大豆疫霉基因组SSR标记开发

 【目的】开发大豆疫霉基因组SSR标记,为从分子水平深入研究大豆疫霉及其近缘种提供一种理想的分子标记。【方法】用FPCR软件从大豆疫霉全基因组序列中查询SSRs,选择合适的SSR序列用Primer5.0软件设计引物。【结果】从发现的1 234个含有2～4个碱基重复单元的完全SSRs中选出260段设计引物,经10个大豆疫霉分离物基因组DNA检测,有213对(81.9%)扩增出SSR特征条带,其中114(53.5%)对引物扩增出多态性。通用性检测表明,14.6%～28.6%引物分别在选择的8个疫霉种中有效扩增。基于10个SSR标记数据进行聚类分析,结果表明表明这些标记可以完全区分大豆疫霉及其它疫霉。【结论】大豆疫霉基因组SSR标记具有高多态性,是大豆疫霉遗传变异、遗传多样性、及遗传图谱构建等研究理想工具。部分大豆疫霉基因组SSR标记在其近缘种中具有通用性,可以用于疫霉菌的系统进化、鉴定、区分及开发近源种的SSR标记。特别开发的SSR标记,在大豆疫霉基因组中具有准确的位置,将极大地方便大豆疫霉菌功能基因的定位和克隆,以及进行疫霉菌的比较基因组的研究。     

辣椒疫霉漆酶基因Pclac3克隆表达

辣椒疫霉是一种侵染性植物病原,能引起多种茄科及葫芦科植物的病害。利用同源克隆法从辣椒疫霉基因组内克隆了漆酶基因Pclac3,该基因全长1 881个核苷酸,编码626个氨基酸,与已知的真菌漆酶基因具有较高的同源性,并且具备漆酶基因的保守区域。利用PCR将该基因克隆于pPIC9K载体,并转化于毕赤酵母GS115,经过1%甲醇诱导表达获得其异源表达产物。将表达产物进行SDS-PAGE检测,获得分子量大约为90 kDa的特异蛋白。利用ABTS法对Pclac3的表达产物粗酶液进行酶活性分析发现,其活性在第11天时最大,达到45 U/mL。这为研究辣椒疫霉漆酶基因家族及探索卵菌漆酶生物活性及其潜在的应用提供了理论依据。     

大豆疫霉PsMPK1沉默突变体的基因表达谱分析

[目的]促有丝分裂原蛋白激酶(MAPK)是真核生物细胞信号转导途径中的关键蛋白激酶,对植物病原菌的生长发育与侵染致病具有重要作用。我们前期发现1个MAPK基因Ps MPK1参与调控大豆疫霉的细胞壁完整性、菌丝生长、游动孢子形成,以及对大豆的致病性等生物学性状。本文旨在进一步探究Ps MPK1如何调控大豆疫霉的上述性状。[方法]利用数字基因表达谱技术对大豆疫霉Ps MPK1沉默突变体在游动孢子囊阶段的基因表达情况进行分析。[结果]样品间基因表达水平的整体相关性分析和实时定量PCR结果表明:数据具有较高的可靠性。与野生型菌株相比,Ps MPK1沉默突变体中分别有1 451个显著下调和981个显著上调的基因,占所有被检测基因的23%。与之相比,被检测的细胞壁相关基因和分泌蛋白编码基因中,显著差异表达的基因比例更高(分别占37%和28%),且大部分基因为下调表达(分别占87%和78%)。显著下调表达的分泌蛋白编码基因中,37个基因可能与侵染过程相关,主要编码Rx LR、NLP和CRN等家族的效应分子,CBEL蛋白,富含半胱氨酸蛋白,氧化还原相关蛋白以及水解酶等。[结论]首次通过转录组学方法揭示了特定的功能基因Ps MPK1沉默后大豆疫霉基因组的转录变化,鉴定了可能与Ps MPK1信号途径相关的基因和基因家族,为进一步研究大豆疫霉中MAPK的调控网络奠定了基础。     

