双重PCR技术鉴定番茄Sw-5和Ty-2基因

研究利用双重PCR技术同时鉴定番茄抗斑萎病毒病基因Sw-5和抗番茄黄化曲叶病毒病基因Ty-2,鉴定结果与单引物PCR完全吻合.其中Sw-5的连锁标记在纯合抗病和感病材料中分别扩增出574 bp和464 bp的特异条带,在杂合抗病材料中可同时扩增出以上两条带;Ty-2的连锁标记在纯合抗病和感病材料中分别扩增出900 bp...     

番茄根结线虫病抗病基因Mi的CAPS标记及检测

研究利用特异引物对2份抗病纯合材料(基因型Mi/Mi)和2份感病纯合材料(基因型mi/mi)进行PCR扩增,抗、感材料均产生750 bp的PCR扩增片段,纯合抗病和杂合抗病材料的PCR产物存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了570 bp和180 bp以及750 bp、570 bp和180 bp的片段,而感病材料的扩增产物无此酶切位点,酶切后仍为750 bp的片段。利用该标记对4份番茄杂交种进行检测,其中2份杂交种表现为杂合抗病型,另2份杂交种表现为纯合感病型。利用该标记对其中一个表现为杂合抗病的杂交种50份F2代单株进行检测,抗感遗传的分离比符合3∶1。说明该分子标记的这一抗病基因属于单基因控制的质量性状遗传位点。     

高番茄红素加工番茄品系的RAPD引物筛选及特异片段的克隆

以加工番茄高茄红素近等基因系为材料,分别从高茄红素含量及低茄红素含量植株中提取DNA构建DNA池,采用RAPD技术,从260个随机引物中筛选出1个在2基因池间具有特异性的引物S636,在轮回亲本及回交后代单株的DNA中进行验证,证明了该引物扩增出的特异性片段是1个与番茄耐高茄红素含量连锁的RAPD标记.经琼脂糖凝胶电泳回收扩增出的特异条带与载体pMD-18T连接,并转入大肠埃希菌DH-5α,对克隆片段测序结果表明其实际大小为827 bp,这为转化成稳定的SCAR标记奠定了基础.     

加工番茄骨干自交系对叶霉病的抗性鉴定及抗病基因(Cf-9)检测

以218份加工番茄骨干自交系为试验材料,采用叶面喷雾的方法对其中30份自交系进行菌悬液室内人工接种,评价不同加工番茄自交系对番茄叶霉病的抗性表现;同时利用基因功能标记对所有参试材料进行分子检测,明确这些材料中是否含有抗番茄叶霉病基因(Cf-9)。室内人工接种鉴定结果表明,在30份加工番茄骨干自交系中,共筛选出抗病材料6份,中抗材料16份,感病材料7份,高感材料1份,其占比例分别为20.0%、53.3%、23.3%和3.4%。特异引物PCR检测结果表明,在218份加工番茄骨干自交系中,含抗叶霉病基因(Cf-9)的材料有74份,占总数的33.9%;不含抗叶霉病基因(Cf-9)的材料有144份,占总数的66.1%。总体来看,在新疆加工番茄骨干自交系中,以中抗叶霉病材料居多,选用抗病自交系(亲本)配制杂交组合,并利用基因功能标记在育种早代筛选抗病基因型,有助于提高选择效率,加速新疆加工番茄抗病育种进程。     

番茄抗叶霉病基因Cf6的RAPD及SCAR标记

 【目的】寻找与番茄抗叶霉病基因Cf6连锁的分子标记。【方法】 以番茄抗叶霉病和感叶霉病亲本组合（03036×03748）的F2分离群体为研究材料,采用BSA法和RAPD技术筛选与抗病基因连锁的分子标记。【结果】经F2单株分析,在后代群体中扩增出了两条长约500 bp的特异片段,该特异标记与叶霉病抗性基因Cf6紧密连锁,遗传距离为8.7 cm。测序结果显示,目标片段的大小分别为619 bp和559 bp,并将该标记转换为SCAR标记。【结论】SCAR标记,可用于番茄叶霉病抗性分子标记辅助育种。     

基于番茄抗黄化曲叶病毒病基因Ty-5CAPS的SNP标记开发

为了促进SNP技术在番茄抗黄化曲叶病毒病育种中的应用,探讨了将番茄Ty-5 CAPS标记转换成SNP标记进行检测的可行性。首先对Ty-5的CAPS标记Sl NAC1的扩增产物进行测序,设计多对引物,以感病自交系9179和抗病自交系07-025为材料进行PCR,筛选出只在抗病自交系中能扩增出特异条带的SNP引物,将这对引物作为SNP标记;然后,用SNP标记对番茄材料进行分析,验证标记的可行性。结果表明,利用番茄Ty-5 CAPS标记转化的SNP标记,可直接用于番茄抗黄化曲叶病毒病的分子标记辅助选择育种。     

