一株鸡源致病性大肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性

<正>目前,在鸡业发展过程中,大肠杆菌病是一种较为常见高发病,常造成鸡局部或全身性感染[1-2]。大肠杆菌病是一种条件致病菌,差的卫生条件、不良的卫生管理,很容易造成大肠杆菌病的发生。随着养鸡业规模化、集约化的不断发展,大肠杆菌病越发严重,病原对抗生素和抗菌药的耐药性越来越强。为了防治鸡大肠杆菌病,饲养主大多采用饲喂抗生素或抗菌药物的方法,但普遍存在耐药性和用药成本升高等问题。同时,由于长期使用抗生素或抗菌药,使产品存在药物残留,导     

1株多重耐药大肠杆菌噬菌体的分离、鉴定、生物学特性及全基因组分析

以多重耐药大肠杆菌F2为宿主菌,从养殖场污水中分离出1株肌尾裂解性噬菌体vB＿EcoM＿F2。该噬菌体可侵染多株大肠杆菌,一般生物学特性分析表明最佳感染复数为1,潜伏期30 min,爆发期90 min,爆发量为101 PFU/cell;对氯仿不敏感,可在40～50℃、pH 4.0～10.0的条件下保持较高活性;全基因组测序结果表明其基因组长为168 241 bp,(G+C)%含量为37.32%,含263个开放阅读框,其中113个为已知功能编码序列,含有2个tRNA;不含溶源基因、毒力因子和抗生素耐药基因;全基因组及终末端酶大亚基系统发育树的同源性分析表明,该大肠杆菌噬菌体vB＿EcoM＿F2与志贺菌噬菌phi25-307亲缘关系较近,但它不能侵染志贺菌属的标准菌株。目前,国际病毒分类委员会（ICTV）及美国国家生物技术信息中心资源（NCBI）已将其归类于肌尾噬菌体科（Myoviridae）,Tevenvirinae亚科,Mosigvirus属,未分类的Mosigvirus物种（unclassified Mosigvirus）,这就将为大肠杆菌病的噬菌体应用及防控奠定基础。     

一株产肠毒素大肠杆菌短尾噬菌体分离与鉴定

以产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)K88为宿主菌,从养殖场污水中分离出一株短尾裂解性噬菌体vB_EcoP_E21。该噬菌体可侵染多株大肠杆菌,一般生物学特性分析表明最佳感染复数为0.1,潜伏期和爆发期均为20 min,裂解量为370 PFU·cell-1;对氯仿不敏感,可在40～60℃,pH 4.0～10.0条件下保持较高活性;全基因组测序结果表明其基因组长度为58 536 bp,(G+C)%含量为46.89%,含66个开放阅读框,其中23个为已知编码序列;不含tRNA、溶源基因、毒力因子和抗生素耐药基因;噬菌体终末端酶大亚基和主要衣壳蛋白系统发育树同源性分析结果显示,该大肠杆菌噬菌体与变形杆菌(Proteus)噬菌体P16-2532、PM87、pPM 01和Saba亲缘关系较近,但无法侵染变形杆菌属(Proteus spp.)标准菌株。     

一株肠源唾液乳杆菌的分离鉴定及生物学特性

为筛选优良的乳酸菌作为益生菌出发菌株,采用碳酸钙平板法从健康成人的粪便中分离出1株乳酸菌,通过形态学、生理生化特征以及16S rRNA基因序列比对,将分离的菌株鉴定为唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius),命名为CPU9601。该菌株具有胆盐耐受性和抗酸能力,并在模拟胃液和肠液中显示出高存活率。分离株对头孢他啶、大观霉素、环丙沙星和苯唑西林具有抗性。CPU9601培养无菌上清液对大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC32664,金黄色葡萄球菌ATCC25923和铜绿假单胞菌PAO1有抑菌作用。结果表明,分离的唾液乳杆菌CPU9601具有较好的抗菌能力且而良好的耐酸性能,可作为益生菌开发应用。     