辣椒疫霉效应分子RxLR19781与其互作蛋白的酵母互作一对一验证

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的辣椒疫病是毁灭性土传病害,短期内暴发成灾,该病害严重发生常给辣椒生产造成严重损失。植物病原卵菌分泌大量的胞内效应分子,即RxLR效应分子,能干扰寄主植物细胞的正常生理代谢和功能,在病原卵菌侵染寄主及与寄主植物互作过程发挥着重要的作用。酵母双杂交(Yeast two hybrid,Y2H)系统是研究蛋白质相互作用最常用的方法,它既可以在cDNA文库中筛选互作的未知靶标蛋白,同时还可以验证两个目的蛋白之间的互作关系。本研究分别以辣椒疫霉c DNA基因组,辣椒cDNA基因组为模板,克隆了辣椒疫霉效应因子Rx LR19781以及其疑似互作蛋白泛素连接酶E2 10和辣椒脂质转移蛋白EARLI 1,并将它们分别成功构建到PGBKT7和PGADT7载体上。运用酵母共转化技术,将带有AD载体的互作蛋白和带有BD载体的效应因子共同转化到酵母感受态Y2HGold中,对它们是否存在互作关系进行了深入研究。结果表明,两个疑似互作蛋白都与效应因子RxLR19781互作。但由于酵母双杂交存在一定的假阳性,因此该效应分子与互作蛋白的互作有待进一步深入的研究。     

大豆疫霉中Myb类转录因子的预测与分析

[目的]为阐明大豆疫霉中Myb类转录因子的作用机理提供科学依据。[方法]以从大豆疫霉基因组数据库中筛选的大豆疫霉Myb类转录因子为研究对象,分析其在大豆疫霉中的分布特点和4个重要值较大的Myb因子在大豆疫霉与寄主互作过程中的转录模式,并对Myb因子进行聚类。[结果]大豆疫霉基因组中含50个Myb,其在基因组中的分布不均 50个Myb因子可聚为6类（A、B、C、D、E、F）,其中聚类组E中Myb因子最多,占总数的40%,聚类组B中Myb因子最少,只有4个 Myb因子在疫霉菌丝数据库中出现的频率最高（0.44%）,在侵染数据库中出现的频率最低（0.26%） 4个Myb因子在疫霉侵染寄主过程中均有转录。[结论]该研究为明确大豆疫霉Myb的生理功能及其在疫霉致病过程中的作用提供了参考。     

稻瘟菌Cdc42若干推测互作蛋白的结构和表达特点

 【目的】已有研究表明稻瘟菌Cdc42(MgCdc42)与酵母Cdc42(ScCdc42)高度同源，参与调控其形态分化和侵染过程，通过分析可能的MgCdc42互作蛋白，以明确这些蛋白其结构和功能。【方法】用ScCdc42互作蛋白经BLAST搜索获得了稻瘟菌基因组中的相应同源物，分析了这些同源物的结构，并通过半定量RT-PCR分析MgCdc42不同突变情况下这些可能的调控蛋白及效应蛋白的表达情况。【结果】MgCdc42正显性突变后，导致所有推测互作蛋白表达量均有所提高；MgCdc42负显性突变，除MgBem1、Chm1、MgGic1表达量未见明显变化外，其余表达量均有所降低；当MgCdc42失活后，所有可能的MgCdc42调控蛋白及效应蛋白之表达量均有所降低。【结论】稻瘟菌可能存在酵母Cdc42相似的信号途径，MgCdc42在其中起着重要的调控作用。     

大豆GmWRI1a基因克隆及生物信息学分析

利用Phytozome数据库、NCBI网站等软件对大豆(Glycine max)基因组中WRI1同源基因进行生物信息学分析,发现大豆WRI1转录因子有2个拷贝,分布在第8和15号染色体上。以大豆未成熟种子cDNA为模板,克隆15号染色体WRI1转录因子的cDNA全长序列,命名为GmWRI1a。应用生物学软件发现,GmWRI1a蛋白含有2个AP2/EREBP结构域(60-225)。进化树分析表明,GmWRI1a包含在第一个分支里,与AtWRI1距离较近,推断其与AtWRI1属于同源基因,具有相似的功能。对与GmWRI1a蛋白存在相互作用的蛋白进行预测分析,发现与其相互作用的蛋白多数参与糖降解或质体脂肪酸合成,结果表明,GmWRI1a转录因子可能在控制种子发育中时从糖到油的碳流动中起重要作用。     

