基于单链置换的环介导间接PCR鉴别PEDV、TGEV方法的建立及应用

【目的】猪病毒性腹泻主要是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)所引起的一种急性肠道传染病,临床上以呕吐、腹泻、脱水、高发病率和死亡率为主要特征。PEDV与TGEV同属α冠状病毒,可以感染各年龄段猪只,尤其对仔猪的危害最为严重,可导致大量仔猪死亡,给养殖业造成严重经济损失。由于PEDV和TGEV感染在临床症状、病理变化和流行病学上极为相似,临床上很难区分,因此,建立一种高效、特异的临床鉴别诊断方法对于预防病毒性腹泻的爆发流行具有重要意义。本试验旨在建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)环介导间接PCR检测方法,用于猪病毒性腹泻的病原学鉴别诊断。【方法】根据Gen Bank数据库中PEDV和TGEV基因组序列信息,在对两种病毒基因序列同源性比较的基础上,分别选取PEDV和TGEV核蛋白(N)基因序列的一段高度保守区,设计两条序列相邻的特异性探针,标记于不同大小的TOC1基因片段两端,作为特异性标记的报告基因。此报告基因与待测靶标基因经杂交、环化后,采用1对引物反向PCR扩增报告基因,建立PEDV/TGEV鉴别诊断方法,扩增片段大小分别为404、252bp。【结果】该方法特异性好,可单独或同时检测PEDV和TGEV,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型轮状病毒(RAV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)等常见猪源性病毒无交叉扩增;检测灵敏度高,对PEDV和TGEV的最低极限浓度分别为1.6和8 pg·μL-1的核酸样品,两种病原的同时检测不影响检测灵敏度;采用环介导间接PCR、常规RT-PCR和Sybr Green实时PCR对157份临床样本进行比较检测,3种方法的PEDV检出率分别为33.76%、21.66%和36.31%,TGEV检出率分别为26.75%、13.38%和28.03%;kappa检验结果,环介导间接PCR、Sybr Green实时PCR两种方法对PEDV和TGEV检测结果的符合度均为96.18%(κ≥0.90)【结论】环介导间接PCR可以用于鉴别诊断PEDV/TGEV,是一种快速、准确、灵敏、特异的病原学诊断工具。     

仔猪流行性腹泻病毒原性调查研究

通过济宁市仔猪流行性的发病情况,找出主要致病因子,对该地区36家猪场的134份病样,进行了猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒-2(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)荧光RT-PCR检测。结果显示:PEDV、TGEV、PCV-2、PRV阳性率分别为73.9%、17.9、21.6%和20.1%,群阳性率分别为83.3%、27.8%、33.3%和25.0%。研究表明:引起仔猪腹泻流行的主要致病因子为PEDV,并伴随TGEV、PCV-2、PRV的混合感染。     

陕西部分规模化猪场仔猪病毒性腹泻感染情况调查

为分析2018年陕西猪场猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒病的流行情况,研究采用RT-PCR对部分规模化猪场送检的162份腹泻样品进行检测。结果表明,PEDV、TGEV和PRV的阳性检出率分别为16.04%、10.49%和9.48%,总检出率占45.68%。其中1～5日龄哺乳仔猪阳性检出率最高,全年中冬季检出率最高27.78%。因此,陕西规模化猪场仔猪病毒性腹泻疾病的流行虽有所缓,但仍应加强全面防控防。     

TGEV和PEDV的多重PCR方法在猪传染性胃肠炎病毒检测中的应用研究

目的:通过应用同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的多重RT-PCR方法,并对其进行特异性与敏感性试验。方法:对本地区150份临床疑似病毒性腹泻病料进行检测,检测了仔猪腹泻的粪便或小肠组织共150份病料。在实验室检测中,此方法能检测约50 TCID50的混合病毒,能够扩增出3条长度为750 bp(PEDV)、544 bp(TGEV)、275 bp(PARV)特异性片段,而其它病毒无特异性条带。结果:PEDV、TGEV阳性率分别为54.67%(82/150)、8.0%(12/150)。PEDV与TGEV混合感染率为5.33%。结论:同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的多重RT-PCR方法的应用对临床上进行这两种疾病混合感染的检测具有重要意义。     