一株孔雀源大肠杆菌分离鉴定与致病特性初步研究

无菌采取病死孔雀肝脏,进行病原菌的分离、鉴定、生化试验、毒力基因检测、动物毒力试验。结果表明：致病菌为大肠杆菌,至少携带有papC、iucD、tsh、irp2、iss5种毒力基因,具有高致病性,并且该菌对小白鼠和鸡有较强的致死性。     

一株沙门菌裂解性噬菌体的分离鉴定与生物学特性研究

以1株多重耐药沙门菌(SA209)为宿主菌,从安阳市某规模化养殖场污水样本中分离出1株沙门菌裂解性噬菌体,命名为SA-1。采用点滴法和双平板法分离、鉴定及纯化了SA-1,并对其效价、最佳感染复数、酸碱稳定性、热稳定性、一步生长曲线等生物学特性进行了研究。结果表明:SA-1的初始效价为1.15×10^{(10 )}PFU/mL;最佳感染复数为0.001;对酸碱的耐受性较强,在pH 3.0～11.0范围内活性稳定;在40～50℃温度内活性稳定;其感染宿主菌的潜伏期为10 min,裂解期为20 min,之后进入稳定期,平均裂解量为108 PFU/cell; SA-1的核酸类型为DNA。     

一株多重耐药产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性的研究

湖北省某猪场新生仔猪发生以剧烈腹泻、排出黄色粪便并迅速脱水死亡为主要症状的疾病,对送检病料,通过细菌培养、革兰氏染色、PCR等方法进行鉴定,确定新生仔猪病是由产肠毒素大肠杆菌感染引起。药敏试验结果表明,该分离菌株对喹诺酮类、氨基糖苷类、头孢类等药物敏感;对青霉素类、四环素类、氯霉素类、磺胺类等药物耐药,主要是阿莫西林、氨苄西林、氟苯尼考、四环素、多西环素、磺胺异恶唑等。     

一株驴源干酪乳杆菌分离、鉴定及生物学特性研究

为了分离出可用于研发驴用微生态制剂的乳酸杆菌,采集健康驴新鲜粪样4份,通过分离培养、形态特征、培养特性筛选出革兰氏阳性,厌氧,无芽孢杆菌1株。通过生理生化鉴定和PCR鉴定,确定该分离菌株为干酪乳杆菌,编号为LV1。生物学特性研究结果表明,干酪乳杆菌LV1安全,无致病性,适宜生长温度范围为30~40℃,培养液初始p H3~8条件下均能生长。研究为研发驴用乳酸杆菌微生态制剂奠定了基础。     

一株可裂解耐黏菌素大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及全基因组分析

为研究耐黏菌素大肠杆菌的噬菌体治疗方法,本研究以耐黏菌素大肠杆菌为宿主菌,采用双层琼脂平板法从山东烟台某养鸡场污水样中分离纯化得到裂解性噬菌体SDYTW1-F1-2-2。通过透射电镜观察,最佳感染复数,一步生长曲线,温度稳定性,酸碱度稳定性等生物学特性测定,并对其进行全基因组测序分析。结果表明：1）噬菌体SDYTW1-F1-2-2噬菌斑呈现透亮,外周无晕圈,形态学观察显示其具有可伸缩性尾鞘。2）生物学特性分析表明,噬菌体最佳感染复数为0.1,潜伏期为50 min,爆发期为40 min,爆发量为（331±9）PFU/cell。在温度4～40℃,pH为4～12的环境下,噬菌体活性较为稳定。3）通过噬菌体全基因组测序及核酸类型鉴定显示,该噬菌体基因组全长为74 752 bp,双链DNA,GC含量42.1%。在噬菌体基因组中共鉴定出121个编码蛋白（CDS）,包括结构组成、DNA代谢与复制和包装以及细菌裂解相关的功能基因,发现一个tRNA基因,且未检测到如stx-1等致病性基因和mcr-1等耐药基因相关的基因。综上,噬菌体SDYTW1-F1-2-2裂解谱较宽,具有良好的酸碱性、热稳定性以及安全...     