大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体的构建

[目的]构建大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体。[方法]利用PCR方法从大豆疫霉菌cDNA中扩增多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因。用限制性内切酶EcoRI和Not1分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K,然后用T4连接酶将目的基因克隆到pPIC9K载体中构建此载体。[结果]扩增的大豆疫霉菌pspgl基因成熟肽片段大小为1250bp。用基因特异性g}物扩增阳性重组子,可得到大小为1200bp的片段。而用载体特异性引物扩增阳性重组子,可得到大小为1200和1700bp两条带,多出来的400bp恰好符合载体部分的大小。将此特异性片段PCR扩增回收,序列测定发现大豆疫霉pspg1基因已经成功地插入到表达载体中。[结论]该研究为进一步研究大豆疫霉菌pspg1基因在毕赤酵母中高效表达奠定了基础。     

新孢子虫NcGRA7基因酵母双杂交诱饵载体的构建与鉴定

为筛选能与新孢子虫NcGRA7蛋白相互作用的靶蛋白,构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7。应用PCR技术从新孢子虫基因组DNA中扩增出NcGRA7基因,将其克隆至pMD-19T(simple)中,经过酶切鉴定后再连接至酵母双杂交诱饵载体pGBKT7上。结果表明:试验成功获得了NcGRA7基因片段,测序结果中序列无碱基突变,与目标基因序列同源为100%。试验成功构建的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NcGRA7,为使用酵母双杂交技术筛选与NcGRA7蛋白相互作用的蛋白奠定基础。     

大豆疫霉效应因子PsCRN115诱导烟草抗性的机制分析

CRN(crinkling and necrosis induced protein)蛋白是卵菌所特有的一类效应因子,在已经测序的疫霉种中,每个基因组中预测都含有上百个CRN基因,关于其功能和分子机制目前研究不多。前期研究发现,大豆疫霉效应因子PsCRN115是大豆疫霉的致病性必需因子且能抑制植物的细胞死亡。为了进一步研究PsCRN115的功能,本研究采用农杆菌渗入法介导的基因瞬时转化技术在烟草上过表达该基因,发现PsCRN115可显著提高烟草对烟草疫霉的抗性。随后采用荧光定量PCR研究了其作用机制,发现PsCRN115可诱导水杨酸(SA)通路防卫反应基因的高表达,但对乙烯(ET)和茉莉酸(JA)通路防卫反应基因的表达影响不显著。表明:大豆疫霉效应因子PsCRN115是致病必需的因子,能被植物所识别,并诱导植物的防卫反应。     

抗真菌转基因大豆对大豆疫霉根腐病抗病性鉴定

采用下胚轴伤口接种法,对Southern杂交阳性的转菜豆几丁质酶基因和大麦核糖体失活蛋白基因的双价转基因大豆T2代的5个株系,进行了大豆疫霉根腐病抗病性检测,并通过比较接种后转基因大豆与对照组的死亡率来探讨两者的抗病性差异。结果表明,有4个转基因株系对大豆疫霉根腐病的抗性与非转基因对照组相比有明显提高,另外1个株系与对照组相比没有明显差异。     

辣椒疫霉NPP效应子基因家族生物信息学分析

NPP(necrosis-inducing Phytophthora protein)是一类效应子,在卵菌疫霉属病原菌中普遍存在,该类蛋白能够激发植物的防御反应,如引起植物细胞死亡、促使寄主防御基因表达及产生乙烯。利用生物信息学方法对辣椒疫霉(Phytophthora capsici)基因组内的NPP基因家族存在状况进行分析,并对其氨基酸序列组成、基本理化性质、蛋白质三级结构等进行预测分析,旨在了解其结构特征,进而发掘辣椒疫霉的致病相关基因。结果表明:NPP基因家族有25个成员,其中大部分成员存在多个拷贝。对25个NPP氨基酸序列进行分析发现,其分子量在12.45~88.9 ku之间;对其中15个NPP蛋白进行三级结构预测发现,它们的三维结构类似,其主要的结构元件为α-螺旋和β-片层;构建了25个NPP蛋白的进化树,进行了分子进化分析。     

黑龙江省东部大豆疫霉群体遗传多样性时空动态

为明确大豆疫霉群体遗传多样性时空变化规律,采用简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记技术,分析2014~2017年黑龙江省东部生产田和试验田大豆疫霉群体遗传多样性。选用8对SSR引物扩增547株供试大豆疫霉,获得123个条带,其中110个为多态性条带,占89.43%,基因多态性位点主要集中在700、450和350 bp,在450 bp处基因多样性复杂;遗传变异分析表明,随时间推移,黑龙江省东部大豆疫霉群体内基因变化极显著,遗传多样性复杂,基因变异频率升高,群体明显进化。试验田大豆疫霉群体遗传多样性丰富,基因变异频率略高于生产田。     

