果表明,酶切基因组DNA适宜用量为100ng,酶切-连接适宜时间为10 h,预扩增产物适宜稀释倍数为30～50倍.     

茄子AFLP技术体系的优化与建立

以12个不同的茄子(Solanum melongena L．)高代自交系为试材,通过对AFLP反应体系中的几个关键因素进行优化,建立了适宜茄子的AFLP体系。结果表明,酶切基因组DNA适宜用量为100ng,酶切一连接适宜时间为10h．预扩增产物适宜稀释倍数为30—50倍。     

茄子RAPD分子标记体系的建立与优化

采用改良的CTAB法提取茄子基因组DNA,并通过单因素多水平梯度试验,比较筛选RAPD扩增体系的各影响因素,建立了茄子RAPD-PCR的最佳反应体系:20μL反应体系其中含25 mmol/L MgCl2 2.0μL1、0×PCR Buffer 2.0μL、10mmol/L dNTP 0.5μL5、U/μL Taq E 0.2μL0、.1μmol/L Primer 3μL1、0 ng/L模板DNA 3μL、灭菌双蒸水9.3μL。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,37℃退火1 min7,2℃延伸1.5 min4,5个循环;72℃延伸10 min后4℃保存。     

茄子IRAP分子标记体系的建立与优化

为确保茄子 IRAP 反应结果的稳定性和重复性.进而为茄子遗传多样性分析和品种鉴定提供可靠的新方法,按照已报道的马铃薯和烟草的反转录转座子 LTRs 保守区域设计 IRAP 引物,以茄子品系HL-01 为试材,对影响茄子 IRAP 反应的重要因素进行了初步研究,建立并优化了茄子 IRAP 分子标记技术体系.优化的茄子 IRAP 分子标记体系为20 (1反应液中,10×反应 bufrer (100mmol/L Tris-HCl,100mmol/L KCl,80mmol/L (NH4)2SO4,pH9.0,NP-40)2μl,2mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTPs,Taq 酶1.0U,0.4μ mol/L 引物,DNA 模板 50ng.PCR 反应程序为94℃预变性 4min,然后按 94℃变性 30s,45℃退火 30s,72℃延伸 2min,进行32个循环,最后72℃延伸 10min.     

苏麦3号小麦穗部病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系的建立及验证

为了探讨利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系在小麦穗部进行基因沉默的可行性,用大麦条纹花叶病毒诱导苏麦3号小麦穗部PDS基因的转录后沉默,再接种禾谷镰刀菌进行抗性鉴定。结果表明,与接种空载BSMV∶00的对照相比,接种BSMV∶PDS的小麦穗中PDS基因表达量下调了77%(P0.05)。接种BSMV∶00的小麦穗受到赤霉病菌侵染后,穗部平均病小穗数和DON毒素含量分别为2.75个和4.55μg/g,与接种无菌水对照无显著差异(P0.05)。说明在苏麦3号穗部VIGS系统中,通过接种病毒能使靶标基因沉默;接种赤霉病菌后,苏麦3号病小穗数和DON毒素含量不受接种病毒的影响,对赤霉病菌的抗性保持不变,建立的VIGS体系可以应用于小麦赤霉病抗性候选基因的功能分析。     

茄子转录因子分子标记体系的建立与优化

为确保茄子转录因子分子标记反应结果的稳定性和重复性,根据辣椒WRKY转录因子设计引物,以茄子品系ETC3-02为试材,对影响茄子转录因子分子标记反应的重要因素进行初步研究,建立并优化茄子转录因子分子标记技术体系。优化的茄子转录因子分子标记体系在20μL的反应体系中：1.0×buffer,1.5mmol/L MgCl2,0.4mmol/L dNTPs,1.0UTaq DNA聚合酶,2.5μmol/L GIIF上游引物,1.0μmol/LWSR下游引物,DNA模板50ng。     

病毒诱导基因沉默在蔬菜作物上应用的研究进展

近年来,病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术作为一种研究植物基因功能的反向遗传学手段,因其构建简易、成本低、周期短等优势在功能基因组领域的研究更为广泛和深入.在蔬菜作物生长发育、逆境胁迫、物质合成和代谢调控等相关基因功能的研究中,VIGS 作为一种快速、高效、高通...     

TRV介导的大豆基因瞬时沉默体系的建立

【目的】病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术已在植物基因功能研究领域得到广泛应用。建立以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,为将烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默技术在大豆与大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）互作体系中对大豆基因功能进行研究提供基础。【方法】从大豆品种冀豆7号（J7）叶片中特异性扩增八氢番茄红素脱氢酶基因（GmPDS）的部分片段,并将该基因片段插入质粒pTRV﹕RNA2中;向J7的第一位真叶注射携带有TRV或TRV﹕GmPDS的农杆菌,注射后对上部未接种病毒的叶片进行表型观察,并通过半定量RT-PCR检测GmPDS的表达量。为探讨接种TRV是否影响大豆对SMV的抗性表现,在大豆第一片真叶上预接种TRV病毒后10 d,再分别接种SMV株系N3和SC-8,以单独接种N3或SC-8作为对照。待接种SMV后第5天观察未接种的上位叶表型并检测SMV的外壳蛋白基因CP。【结果】大豆叶片注射携带有TRV﹕GmPDS的农杆菌后25 d,上部未接种病毒的叶片出现了白化现象,通过半定量RT-PCR分析,发生白化的植株中GmPDS的表达量明显降低。在此基础上,向大豆叶片预注射携带有TRV的农杆菌后再接种SMV,SMV株系N3和SC-8与J7分别组成不亲和与亲和组合。 发现J7第一片真叶上预接种TRV后再接种SMV株系N3,与单独接种N3对上位叶的影响在表型上表现一致,对未接种的上位叶片进行病毒外壳蛋白基因CP检测,发现J7单独接种N3以及预接种TRV后再接种N3的上位叶片上均未能检测到CP表达。而J7单独接种SMV株系SC-8,以及预接种TRV后再接种SC-8均在上位叶上能够检测到CP。说明在J7上预接种TRV不影响J7对SMV的抗性。在感病品种南农1138-2上也获得了相似结果。【结论】建立了以TRV为载体介导的大豆基因瞬时沉默体系,并证明在大豆上先接种TRV不改变大豆对SMV的抗性表现。     

