对猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的佐剂作用

E515-A是一种含人参茎叶皂苷(GSLS)的白油佐剂。将E515-A和含猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原的水相在低剪切力(转速200 r·min^-1)下混合,形成油乳剂疫苗。为观察E515-A对PEDV灭活疫苗的免疫增强作用,将72只ICR小鼠随机分成6组,分别进行2次(间隔2周)皮下注射:(1)0.9% NaCl溶液,(2)PEDV抗原+0.9% NaCl溶液,(3)PEDV抗原+GSLS,(4)PEDV抗原+白油佐剂,(5)PEDV抗原+E515-A和(6)PEDV抗原+氢氧化铝铝胶。于一免后24 h采血检测血清IFN-γ水平和NK细胞杀伤活性;于二免后检测血清特异性IgG及IgG1和IgG2a水平,制备脾淋巴细胞检测细胞增殖能力。结果表明,E515-A对于PEDV疫苗诱导的免疫反应具有显著的促进作用,免疫增强效果优于铝胶佐剂。和对照组比较,E515-A油佐剂可以显著促进免疫小鼠的NK细胞杀伤活性,促进细胞因子IFN-γ的产生,增强脾淋巴细胞对刀豆蛋白A(Con A)和脂多糖(LPS)刺激的增殖应答能力,提高血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a水平。为增强猪的疫苗免疫效果,E515-A作为猪疫苗的佐剂值得进一步研究。     

猪细小病毒病、伪狂犬病二联灭活疫苗保存期试验

将试制的3批细小病毒病、猪伪狂犬病二联灭活疫苗(批号201601、201602和201603),置于2～8℃冰箱内保存,间隔3、6、9、12和15个月后,分别取出进行疫苗的性状和效力检验,以确定疫苗的稳定性和保存期。结果,疫苗经保存15个月后,物理性状符合现行《中国兽药典》标准;疫苗接种豚鼠进行猪细小病毒部分的效力检验,HI抗体效价均≥1:64,对照鼠HI效价≤1:8;疫苗接种猪伪狂犬病毒中和抗体阴性健康猪进行猪伪狂犬病毒部分效力检验,血清中和指数均≥316,表明接种猪能产生对猪伪狂犬病毒坚强免疫力。试验结果表明,疫苗于2～8℃保存15个月的过程中,稳定性良好,物理性状无变化,免疫效力未降低,保存期达到15个月。     

猪细小病毒病、伪狂犬病二联灭活疫苗保存期试验

将试制的3批细小病毒病、猪伪狂犬病二联灭活疫苗(批号201601、201602和201603),置于2～8℃冰箱内保存,间隔3、6、9、12和15个月后,分别取出进行疫苗的性状和效力检验,以确定疫苗的稳定性和保存期。结果,疫苗经保存15个月后,物理性状符合现行《中国兽药典》标准;疫苗接种豚鼠进行猪细小病毒部分的效力检验,HI抗体效价均≥1:64,对照鼠HI效价≤1:8;疫苗接种猪伪狂犬病毒中和抗体阴性健康猪进行猪伪狂犬病毒部分效力检验,血清中和指数均≥316,表明接种猪能产生对猪伪狂犬病毒坚强免疫力。试验结果表明,疫苗于2～8℃保存15个月的过程中,稳定性良好,物理性状无变化,免疫效力未降低,保存期达到15个月。     

猪IL-18增强猪细小病毒灭活疫苗猪体细胞免疫效果的研究

为了研究猪白细胞介素18是否增强猪细小病毒(PPV)灭活疫苗在猪体免疫效果,分别将猪白细胞介素18与自制猪细小病毒灭活疫苗和猪细小病毒灭活疫苗联合免疫仔猪,并设猪白介素18和生理盐水对照组。免疫后分别用间接ELISA方法和流式细胞技术检测仔猪抗体水平变化和仔猪外周血T淋巴细胞亚群动态变化。结果显示,免疫后猪白细胞介素18联合灭活疫苗组抗体水平与无猪白介素18灭活疫苗组相似,但免疫后猪白介素18联合PPV灭活疫苗组的CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+T淋巴细胞所占比值均高于相应的PPV灭活疫苗组,但差异不显著,且CD4~+/CD8~+在正常范围内。研究证实猪白介素18主要增强PPV油乳剂灭活疫苗的细胞免疫应答。     