浙江及周边地区猪流行性腹泻病毒S基因分子特征分析

对2013年4月至2017年4月间浙江省及周边24个地区共282份病料进行猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、轮状病毒A型(porcine group A rotavirus, GARV)、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCo V)和猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV)等病原的检测,并选取其中的16份PEDV阳性样品进行S基因克隆和序列分析。结果显示:PEDV的检出率为64.89%(183/282),GARV为0.35%(1/282),PDCo V为4.25%(12/282),而未检出TGEV;PEDV在11月1日至次年4月1日间的累计检出率为74%,其余时间段的累计检出率为26%。对PEDV的S蛋白进行分子演化分析表明,PEDV可分为3个群,其中16份阳性样品均位于Ⅲ群,与疫苗毒株CV777、SM98和DR13株相比,核苷酸同源性为93.6%～95.2%,氨基酸同源性为92.4%～94.9%。16份PEDV阳性样品与中国PEDV的CV777疫苗毒株相比,形成了3个新的N-糖基化位点,破坏了1个N-糖基化位点。综上表明,当前仔猪腹泻主要病原为PEDV变异株,防控猪流行性腹泻需要注意季节的变化,也需要加快流行株疫苗的开发。     

仔猪病毒性腹泻研究进展

对由猪轮状病毒（RV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的仔猪病毒性腹泻在疫苗免疫、临床症状、病原特征、流行病学等方面的研究进行了阐述。     

猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪轮状病毒RT-PCR鉴别诊断技术研究

分别设计了三对引物对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)的RNA进行RT-PCR，结果其扩增产物的目的条带分别为：199bp、886bp、342bp，证明对引起猪病毒性腹泻的最主要的三种病毒用RT—PCR方法，可在3h作出内快速鉴别诊断。病毒间无交叉反应。     

2种猪冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RT-PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49copies/μL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性。该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RTPCR方法检测结果无显著性(P0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

2种猪冠状病毒双重RTGPCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RTGPCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49 copies/mL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性.该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RT-PCR方法检测结果无显著性(Pgt;0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

2种猪冠状病毒双重RTGPCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RTGPCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49 copies/mL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性.该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RT-PCR方法检测结果无显著性(Pgt;0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

2种猪冠状病毒双重RTGPCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RTGPCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49 copies/mL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性.该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RT-PCR方法检测结果无显著性(Pgt;0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(Plt;0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。     

规模化猪场仔猪腹泻4种病原的感染情况调查

采用PCR和RT-PCR技术,对福建省16个规模化猪场的仔猪腹泻样本进行致病性大肠杆菌(EPEC)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(RDV)的感染情况调查。结果表明:15个猪场EPEC检测为阴性,1个猪场同时检测到大肠杆菌K88的201 bp条带和仔猪水肿病大肠杆菌F18ab菌毛蛋白的510 bp条带,EPEC的阳性率为6.25%。1个猪场检测到TGEV的497 bp特有条带,TGEV的阳性率为6.25%。3个猪场检测到PEDV的854 bp特有条带,PEDV的阳性率为18.75%。3个猪场检测到RDV的342 bp特有条带,RDV的阳性率为18.75%。1个猪场同时感染EPEC和PEDV 2种病原,其余的15个猪场均为单一病原感染。表明福建省规模化猪场的仔猪腹泻仍然存在EPEC、TGEV、PEDV、RDV病原感染,呈现散发流行,与以往的报道相比阳性率明显下降。     

如何防治猪病毒性腹泻

正在冬季引起猪病毒性腹泻病原中,危害最严重的是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PoRV)。这三种病原可以感染所有年龄段猪只,引起猪呕吐、水样腹泻和脱水并且体温不高。主要集中在冬春多发,其他季节也有发生和流行。对10日龄内仔猪危害尤为严重,尤其是初生仔猪,死亡率最高可达100%。     

冬春季节猪病毒性腹泻病的防控

1.发病原因猪病毒性腹泻病的发生有明显的季节性,多发于寒冷的冬季和早春季节,主要是11月到翌年4月。寒冷、潮湿、不良环境等都易导致本病的发生。猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、流行性腹泻病毒（PEDV）、轮状病毒（RV）是猪病毒性腹泻的主要病原,常可导致仔猪高死亡率和养猪经济效益的下降。     