一对单显性大豆抗疫霉根腐病基因的遗传分析及定位

[目的]大豆疫霉根腐病是大豆毁灭性的病害之一,防治该病最安全有效的方法是培育和利用抗性品种。迄今为止,已在大豆基因组上鉴定了21个大豆疫霉根腐病抗性基因,但是在中国只有少数基因(如Rps1c、Rps1k等)抗性有效。因此,急需发掘新的大豆疫霉根腐病抗性基因,以满足抗病育种的需要。‘大方六月早’对大豆疫霉菌的抗谱较广,是目前筛选出的优异抗源。[方法]采用下胚轴创伤接种方法进行抗病性鉴定,以品种‘大方六月早’为抗病亲本与品种‘矮脚早’配置杂交组合获得F2∶3代家系群体,并进行遗传分析,通过SSR(simple sequence repeat)标记对‘大方六月早’的抗性基因进行定位。[结果]该群体的抗性遗传分析表明:‘大方六月早’对大豆疫霉根腐病的抗性由1对主效基因控制,抗病对感病表现为显性,暂命名为RpsAH。使用SSR标记进行分子作图,抗病基因RpsAH被定位在大豆3号染色体(即N连锁群)上,距离标记Sat_166为4.1 cM。[结论]大豆品种‘大方六月早’对大豆疫霉菌株AH的抗性由1个单显性基因控制,该基因定位于大豆分子遗传图谱N连锁群上。     

用多克隆抗体检测纯培养和植物体内的大豆疫霉菌

用大豆疫霉 Phytophthora sojae菌丝可溶性蛋白免疫家兔制备多克隆抗血清 ,用间接EL ISA 方法测定其与 Phytop hthora sojae、Phytophthora capsici、Phytophthora inf estans、Phytophthora cactorum、Phytophthora cinnamomi、Phytophthora citrophthora、Phytop hthorap arasitica、Phytophthora palmivora 8个疫霉种的 2 3个纯培养菌株的反应 ,同时检测 31株大豆疫霉人工接种发病植株体内的病原菌。结果表明 ,该多克隆抗血清对大豆疫霉纯培养的检测准确率高达 94 % ,对人工接种发病植株体内目标病原菌的检出率达 80 % ,可用于检测大豆疫霉     

栗疫菌CpIAP基因生物信息学分析及功能研究

寻找栗疫菌的凋亡抑制蛋白( inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)类蛋白,明确该蛋白与其他物种IAPs的进化关系,并对CpIAP基因功能进行初步研究.以IAPs家族的典型结构域“BIR”为靶标,对栗疫菌基因组数据库进行BLAST搜索.运用生物信息学对预测的CpIAP蛋白结构进行分析并构建系统进化树;采用同源重组的策略,构建CpIAP基因缺失突变体,并重新导入该基因全长片段获得互补株.结果从栗疫菌中鉴定了1个IAP基因,Southern blot验证为单拷贝.生物信息学分析表明:CpIAP基因全长2 997 bp,编码920个氨基酸,具有2个BIR结构域;进化关系上CpIAP与人Survivin和酵母IAP较近.CpIAP敲除突变体命名为△IAP,△IAP菌落形态改变,生长速率减慢,致病力下降,丧失产孢能力.上述结果表明:CpIAP参与了栗疫菌的菌落形态建成、分生孢子形成和致病过程.     