猪圆环病毒2型和猪细小病毒混合感染的PCR检测

2012年9月河南省新乡市某养猪场发生一例以初产母猪流产、死产,断奶仔猪精神沉郁、呼吸困难、食欲不振、轻微腹泻、渐进性消瘦为特征的疾病。采用PCR技术进行检测,结果表明猪圆环病毒2型和猪细小病毒均为阳性,结合发病情况、临床症状及剖检变化,初步确定为PCV2和PPV混合感染。     

免疫增强剂对猪伪狂犬灭活疫苗的免疫增强作用

为了评价免疫增强剂VA5对猪伪狂犬病毒灭活疫苗的免疫增强作用,将VA5与灭活疫苗混合并制成疫苗。通过常规Bartha-K61株灭活疫苗、含免疫增强剂灭活疫苗和Bartha-K61活疫苗3组免疫效力对比试验,首次免疫后14和35 d对猪进行采血,并且进行中和实验以及对相关细胞因子进行检测。结果表明,该免疫增强剂能够显著地提高猪伪狂犬灭活疫苗血清中抗体产生,同时能显著提高猪外周血淋巴细胞(PBMC)中IL-2和IFN-γ mRNA表达。交叉中和试验表明,VA5能够显著地提高猪伪狂犬灭活疫苗对伪狂犬流行变异株的中和作用。试验表明,VA5能够显著提升猪伪狂犬病毒灭活疫苗体液与细胞免疫,为研制免疫效果更好的灭活疫苗提供了依据。     

E515-A对猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的佐剂作用

E515-A是一种含人参茎叶皂苷(GSLS)的白油佐剂。将E515-A和含猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原的水相在低剪切力(转速200r·min~(-1))下混合,形成油乳剂疫苗。为观察E515-A对PEDV灭活疫苗的免疫增强作用,将72只ICR小鼠随机分成6组,分别进行2次(间隔2周)皮下注射:(1)0.9%NaCl溶液,(2)PEDV抗原+0.9%NaCl溶液,(3)PEDV抗原+GSLS,(4)PEDV抗原+白油佐剂,(5)PEDV抗原+E515-A和(6)PEDV抗原+氢氧化铝铝胶。于一免后24h采血检测血清IFN-γ水平和NK细胞杀伤活性;于二免后检测血清特异性IgG及IgG1和IgG2a水平,制备脾淋巴细胞检测细胞增殖能力。结果表明,E515-A对于PEDV疫苗诱导的免疫反应具有显著的促进作用,免疫增强效果优于铝胶佐剂。和对照组比较,E515-A油佐剂可以显著促进免疫小鼠的NK细胞杀伤活性,促进细胞因子IFN-γ的产生,增强脾淋巴细胞对刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)刺激的增殖应答能力,提高血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a水平。为增强猪的疫苗免疫效果,E515-A作为猪疫苗的佐剂值得进一步研究。     

猪转移因子增强猪细小病毒灭活疫苗猪体细胞免疫活性的研究

为探讨猪转移因子增强猪细小病毒灭活疫苗对猪体免疫效果,从健康猪的新鲜脾脏中提取转移因子,分别与自制猪细小病毒灭活油苗和猪细小病毒商品灭活苗联合免疫仔猪,并设猪转移因子和生理盐水对照组。免疫后分别用间接ELISA方法和流式细胞技术检测仔猪抗体水平变化和仔猪外周血T淋巴细胞亚群动态变化。结果显示,免疫后猪转移因子联合灭活疫苗组能有效提高抗体水平,且免疫后猪转移因子联合PPV灭活疫苗组的CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+T淋巴细胞比值均高于相应的PPV灭活疫苗组。表明猪转移因子主要增强PPV油乳剂灭活疫苗的细胞免疫应答。     

