丝瓜LcPPO1基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

[目的]通过CRISPR/Cas9系统构建丝瓜LcPPO1基因编辑载体.[方法]根据前期已经克隆得到的LcPPO1基因序列,设计2个sgRNA靶位点序列,退火制备sgRNA双链,分别与线性PCA1301-Cas9载体连接获得2个重组载体,将重组载体转化DH5α感受态细胞,再对其进行PCR鉴定及测序比对分析.[结果]2个sgRNA靶位点序列已经分别准确地连入PCA1301-Cas9载体,插入序列无突变.[结论]成功构建了丝瓜LcPPO1基因编辑载体PCA1301-Cas9-sgRNA1和PCA1301-Cas9-sgRNA2,为后续研究丝瓜LcPPO1基因功能奠定了基础.     

罗汉果SgARF9基因克隆及其CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

[目的]研究SgARF9基因与罗汉果果实发育的关系。[方法]在转录组Unigene序列基础上,对罗汉果SgARF9基因进行克隆,并结合CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建以SgARF9为靶基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体。[结果]克隆得到SgARF9基因序列,且成功构建包含SgARF9基因靶点的编辑载体。[结论]该研究为揭示SgARF9基因的分子生物学功能,明确其在罗汉果果实起始发育中的遗传调控机制提供了基础。     

利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑水稻基因

以现有水稻CRISPR/Cas9载体系统为起点,优化改造了相应的载体及其构建方法,实现了两步法构建基因敲除载体。利用新的载体和方法,针对水稻日本晴(Oryza sativa L.spp.Japonica cv.Nipponbare)D3基因的3个靶向位点分别构建了相应的CRISPR/Cas9载体,并通过农杆菌介导的遗传转化成功获得一系列转基因植株。T_0代转基因植株靶位点测序结果显示,靶位点DDRC1包括5种突变类型,植株的突变率为35.48%;靶位点DDRC2包括5种突变类型,植株的突变率为25.00%;靶位点DDRC3包括1种突变类型,植株的突变率为20.00%。利用T_1代纯合突变植株,进一步研究了所得纯合突变体的株高、分蘖数表型与CRISPR/Cas9编辑后基因型之间的关系,探讨了CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率、位置效应和突变类型等特点,为进一步利用CRISPR/Cas9系统发展具有不同农艺性状的水稻种质材料提供了参考。     

小麦Pinb基因启动子区CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术已经逐渐成熟并在多种植物中得到成功应用,促进了基因功能的研究。小麦籽粒硬度是决定小麦加工品质的重要性状,Pinb是控制籽粒硬度的关键基因之一。本研究以小麦Pinb基因为对象,联合采用常规PCR和Golden Gate cloning技术,构建了包含小麦Pinb基因启动子区双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体。将重组载体转入小麦原生质体中进行sgRNA活性的检测,在两个靶点位置均发生了突变,编辑效率分别为4. 57%和4. 37%,基因编辑类型包括碱基替换和碱基缺失。该研究为在小麦中实现Pinb基因的定点突变奠定了基础,对其功能研究和小麦品质改良均具有重要意义。     

一种玉米CRISPR/Cas9载体的构建

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9系统由于其突变效率高、制作简单、成本低,被越来越广泛地应用于植物基因组的精确修饰,是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。本研究构建了玉米淀粉合成酶调控因子基因ZmRSR1的CRISPR/Cas9载体系统,为在玉米中实现该基因的定向突变奠定了坚实基础,同时也为玉米基因组的定点突变修饰提供了重要参考。     

棉花GhPAO3基因的CRISPR/Cas9表达载体的构建

【目的】研究棉花GhPAO3基因的功能,通过CRISPR/Cas9技术构建棉花GhPAO3基因的基因编辑载体。【方法】筛选合适的两个PAM位点设计引物,在引物中添加接头,重叠延伸PCR,将两个靶标片段连接在一起。通过限制性核酸内切酶BsaⅠ对pRGEB32-7载体进行单酶切,使用一步法连接重叠延伸产物与线性化的pRGEB32-7载体。【结果】使用电击转化法将构建好的棉花GhPAO3基因的基因编辑载体转入农杆菌LBA4404感受态,通过卡那霉素筛选阳性单克隆菌株。【结论】条带大小与预期一致,棉花GhPAO3基因的基因编辑载体构建成功。     

通过CRISPR/Cas9技术打靶兔Myostatin基因

细菌和古生菌利用自身的获得性免疫系统(CRISPR)抵御外来侵略,使外源DNA降解。为了基因突变兔子成纤维细胞的Myostatin基因,研究构建了CRISPR和g RNA质粒,当Cas9与g RNA摩尔数之比分别为1∶2、1∶1时进行转染到兔子成纤维细胞中,结果显示有打靶效率差异,经过鉴定均有碱基突变。结果表明:利用(CRISPR/Cas9)系统可成功突变目的基因。     