利用PCR技术同时检测番茄抗根结线虫基因(Mi-1)和抗叶霉病基因(Cf-9)

   利用同一PCR反应体系,对分别与番茄抗根结线虫的Mi-1基因和抗番茄叶霉病的Cf-9基因紧密连锁的CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences)标记进行同时扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合与Cf-9基因紧密连锁的CAPSl标记在抗病试材中可扩增出2775 bp的特异片段,且存在Taq I酶切位点,酶切后产生1177 bp、446 bp、370 bp和160 bp的不同特异片段;与Mi-1基因紧密连锁的CAPS2为共显性标记,抗性材料中产生915 bp的特异片段,Taq I酶切后产生719bp和196 bp的特异片段该体系可用于在同一PCR反应体系中对Mi-1和Cf-9 2个抗病基因进行同时筛选鉴定该体系的建立不仅省时、省工,节省费用,而且可用于苗期早期辅助选育,加快番茄育种进程     

苹果抗斑点落叶病基因的一个RAPD标记的SCAR转换

将苹果抗斑点落叶病相关基因的一个RAPD标记成功转换为重复性和特异性更好的SCAR标记。由序列特点设计特异SCAR引物,并用所设计引物对两亲本和抗病、感病基因池及F1代单株进行PCR扩增。结果表明,秦冠×富士F1代群体在抗病后代个体中扩增出470 bp条带,而在感病后代个体中无此扩增条带,故将该标记命名为SCAR470。同时,分析分离群体的扩增,重复率为4.69%,表明该标记可以用于苹果斑点落叶病的分子鉴定。     

番茄抗性基因Ty-1的PCR快速检测

利用国内外已发表的10对标记引物对抗番茄黄化曲叶病毒病纯合系"JZ-108"(Ty-1/Ty-1)、感病纯合系"1712"(ty-1/ty-1)及杂交F1代的Ty-1抗性基因进行PCR扩增筛选,筛选出一对特异性引物SSR47,在抗病纯合材料中产生750 bp的扩增片段,感病材料中产生640 bp的片段,抗病杂合材料中同时产生750 bp和640 bp的扩增片段,标记结果与田间鉴定完全一致,证明该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料,是与抗番茄黄化曲叶病毒病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对"JZ-108×1712"F2代的48个单株进行检测,有8株为抗病纯合基因型,19株为感病纯合基因型,21株为抗病杂合基因型,其中抗病纯合株与抗病杂合株田间表现均为抗病。经反复验证,结果准确可靠,该标记可用于对番茄抗病基因Ty-1的快速筛选鉴定。     

水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa7共显性功能标记的开发与应用

【目的】对水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa7进行精准检测和世代跟踪，通过分子标记检测Xa7基因材料的纯合或杂合型。【方法】根据Xa7、xa7和无等位基因型序列的差异，通过Premier 5软件设计了含4条引物Xa7-F、Xa7-R、Xa7null-F、Xa7null-R的功能标记Xa7fun，且采用PCR方法分别对不同遗传资源材料进行分子标记特异性检测和验证，自然高温下于孕穗期对含Xa7基因的3份杂交改良系及亲本采用剪叶接种法接种7个白叶枯病菌菌株进行抗性鉴定，并于成熟期考察记录其农艺性状。【结果】分子标记特异性检测结果表明，Xa7基因纯合型材料R084可扩增出大小为91 bp的条带，无等位基因型材料Nip可扩增出大小为153 bp的条带，杂合体Nip/R084可扩增出大小为91 bp、153 bp的条带，共显性标记Xa7fun得到的电泳条带与引物设计时预测的目标片段完全吻合；18份不同类型的种质资源均未扩增出91 bp大小的功能条带，说明这些材料均不含Xa7基因；杂交改良系Ry-1、Ry-2、Ry-3均仅含有91 bp大小的功能条带，表明Xa7基因纯合；在高温下，华占对7个菌株表现为高感...     

小麦谷蛋白亚基1Dx5的分子鉴定及标记辅助选择

 小麦高分子量谷蛋白亚基Glu-D1位点上1Dx5-1Dy10和1Dx2-1Dy12分别紧密连锁，它们分别与小麦面包加工品质的优劣密切相关。利用1Dx5亚基特异PCR标记鉴定了我国新育成的49份优质小麦品种(系)的谷蛋白亚基Glu-D1位点，有17个品种扩增出450 bp特异片段，表明具有1Dx5亚基；32个品种未扩增出450 bp片段，表明不具有1Dx5亚基；1Dx5亚基的出现频率为34.7%。所用材料的鉴定结果与SDS-PAGE电泳的结果基本一致，表明利用特异性PCR标记鉴定1Dx5亚基技术是可靠的。此外，还利用该PCR标记，对回交后代株系进行了鉴定，选择出含优质亚基的小麦株系。     