猪圆环病毒2型与猪细小病毒混合感染对仔猪致病性的研究

对35日龄健康仔猪进行人工单独或混合感染猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2),采用临床症状、组织病理学变化和血清学检测等手段,比较了不同实验组攻毒后仔猪的症状差异。实验结果显示:PPV和PCV2混合感染能够引起更加严重的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)症状,并加重PCV2引起的间质性肺炎和仔猪消瘦的严重程度;混合感染后,仔猪病毒血症出现更早,持续时间更长,且病毒含量明显高于单独感染组;混合感染组仔猪的PCV2 ELISA抗体水平和血清抗体水平均显著高于PCV2单独感染组的。说明PPV能够明显增强PCV2的临床症状,加重PMWS的发病程度。     

猪圆环病毒2型与猪细小病毒混合 感染对仔猪致病性的研究

对35日龄健康仔猪进行人工单独或混合感染猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2),采用临床症状、组织病理学变化和血清学检测等手段,比较了不同实验组攻毒后仔猪的症状差异。实验结果显示:PPV和PCV2混合感染能够引起更加严重的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)症状,并加重PCV2引起的间质性肺炎和仔猪消瘦的严重程度;混合感染后,仔猪病毒血症出现更早,持续时间更长,且病毒含量明显高于单独感染组;混合感染组仔猪的PCV2 ELISA抗体水平和血清抗体水平均显著高于PCV2单独感染组的。说明PPV能够明显增强PCV2的临床症状,加重PMWS的发病程度。     

多重PCR检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的研究

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因、猪细小病毒(PPV)的VP2基因序列和猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2基因序列,设计合成了3对特异引物,分别建立了PRV,PPV和PCV2的单项PCR诊断方法;通过对扩增条件的筛选,建立了PRV,PPV,PCV2的复合PCR诊断方法,利用1次PCR反应,即可同时扩增PRV的355 bp,PPV的195 bp和PCV2 487 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)扩增结果均为阴性,对PRV,PPV,PCV2的最低检出量分别为100 fg,1 pg和10 pg的DNA.该方法适合对PRV,PPV和PCV2的联合检测和鉴别诊断.     

猪细小病毒病灭活疫苗佐剂筛选及配苗乳化工艺研究

为了筛选制备猪细小病毒病灭活疫苗(L株,悬浮培养)的佐剂,用注射用白油和法国赛比克公司生产的Montanide TM ISA 206 VG佐剂(简称206佐剂)分别配制灭活疫苗,通过对两种疫苗的配苗乳化工艺、疫苗性状、无菌检验、安全检验、效力检验和免疫期等方面进行比较.结果显示:与注射用白油配制的疫苗相比,使用206佐...     

猪细小病毒灭活疫苗NJ株毒种分离及鉴定

为防控猪细小病毒病,进行了猪细小病毒灭活疫苗毒种研究。将南京某猪场初产母猪流产胎儿的脾、肺等组织病料处理后接种ST细胞培养,获得了1株猪细小病毒强毒,将分离毒株适当稀释接种ST细胞,经3轮蚀斑纯化获得1株纯净的猪细小病毒NJ株(PPV-NJ株),作为疫苗毒株。将NJ株接种ST细胞培养连续传15代,每代次病毒效价均不低于1 ml 107.25TCID50、血凝素效价不低于29。选择第5代病毒液,灭活后与矿物油佐剂混合乳化制成灭活疫苗,以不同剂量分别免疫豚鼠和后备母猪,用血凝抑制试验(HI)和ELISA检测抗体效价。分别用剂量0.125 ml、0.250 ml和0.500 ml疫苗免疫豚鼠28 d后,各免疫组HI抗体效价均高于28,0.5 ml组HI抗体效价高达211,ELISA抗体均显示阳性(OD630≥0.32),分别用剂量0.5 ml、1.0 ml和2.0 ml疫苗免疫后备母猪后,HI检测结果显示,3个剂量组免疫后1周HI抗体效价高于26,3周后达峰值,至免疫后4个月略有下降,2.00 ml剂量组HI效价最高(211.75)。ELISA检测结果显示,各剂量组在免疫后1周均转阳(OD630≥0.32),免疫后4～18周均维持较高水平。HI抗体效价和ELISA抗体水平与免疫剂量均呈正相关性。结果显示,利用NJ株病毒制备的灭活疫苗具有抗体产生快、效价高等特点,显示出良好的疫苗开发前景。     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV的VP2和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了2种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV的313 bp和PCV2的447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明二者的总符合率为100%。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这2种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用山西省农科院畜牧兽医研究所动物基础医学研究课题组研究的多重PCR检测方法,检出猪圆环病毒2型阳性56份,阳性率为27%;猪细小病毒病阳性42份,阳性率为20%;二者混合感染17份,阳性率为8%。这为掌握山西这2种病毒的感染情况提供了依据。     