犊牛源益生菌的分离鉴定及生物学特性分析

本研究从健康犊牛粪便中分离益生菌,并分析其益生特性。通过形态学观察和16S rDNA测序进行鉴定,对其抗菌活性和抑菌物质分析,建立生长曲线和产酸曲线,探究其黏附能力和耐受性,通过药敏试验和溶血试验评判其安全性。结果显示,4株益生菌为敏捷乳杆菌（Lactobacillus agilis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、唾液乳杆菌（Lactobacillussalivarius）和约氏乳杆菌（Lactobacillusjohnsonii）,且对大肠杆菌（Escherichia coli）O111:K58(B4)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌K99(Escherichia coliK99)均具有抑菌活性,其中12和30号菌株的抑菌物质为有机酸和过氧化氢,26号菌株还包括细菌素,14号菌株为有机酸和细菌素,其生长特性和产酸能力良好,具有较强的细胞黏附能力,对胆盐溶液和人工胃肠液的耐受性较强,对抗生素敏感性较强,无溶血性。本研究分离得到的4株益生菌符合寻找替抗物质的需求,为防治细菌性犊牛腹泻提供了理论依据。     

输卵管炎种鸭大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为分析表现输卵管炎种鸭体内分离的大肠杆菌的致病性、药敏试验、血清型及毒力基因携带情况,无菌采集表现输卵管炎的种鸭肝脏,进行大肠杆菌的分离鉴定,经易感鸭皮下注射,测定其致病性;纸片法进行药敏试验;凝集试验确定血清型;PCR法检测毒力基因.结果共分离鉴定大肠杆菌16株,其中强毒菌株11株.70％以上菌株表现敏感的药物有丁胺卡那霉素、氟苯尼考、头孢唑啉、左氧氟沙星和壮观霉素,70％以上菌株表现耐受的药物有复方新诺明、卡那霉素、庆大霉素、恩诺沙星和氟哌酸.16株大肠杆菌分属于4个血清型,078占56.3％,为主要血清型.毒力基因irp2、yuA、imC和pa pC的检出率分别为68.8％、87.5％、75％和100％.总结说明,从表现输卵管炎的种鸭体内共分离到16株大肠杆菌,078是主要的血清型,首选壮观霉素和氟苯尼考等敏感药物进行治疗.     

一株猪源沃氏葡萄球菌的分离鉴定及耐药特性分析

 采用含16μg/mL亚胺培南选择剂的MH琼脂培养基,从外观健康猪新鲜粪便中分离培养获得1株耐亚胺培南细菌。该菌镜检为粗大的球杆状革兰氏阳性菌,生化发酵赖氨酸、七叶苷和木糖醇均为阳性,对10种常规抗生素均呈高度耐药,具有“超级细菌”的特点。经聚合酶链式反应（PCR）扩增、克隆及测序分析该菌株16S rRNA,将其初步鉴定为沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)。鉴于猪与人类健康关系密切,该结果提示应加强对猪源细菌耐药性监测及基础研究。     

一株猪链球菌的分离鉴定及其生物学特性研究

为了确定扬州市某猪场发病猪的病原,对该猪场送检的病猪心脏进行了细菌分离与培养。通过16S rDNA测序和gdh基因PCR扩增,确定细菌种类;用血清型特异性引物进行PCR扩增,确定分离菌株的血清型;通过生长曲线测定、小鼠感染试验和药敏试验对分离菌株的生物学特性进行研究。结果表明,分离菌株为猪链球菌2型;分离菌株的生长情况与猪链球菌2型SC19菌株相似,但最高OD_(595)值略低于SC19菌株;分离菌株对小鼠具有高致病性;分离菌株主要对青霉素类和头孢类药物敏感。这说明猪链球菌2型很可能是该猪场发病猪的病原,该猪场对猪链球菌感染的防控应优先选用青霉素类和头孢类药物。     