病毒诱导的基因沉默技术在双子叶植物中的应用研究进展

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)是能够快速鉴定基因功能的反向遗传学重要方法之一,是一种RNA水平转录后的基因沉默现象。因其具有试验周期短、操作方法简单、成本低、效率高、获得表型快以及高通量等优点,被大量运用于植物基因功能研究中。阐述了VIGS技术的作用机制,综述了VIGS技术在茄科、豆科、蔷薇科、葫芦科、锦葵科和菊科等双子叶植物中的应用及存在的问题,对前景进行展望,为进一步拓展VIGS的应用提供参考。     

病毒诱导基因沉默对叶用莴苣内源激素含量的影响

[目的]探明叶用莴苣在受到病毒诱导的基因沉默后,脱落酸、生长素、茉莉酸、赤霉素四种内源激素含量作何变化.LsZFP1在叶用莴苣中行使的功能.[方法]叶用莴苣'PS-11'为材料,经病毒诱导LsZFP1基因沉默后,采用酶联免疫法测定叶用莴苣内源激素的含量变化.[结果]携带LsZFP1基因的病毒载体(TRV-LsZFP1)处理的植株中脱落酸含量为406.58μg/L,空载(TRV)处理植株中脱落酸含量为329.47μg/L,空白对照含量为284.69 μg/L,TRV-LsZFP1处理植株与空白对照植株相比脱落酸含量增加了42％.TRV-LsZFP1处理植株茉莉酸含量为1311.92 μg/L,空白对照为946.72 μg/L,显著增高了365.2 μg/L,叶中生长素含量为93.04 μg/L,略高于空白对照;TRV-LsZFP1处理植株中赤霉素含量为460.39μg/L,相比空白对照下降了39％左右.[结论]叶用莴苣经VIGS处理后,受侵染植株中脱落酸、茉莉酸、生长素三种激素较空白对照含量上升,赤霉素和空白对照相比含量下降,4种内源激素含量较空白对照均有变化,表明叶用莴苣受病毒侵染受伤后,通过调节内源激素含量来适应胁迫.     

茄子遗传转化体系的建立

三月茄下胚轴外植体在含1mg/L ZT和1mg/L-3mg/L BA的MS培养基上芽再生率可达70％以上。150mg/L的卡那霉素可以有效地抑制三月茄下胚轴产生愈伤组织、诱导出不定芽和根。200mg/L-300mg/L氨苄青霉素或羧苄青霉素能够完全抑制农杆菌的生长。通过农杆菌介导,获得了表达绿色荧光蛋白基因（gfp)的转基因茄植株。     

在中国大豆品种上创建ALSV诱导的基因沉默体系

【目的】在中国大豆品种上建立以苹果潜隐球形病毒（apple latent spherical virus,ALSV）为载体的基因沉默体系,为中国大豆品种的基因功能和遗传育种提供一种简便、省时、易操作的技术体系。【方法】构建以农杆菌介导接种的ALSV病毒侵染性克隆载体。从大豆品种威廉姆斯82（Williams 82）中特异扩增327 bp的八氢番茄红素脱氢酶（GmPDS）基因cDNA片段,插入病毒载体pALSV2。通过农杆菌浸润法将病毒载体导入模式植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）,17 d后富集病毒粒子,摩擦接种大豆第一轮真叶,以接种病毒空载作为对照组,持续观察测试大豆植株系统叶表型,并结合逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）或荧光定量PCR（qRT-PCR）检测ALSV衣壳蛋白基因（CP）和GmPDS的表达水平。【结果】ALSV﹕GmPDS接种大豆品种威廉姆斯82和南农1138-2,20 d后,前者系统叶未见白化表型,而后者系统叶出现明显的白化表型;qRT-PCR检测结果表明,发生白化的南农1138-2植株中GmPDS的表达水平显著降低,未出现白化表型的威廉姆斯82中GmPDS的表达水平没有出现显著变化。在此基础上,采用相同的方法,测试了ALSV在其他9种大豆品种中诱导GmPDS的沉默效率,发现在南农47、安豆203、祥斗4号、中黄13、山宁29、齐黄34等大豆品种上接种ALSV﹕GmPDS后植株系统叶均产生白化表型,而菏豆12、中黄311和山宁16等3个品种的GmPDS均不能诱导有效沉默。【结论】构建了农杆菌介导的ALSV病毒载体,利用本氏烟扩繁富集ALSV病毒,将提纯的病毒粒体摩擦接种大豆真叶,在多个中国大豆品种上成功建立了基因沉默体系。