拟南芥Ib bHLH家族基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

[目的]全氟辛酸(PFOA)处理能显著诱导拟南芥Ib bHLH(Ib basic helix-loop-helix)家族4个转录因子bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101的转录水平。为了进一步分析这4个基因在响应PFOA中的潜在作用,利用CRISPR/Cas9技术构建了它们的共敲除载体。[方法]以野生型拟南芥基因中的外显子为模板,设计引物,通过两步PCR扩增法将靶向基因连接到CRISPR/Cas9载体上;将构建成功的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,挑取阳性菌落,PCR鉴定正确后,将其质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中,再次挑取阳性菌落进行PCR鉴定正确后,提取质粒进行表达盒测序。[结果]通过两步PCR扩增法,成功将4个靶点表达盒转入到CRISPR/Cas9载体中,构建了bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101的双元CRISPR/Cas9敲除载体。[结论]成功构建的Ib BHLH家族CRISPR/Cas9敲除载体,为后续拟南芥Ib BHLH家族四突突变体材料的获得提供了可用性载体。     

红麻miR394基因的克隆及CRISPR/Cas9载体构建

为探明miRNA在红麻中的功能,以红麻基因组DNA为模板,根据红麻microRNA(miRNA)高通量测序数据结果,克隆红麻miR394前体基因序列,并构建CRISPR/Cas9载体。结果表明红麻miR394前体基因序列大小为175bp,用Mfold在线软件分析,其前体序列能形成稳定的二级结构。根据红麻miR394前体基因序列,设计合适的CRISPR/Cas9靶标序列,利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以AtU3b和AtU6-29质粒为模板,使用Overlapping PCR法构建AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒,使用Golden Gate Cloning方法成功把靶标AtU3b-sgRNA和AtU6-29-sgRNA表达盒构建到pYLCRISPR/Cas9载体中,并将构建好的载体命名为pCas9-miR394。分离红麻叶片原生质体,将pCas9-miR394载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:2个靶点Target site 1(T1)和Target site 2(T2)处都发生碱基突变,表明pCas9-miR394载体在红麻原生质体中具有靶向切割的活性。     

靶向敲除绒山羊lnc15479的CRISPR/ Cas9构建及活性验证

为研究生长期和休止期lnc15479的差异表达在陕北白绒山羊毛囊周期性发育中的作用及功能,利用CRISPR/Cas9技术,在lnc15479的上、下游各设计1个sgRNA靶位点,构建CRISPR/cas9表达载体;并基于SSA修复机制,分别构建含有红色和绿色荧光标记的双荧光报告载体系统。通过将表达载体和报告载体共同转染HEK293T细胞,检测该CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明,lnc15479的CRISPR/Cas9表达载体成功构建,根据红色和绿色荧光表达情况及细胞计数的方法,该系统的工作效率约为20%。研究结果为进一步分析lnc15479的功能提供技术支持。     

基于CRISPR/Cas9技术构建猪miR-136基因编辑载体

为了阐明microRNA对猪产仔数的调节机制,采用CRISPR/Cas9技术构建针对猪miR-136的基因编辑表达载体。通过实验,在miR-136基因成熟区及其下游设计两个单链引导RNA(sgRNA),合成4条磷酸化的单链DNA寡核苷酸,复性后形成两条带粘性末端的双链寡核苷酸片段,插入线性化的载体pX462的BpiI酶切位点处,转化感受态大肠杆菌DH5α,经测序确认,得到两个编辑表达载体pX462-miR-136-1和pX462-miR-136-2。构建了两个编辑miR-136基因的表达载体,为猪繁殖力的调控研究奠定了技术基础。     

牛肌肉生长抑制素基因敲除打靶载体的构建

【目的】构建两套用于牛肌肉生长抑制素（myostation,MSTN）基因敲除的置换型打靶载体。【方法】设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）以牛耳皮肤组织基因组DNA为模板分别扩增出两套打靶载体的同源短臂和长臂,再分别插入到两套打靶专用基础载体pMCS-PLP和PⅢ中,构建两套用于牛MSTN基因敲除的置换型打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN。【结果】经过PCR、T载体连接和DNA测序,证实载体pPLP-MSTN包含2.8 kb同源短臂和4.0 kb同源长臂,载体PⅢ-MSTN包含1.3 kb同源短臂和6.8 kb同源长臂;经过限制性内切酶酶切鉴定,证实两套载体的同源臂分别正确插入到基础载体内。【结论】两套牛MSTN基因敲除打靶载体pPLP-MSTN和PⅢ-MSTN构建成功,载体pPLP-MSTN为不含负筛选标记的传统基因敲除打靶载体,载体PⅢ-MSTN为不含负筛选标记的荧光蛋白启动子捕获打靶载体。     