闽西地区猪流行性腹泻病毒N基因分子进化及序列分析

分析闽西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因的遗传进化特征,收集闽西地区猪流性腹泻病例组织样品8份,用逆转录PCR(RT-PCR)扩增N基因,连接至pMD-18T载体进行测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及遗传进化分析。结果显示,8株闽西流行毒株之间N基因核苷酸的同源性为9.8%～100.0%,推导的氨基酸序列的同源性为99.5%～100.0%,而闽西毒株与早期疫苗毒株CV777和SM98的同源性较远。氨基酸序列分析表明,闽西毒株氨基酸序列存在15处突变,与2010年后中国流行毒株变异位点相同。提示闽西地区毒株为目前国内流行毒株,与疫苗毒株亲缘关系较远,可能导致机体针对疫苗毒株产生的抗体不能够有效抵抗变异毒株,不能给猪群提供很好的免疫保护,因此需要基于变异毒株研究出有针对性的疫苗来预防PEDV。     

闽西地区猪流行性腹泻病毒M基因遗传进化及分子结构特征分析

为了解2015—2017年闽西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传进化规律,本研究收集了闽西地区12份PEDV阳性样品,对其M基因进行RT-PCR扩增,克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及遗传进化分析。结果表明,12株闽西毒株M基因氨基酸序列同源性为100.0%;遗传进化分析表明,12株闽西毒株与经典毒株CV777、2010年前中国分离毒株LCZ、以及韩国毒株SM98、virulent DR13的亲缘性较远,而与2010年后国内分离毒株以及2013年美国分离毒株亲缘关系最近,说明闽西PEDV毒株属于目前国内外流行毒株。分子结构特征分析表明,PEDV M基因具备高度保守的特性,可以作为设计疫苗的候选基因。     

猪病毒病PCV2、PEDV、TGEV、GAR的复合PCR方法建立及应用

本试验根据John Ellis和Dae S.Song等报道的4对引物建立同时检测猪圆环病毒(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(GAR)4种仔猪腹泻相关病毒的复合PCR方法,并对云南省玉溪市部分县(区)2014-2015年收集的47份腹泻粪便(肠内容物)进行检测,结果显示PCV2、PEDV、TGEV、GAR总阳性率分别为27.66%、55.32%、6.38%、14.89%。与单项PCR检测的符合率达到了100%,试验表明PEDV是导致该地群仔猪腹泻的主要致病因子;该复合PCR检测方法具有较高的敏感性和特异性,省时省力,完全可以应用于临床疾病的快速诊断。     

猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

为了建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)快速、特异的检测方法,减少猪流行性腹泻(PED)给养猪业带来的损失,根据PEDV的S基因序列设计1对引物,优化扩增条件,建立了针对PEDV的RTPCR检测方法。结果显示,建立的检测方法可特异地检测出PEDV。应用建立的检测方法对2016年河南地区38家发生腹泻的猪场的256份病料进行检测,结果表明,阳性猪场为30家,阳性样本为157份,检出率高于试纸条检测方法。可见,建立的检测方法特异性强,可用于PEDV感染疑似病例的诊断及流行病学调查。     

辽宁省本溪市猪流行性腹泻调查分析

为掌握猪流行性腹泻(PED)的流行规律,为预防和控制PED提供有利帮助,于2014年1月至2015年03月,在辽宁省本溪市桓仁县、本溪县2个地区临床出现腹泻症状的12个规模化猪场进行了病原检测和流行病学调查。结果表明,PEDV的个体阳性率为66.23%,群体阳性率为100%;猪传染性胃肠炎(TGEV)个体阳性率为16.88%,群体阳性率为33.33%。说明2015年春季辽宁省本溪市猪场仔猪腹泻的主要病原为PEDV。     

猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

【目的】快速了解猪群感染猪流行性腹泻病毒或免疫猪流行性腹泻病毒相关疫苗后猪群特异性SIgA抗体水平。【方法】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ZJ08株进行纯化，采用纯化的病毒作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的SC(Secretory component,SC)多克隆抗体为标记抗体，通过优化检测条件，建立乳汁中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法。【结果】成功建立了猪流行性腹泻病毒SIgA抗体检测方法。PEDV抗原的最佳包倍浓度为0.6μg·孔^-1，样本最佳稀释比例为1∶5，作用时间1 h;SC标记抗体最适稀释比例为1∶100，作用时间1.5 h。建立的ELISA方法能够特异性检测样本中抗PEDV SIgA抗体，与PoRV(Porcine rotavirus, PoRV)、 TGEV(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)的阳性乳汁均无交叉反应；批内、批间重复试验的变异系数小于10%，具有良好的特异性和重复性。通过临床采集的乳汁样品测定发...