不同乳化工艺对猪圆环病毒2型灭活疫苗稳定性的影响

为探讨乳化工艺中影响猪圆环病毒2型油包水剂型灭活疫苗的稳定性因素,以提升猪圆环病毒疫苗的质量,分别对圆环病毒抗原pH值、乳化剪切机转数、乳化时间进行筛选,并以疫苗黏度、粒径、保存温度评价疫苗稳定性。结果表明,抗原pH值为7.0~7.5时疫苗稳定性较好;剪切机转数越高,乳化时间越短,乳化效果越好,样品稳定性较高;在一定的时间内样品随乳化时间的延长,样品稳定性增强,但黏度不断增大。在本试验条件下,选择抗原pH值7.0~7.5,剪切机转数19 000r/min,乳化时间8min乳化的样品稳定性好,黏度合适,建议不同厂家在疫苗产业化生产时需调节抗原pH值至7.0~7.5,根据不同的乳化设备进行乳化试验摸索乳化剪机的转速及乳化时间,从而保证疫苗的稳定性。     

3种免疫增强剂对猪伪狂犬灭活疫苗的免疫效果评价

【目的】评价盐酸左旋咪唑(LH)、刀豆素(ConA)和胞壁酰二肽(MDP)3种免疫增强剂对猪伪狂犬病毒(PRV)灭活疫苗的免疫增强作用。【方法】将免疫增强剂混入灭活的PRV水相,和油相乳化后制成相应含有免疫增强剂的灭活疫苗,使各免疫增强剂终剂量为:LH 7.5 mg·mL~(–1)、ConA 25.0 mg·mL~(–1)、MDP 150.0 mg·mL~(–1)。首次免疫后14 d进行二次免疫,首次免疫后14 d、二次免疫后7和14 d采取小鼠血清,检测相关的细胞因子和特异性抗体水平,并在二次免疫后14 d攻毒,计算最终的攻毒保护率。【结果】相对于白油组,ConA组和MDP组在二次免疫后14 d对小鼠白介素2(IL-2)含量提升效果极显著;LH组在首次免疫后14 d、MDP组在二次免疫后14 d对白介素4(IL-4)含量提升效果显著;3种免疫增强剂分别在二次免疫后14和7 d对干扰素(IFN-γ)和特异性抗体含量提升效果极显著,并提高了攻毒保护率,LH组和ConA组存活率为20%,MDP组存活率为60%。【结论】3种免疫增强剂使用试验剂量均能不同程度地提升猪伪狂犬灭活疫苗的免疫效果,具有较好的应用前景。本研究结果为后续复合免疫增强剂筛选打下了基础。     

猪细小病毒预防和诊治

猪极易感染细小病毒,而病猪以及携带病毒的猪是主要感染源。感染后均可发生流产、死产等症状,感染后均可发生流产、死产等症状。发现多头初产母猪发生死胎、流产以及木乃伊胎等现象,而母猪却没有表现出明显症状变化时,应考虑是否发生猪细小病毒感染的情况。定期进行血清检测,及时发现并淘汰。     

猪圆环病毒ORF2基因的插入对猪细小病毒VP2基因蛋白表达的影响

将扩增得到的PCV2SC株ORF2基因插入PPVSC-1株VP2基因的HindⅢ(522bp处)和SacⅠ(1220bp处)2个特异限制酶切位点,并将此重组基因分别连接到含绿色荧光蛋白基因的伪狂犬病毒转移载体(pPI-2.EG-FP),脂质体转染系统转染COS-7细胞,倒置荧光显微镜观察重组基因表达情况。结合测序结果预测重组基因所编码的蛋白质的二级结构。