花生FAD2基因CRISPR/Cas9多靶点敲除载体构建

ω-6脂肪酸脱氢酶控制花生中油酸向亚油酸的转化,该酶由AhFAD2基因编码。为了研究AhFAD2基因的功能,本研究根据前期已经克隆得到的AhFAD2基因序列,设计了gRNA前导序列,并构建了CRISPR/Cas9基因编辑载体,通过双酶切和Sanger测序确定载体构建成功。AhFAD2基因CRISPR/Cas9载体的构建为接下来的遗传转化及研究该基因的功能奠定了基础。     

靶向切割猪Y染色体的CRISPR/Cas9载体构建及功能验证

【目的】通过CRISPR/Cas9系统对Y染色体多位点切割,实现目标染色体的敲除,为畜禽性别控制提供新的手段。【方法】以CRISPR/Cas9技术为基础,寻找Y染色体上能被sgRNA特异性识别的多拷贝重复序列,并通过体外切割、定量分析、核型鉴定验证其对靶点的有效性。【结果】所设计的sgRNA能够在体外实现对靶片段的明显切割,且切割效率均达到了50%以上。基因的定量分析结果证明了其在细胞水平切割的有效性,且簇状重复序列切割效果明显优于散在重复序列;核型鉴定结果证实了细胞水平猪Y染色体的丢失。【结论】研究结果为后续构建染色体敲除猪,实现猪的性别控制奠定了基础。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)是近年发现的继ZFNs和TALENs两种基因编辑技术之后的一种新型基因组定点编辑技术。本研究分别从CRISPR/Cas9系统的结构、类别、作用机制、相关应用以及存在问题等方面进行综述,旨在为相关领域研究提供参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术综述

CRISPR/Cas9首次在细菌中被发现,是适应性免疫系统的一部分,现已广泛用于工程改造基因组中激活或抑制基因表达.同时,CRISPR/Cas9有望通过提供一种有效的技术来剖析癌症发生的机制,确定药物开发的靶标,并可能为基于细胞的疗法提供支撑以加速癌症的研究.对CRISPR/Cas9技术的发展历史和应用范围做了概述及展...     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻ospin9突变体

[目的]生长素输出载体蛋白(PIN-FORMED,PIN)是控制生长素极性运输的关键蛋白,水稻OsPIN9是单子叶植物特有的PIN基因,但其生物学功能仍有待研究.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsPIN9进行编辑,获得OsPIN9发生突变的基因编辑株系,对进一步深入研究OsPIN9功能提供依据.[方法]根据O...     

甘蓝型油菜BnaSDG8基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建及功能探究

以甘蓝型油菜‘湘油15号’为试材,通过生物信息学分析,运用CRISPR/Cas9系统对Bna SDG8第1个外显子上的Bna SDG8–A和Bna SDG8–C保守序列区域进行CRISPR/Cas9敲除位点设计,构建了CRISPR/Cas9敲除载体p CAMBIA1300–sg RNA/Cas9–Bna SDG8;通过遗传转化,获得转化植株19株;经测序比对,4株植株的Bna SDG8被成功编辑;通过对定向敲除植株开花时间的统计分析,初步确定Bna SDG8参与甘蓝型油菜开花时间的调控。     

花椰菜高效CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的构建

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在许多农作物上成功应用,实现了许多重要农艺性状的精准改良.本研究参考甘蓝型油菜(Brassica napus L.)遗传转化体系,以花椰菜(Brassica oleracea L.var.botrytis)育种材料'FQ-36'为受体,以花青素合成关键基因BoANS为目标基因,构建...     

靶向加工番茄elF4E1的CRISPR/Cas9载体有效性验证

【目的】验证基于CRISPR/Cas9系统构建的靶向编辑加工番茄(Solanum lycopersicum) eIF4E1基因载体的有效性,为CRISPR/Cas9系统在培育PVY抗性植株中的应用提供技术支持。【方法】构建靶向编辑番茄真核翻译起始因子elF4E1基因的CRISPR/Cas9系统表达载体,用农杆菌渗透法瞬时转化番茄植株,PCR扩增已转化植株靶位点周围DNA序列后用HaeⅢ进行酶切,回收未切开的条带与pGEM-T载体连接后进行单克隆测序。【结果】对测得的9个克隆序列进行比对分析,在PAM (protospacer adjacent motifs)上游的6~8 bp的碱基处均发生突变,并且都为单碱基的替换,导致多肽链中单个氨基酸的替换。【结论】利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建的载体能够特异性地靶向加工番茄eIF4E1基因,为利用CRISPR/Cas9系统敲除eIF4E1基因,获得抗PVY病毒的番茄育种材料奠定了基础。