洋葱细胞质雄性不育基因分子标记的开发

根据细香葱orf A501开发的特异引物,以洋葱细胞质雄性不育系为试材进行PCR扩增,对获得的片段进行回收测序,根据测序结果设计引物进行染色体步移,获得部分侧翼序列,开发了鉴定洋葱细胞质基因型的SCAR标记,命名为OC2175。该标记在洋葱不育系中扩增出一条2 175 bp的特异条带和1 053 bp的条带,而保持系中仅扩增出1 053 bp的条带。对17组不同遗传背景的不育系及其相应的保持系进行验证,该SCAR标记的鉴定结果与田间表型判断结果完全吻合。     

利用多重PCR反应同时筛选番茄Ty-1和cf-5基因

利用同一PCR反应体系同时扩增、筛选分别与番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty-1基因和番茄抗叶霉病的cf-5基因紧密连锁的SCAR标记,扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合.与Ty-1基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记,抗感材料均产生398 bp的特异片段,纯合和杂合抗病基因型存在TaqⅠ酶切位点,酶切后分别产生了303 bp和95 bp以及398、303 bp和95 bp的特异性片段,而感病基因型无此酶切位点,酶切后仍呈现398 bp的特异带.与cf-5基因紧密连锁的SCAR2标记扩增后抗感材料均产生960 bp的特异片段,用限制性内切酶TaqⅠ酶切后,含cf-5基因的材料产生一条256 bp的特异带,而不含cf-5基因的材料产生一条225 bp的特异带.     

水稻耐低温基因bZIP73分子标记的开发与验证

为能够对耐低温基因bZIP73的不同类型进行准确鉴别,根据粳稻bZIP73~(Jap)与籼稻bZIP73~(Ind)在编码区的一个碱基差别,开发了由4条引物组成的分子标记,并应用7份籼稻、7份粳稻及3份籼粳杂交的F_1材料对分子标记进行检测验证。电泳检测图显示,粳稻bZIP73~(Jap)扩增出681 bp和342 bp 2种条带,籼稻bZIP73~(Ind)扩增出681 bp和387 bp 2种条带,而籼粳杂合子F_1则扩增出681 bp、342 bp及387 bp 3种条带,所有材料的扩增条带大小与预测目的片段均一致,说明所开发出的分子标记能对基因bZIP73的不同类型进行准确判断。该方法具有费用低廉、操作简便、快速高效等优点,可在资源鉴定和育种中推广应用。     

中国冬小麦品种Waxy蛋白分析及分子标记研究

 利用SDS-PAGE分析了国内外306份小麦品种（系）Waxy蛋白的缺失类型，筛选出缺失Wx-B1蛋白亚基的材料46份；通过对济麦19×豫麦47的120个F2单株Waxy蛋白亚基分析，发现缺失Wx-B1的比例接近1/4，符合孟德尔分离规律。利用3个STS标记和1个SSR标记对不同Waxy蛋白缺失类型进行鉴定，验证其在分子标记辅助育种中的有效性。结果表明，Wx-7A位点的STS引物在野生型中扩增出1条1 172 bp的特异带，而缺失Wx-A1蛋白亚基的突变材料中没有扩增出该特异带；Wx-4A位点的STS引物在野生型中扩增出1条440 bp的特异带，缺失Wx-B1蛋白亚基的突变材料中没有该扩增片段；Wx-7D位点的STS引物在野生型中扩增出1条940 bp的特异带，而在缺失Wx-D1蛋白亚基的突变材料中则扩增出1条360 bp的特异带；Wx-7D位点的SSR引物在野生型中扩增出1条204 bp的特异带，在缺失Wx-D1蛋白亚基的突变材料中没有扩增出该特异带。这4个标记可以用于分子标记辅助育种。     

南瓜耐盐种质的筛选鉴定及耐盐基因的标记

以27份自交系南瓜为材料,选择出苗率和盐害指数为耐盐鉴定指标,从中筛选出了耐盐的南瓜NM083和不耐盐的南瓜XBZM,并以NM083为父本、XBZM为母本构建F2群体,结合集团混合分离分析法(bulked segregation analysis,BSA)筛选耐盐相关的分子标记。结果表明,在600条RAPD和44对SSR引物中,共有18个引物(10条RAPD和8对SSR)在双亲中显示出多态性,其多态性比例分别为0.43%和4.3%。最终筛选到RAPD引物P597,在双亲及基因池间能稳定扩增出片段大小为685 bp的差异条带。通过160个F2代单株耐盐性试验验证,表明耐盐的F2代单株中能扩增出差异条带,而不耐盐的F2代单株中不能扩增出差异条带,从而初步确定此差异性条带是与南瓜耐盐性紧密连锁的RAPD标记,从而为利用分子辅助育种加速耐盐南瓜新品种的选育提供有效标记。     