生物制品公司周边环境中2株大肠杆菌噬菌体的分离鉴定

为了检测生物制品公司周边环境中噬菌体的种类及含量,以大肠杆菌(CMCC44102)为宿主菌,对生物制品公司污水处理厂污水样本中的噬菌体进行了分离纯化,并对纯化样本的一般生物学特性进行了鉴定。实验分离获得了2株噬菌体ΦL和ΦS,ΦL噬菌斑直径为1~2mm,ΦS噬菌斑直径为0.1~0.3mm。2株噬菌体在电镜下形态极为相似,均可见明显头部和尾部结构,头部呈正多面体,直径约为33nm;尾部较短,长约21nm,可见爪刺样结构。ΦL与ΦS的一般生物学特性大多相似,前者效价为2.129×10~(10) PFU/mL,后者为2.5645×10~(10) PFU/mL;2株噬菌体的最佳感染复数均为10;在37℃及以下温度均具有良好的稳定性;且均对宿主菌,即大肠杆菌(CMCC44102)具有高度属特异性。一步生长曲线结果表明,ΦL的潜伏期和爆发期均显著短于ΦS,说明ΦL生长能力强于ΦS。上述结果表明,生物制品公司周边环境中存在大量噬菌体,并对一些重要工程菌具有高度特异性,应高度关注并防止其对生物产品质量产生影响。     

一株野生多孔菌的分离鉴定及生物学特性研究

本研究通过对一株野生多孔菌子实体进行分离纯化,并对获得的菌株进行ITS鉴定。序列分析结果表明,该菌株与硬毛栓菌相似性为100%。进一步研究了不同温度、碳源、氮源以及pH对野生多孔菌菌丝生长的影响,从中选出最优的3个水平进行正交实验。结果表明,野生多孔菌菌丝的最适生长条件为:碳源为蔗糖、氮源为酵母浸粉、pH 7. 0、培养温度为35℃。本研究为野生多孔菌资源的开发利用提供了理论依据。     

一株产菌核曲霉的分离鉴定及生物学特性研究

从20种森林土样中共分离出78株曲霉,其中,从四川省南充市西充县华光乡柏树根部土壤中分离得到产菌核曲霉N1菌株;通过对菌落形态、个体形态特征观察及ITSr DNA序列分析,将N1菌株鉴定为黄曲霉原变种(Aspergillus flavus var.flavus)。生物学特性研究结果表明,CYA和CA为N1菌株产菌核的最适培养基,N1菌株的最适产菌核温度为30℃,最适产菌核p H值是6;培养基的碳氮源对菌核生物量有一定影响,最优碳源为蔗糖,最优氮源为蛋白胨,培养基中含碳量在9.88~39.53 g/L、含氮量在0.42~0.84 g/L时,菌核生物量最大;无机盐对N1菌株菌核生物量也具有明显的影响作用。     

兔源大肠埃希菌噬菌体分离鉴定与生物学特性研究

对浙江省某兔场腹泻病兔进行病原分离鉴定,经革兰氏染色和PCR鉴定,分离出致病性大肠埃希菌1株,命名为ZJE1株。ZJE1株对链霉素、环丙沙星敏感。以ZJE1株为宿主菌,分离纯化出噬菌体4株,分别命名为ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5,并对其生物学特性、形态与结构特征进行研究。结果显示,4株噬菌体分离株均由六角形的头部、可收缩的尾鞘和尾管组成,均属于肌尾噬菌体科。采用双层平板法测定噬菌体分离株的宿主谱、最佳感染复数、pH稳定性、热稳定性和一步生长曲线。结果显示,ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5具有宿主特异性,在37~55 ℃的条件下可保持良好活性。ZRP2、ZRP3在pH值7的条件下可保持良好活性,ZRP4、ZRP5在pH值5~7的条件下可保持良好活性。ZRP2、ZRP3、ZRP5的潜伏期为11~19 min,均能在体外裂解ZJE1株。研究成果可为应用噬菌体治疗兔大肠埃希菌病提供研究基础与数据支持。