小麦抗叶锈基因Lr38的一个新标记

【目的】建立小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38特异的PCR标记。【方法】以Thatcher为对照,以TcLr38和TcLr38×Thatcher F2代单株构建的分离群体为材料,利用TcLr38远缘亲本中间偃麦草特异的SCAR标记引物进行PCR扩增获得单一条带,并以50个小麦抗叶锈近等基因系材料对该标记特异性进行检测,Mapmaker 3.0软件计算该标记与Lr38的遗传连锁距离。【结果】中间偃麦草特异的SCAR标记引物在TcLr38中获得单一扩增片段大小为982 bp,50个小麦抗叶锈近等基因系检测表明为TcLr38的特有条带,F2代分离群体验证表明为与Lr38共分离的分子标记,命名为Y38SCAR982。【结论】Y38SCAR982可以作为Lr38的分子标记,并证实该基因由中间偃麦草向普通小麦转移的事实。     

俄引春小麦脂肪氧化酶活性基因的标记分析

为了改良黑龙江省小麦品种,加强其种质创新,利用与脂肪氧化酶基因(LOX)活性有关的2个遗传位点相连锁的3对分子标记,对247份俄罗斯引进的春小麦品种进行研究。结果表明:对于SSR标记Xwmc312,142份品种扩增出247bp特异条带,即Xwmc312-247基因型比例为57.49%,85份品种扩增出235bp特异条带,Xwmc312-235基因型比例为34.41%,20份品种扩增出227bp特异条带,Xwmc312-227基因型比例为8.10%。TaLOX-B1位点上,16份品种扩增出标记LOX16的特异条带,即高活性等位基因型TaLoxB1a分布比例是6.48%,230份品种扩增出标记LOX18特异条带,即低活性的等位基因型TaLOX-B1b分布比例是93.12%,有一个品种在此位点表现杂合。表明以TaLox-B1b基因型为主。2个位点不同等位基因组合共有6种,Xwmc312-247/TaLOX-B1b分布比例最高(53.85%),Xwmc312-22 7/TaLOX-B1a分布比例最低(0.41%),高活性组合Xwmc312-235/TaLOX-B1a(分布比例2.43%)等其它4种组合型介于二者之间,表明俄罗斯引进小麦品种以LOX低活性组合型为主。     

珠江三种亚科鱼类微卫星鉴别技术的建立

应用微卫星标记技术鉴别珠江3 种主要鲌亚科鱼类广东鲂（Megalobrama terminalis）尧鳊（Parabramis pekinensis）尧海南红鲌（Culter recurviceps）。从GenBank 和文献资料中初选3 种鲌亚科鱼类的微卫星标记、设计108 对微卫星引物、用PCR 扩增3 种鱼的基因组DNA、并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测选出每种鱼的特异微卫星标记、共 获得16 个特异性标记。其中、微卫星标记F-524 在广东鲂和海南红鲌中扩增的目的片段为309~320 bp、在鳊中无扩 增条带;微卫星标记L-4 在鳊和海南红鲌中扩增目的片段为160~201 bp、在广东鲂中无扩增条带;微卫星标记L-7 在广东鲂和鳊中扩增的目的片段为160~190 bp、在海南红鲌中扩增的片段为123~143 bp。3 个微卫星标记、单独使用 1 个特异性标记或几种特异性微卫星标记相结合、可快速从分子水平鉴别出广东鲂尧鳊尧海南红鲌、从而解决3 种鲌 亚科鱼类早期发育过程中形态比较相似、通过形态鉴定比较困难的问题。     

加工番茄Tm-22基因的SCAR鉴定

[目的]建立利用SCAR标记技术鉴定番茄花叶病毒病抗性基因Tm-22的技术体系,开展分子标记辅助选择育种,选育加工番茄抗病品种.[方法]以6份ToMV表现型鉴定已知的加工番茄材料为试材,选用与Tm-22基因连锁的SCAR标记,通过PCR扩增和Hind Ⅲ酶切鉴定有无Tm-22基因,并将其应用于加工番茄品种选育.[结果]抗感试材均产生950 bp和1 100bp的特异片段,纯合抗病基因型无HindⅢ酶切位点,杂合抗病基因型和感病基因型有Hind Ⅲ酶切位点,酶切结果为:纯合抗病1 100 bp+ 950 bp、杂合抗病1 100 bp+950 bp +500 bp +300 bp+ 150 bp、感病基因1 100 bp +500 bp +300 bp+ 150 bp.[结论]通过酶切产生的特异性片段就可鉴定出Tm-22基因,成本低,操作不受时间、地域、发育时期的限制,提高了选择的准确性,加快了育种进程.