大豆组成型三重反应基因GmCTR1的克隆与功能分析

【目的】植物激素乙烯参与植物的生长发育以及生物与非生物胁迫过程。组成型三重反应基因CTR1作为乙烯受体下游一个负调控因子,结合乙烯受体共同参与乙烯的信号转导途径。本研究通过对大豆(Glycine max)的组成型三重反应基因CTR1进行克隆和诱导表达分析,以及在大豆发状根中过表达该基因后进行疫霉根腐病的抗性分析,探究CTR1在大豆与疫霉菌互作过程中的功能。【方法】利用同源克隆的方法,以拟南芥的AtCTR1序列为探针,在大豆基因组数据库中搜索同源性最高的基因即为大豆的GmCTR1(Glyma.13G151100),并从Williams82中将GmCTR1克隆出来。对GmCTR1进行多重序列比对、系统进化分析和疫霉菌的诱导表达分析。构建植物过表达载体p Bin GFP2:GmCTR1。应用发根农杆菌介导的遗传转化方法获得大豆发状根,经GFP荧光筛选得到大豆过表达GmCTR1的阳性发状根和转入空质粒的阴性对照发状根。对过表达GmCTR1发状根和阴性对照发状根侵染疫霉菌后,检测病斑长度、疫霉生物量和抗性相关基因的表达。【结果】根据同源序列比对结果,将与拟南芥At CTR1(AT5G03730)同源性最高(75.3%)的大豆基因Glyma.13G151100命名为GmCTR1,从Williams82中克隆得到GmCTR1的CDS序列。该基因的CDS序列全长2 511 bp,编码836个氨基酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,蛋白质量为92.35 k D,等电点为6.51。多重序列比对结果显示,GmCTR1氨基酸具有CTR1同源蛋白的典型结构域和关键特征。构建系统发育树进行进化分析发现,GmCTR1与菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的CTR1亲缘关系十分相近,在同一个分支上,且与菜豆的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,在大豆疫霉菌P6497侵染后,GmCTR1受诱导逐渐上调表达,在侵染48 h后表达水平达到最高,随后表达量降低。利用酶切连接方法将GmCTR1的CDS序列构建到植物过表达载体p Bin GFP2中,PCR和酶切验证获得了重组质粒p Bin GFP2:GmCTR1。对发状根接种疫霉菌后发现,过表达GmCTR1减弱了对疫霉根腐病的抗性,疫霉菌侵染36 h后过表达发状根与对照相比病斑长度显著增长。过表达GmCTR1发状根中疫霉菌的生物量与对照相比增加,与大豆抗病反应相关基因的表达水平显著降低。【结论】GmCTR1在大豆与疫霉菌的互作过程中发挥一定的负调控作用。     

华南大豆种质对大豆疫霉根腐病的抗性分析

【目的】大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌引起的严重影响大豆生产的世界性病害之一,选用抗病品种是控制该病最经济有效的措施。筛选抗大豆疫霉菌PGD1的优异抗源和多抗疫霉根腐病种质资源,推导大豆种质抗疫霉根腐病基因,为热带、亚热带地区大豆抗病育种提供有效抗源。【方法】采用下胚轴创伤接种法,利用在广东发现并分离的大豆疫霉菌PGD1菌株,接种鉴定主要来自广东、广西、福建、海南、湖南、江西和四川等华南省份631份大豆种质资源的抗病性,筛选抗大豆疫霉菌PGD1种质资源;再用其他6个不同毒力的大豆疫霉菌株接种鉴定抗大豆疫霉菌PGD1的种质,筛选多抗资源,通过基因推导方法分析抗病种质的抗病基因类型。【结果】631份大豆种质中有101份种质抗大豆疫霉菌PGD1,占鉴定种质的16.0%;73份为中间反应类型,占11.6%;457份表现感病,占72.4%。其中83份抗大豆疫霉菌PGD1的种质对其他6个不同毒力菌株Pm14、Pm28、PNJ1、PNJ3、PNJ4、P6497的侵染率分别为28.9%、34.9%、9.6%、66.3%、57.8%和10.8%。4份种质同时抗7个不同毒力的大豆疫霉菌株,分别为ZDD21538、ZDD21604、ZDD14286和明夏豆1号,占鉴定种质的4.8%。毒力频率为0的种质有15份,占鉴定种质的18.1%。83份大豆种质对7个不同毒力的大豆疫霉菌株共产生20种反应型,1种反应型与单个抗病基因的鉴别寄主Williams79反应型一致,可能含有抗病基因Rps1c;45份种质产生的9种反应型符合一些2个或2个以上已知抗病基因组合的反应型,这些种质可能含有已知抗病基因组合;38份种质共产生11种反应型既不同于任何含有单个已知抗病基因品种的反应型也不同于2个或2个以上已知抗病基因组合的反应型,它们可能含有新的抗病基因或基因组合。【结论】华南地区大豆种质中蕴藏着丰富的抗大豆疫霉菌PGD1和多抗大豆疫霉菌抗源,这些抗病种质可作为热带、亚热带地区大豆抗病育种的重要亲本和抗病基因定位的重要研究材料。     

葡萄霜霉菌糖基水解酶基因的表达模式与功能分析

【目的】克隆葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）糖基水解酶（glycosyl hydrolase,GH）基因（PvGH）,分析其特征以及在葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中的表达模式,研究其抑制/促进烟草叶片程序性细胞死亡（PCD）以及影响烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）侵染的能力,为深入探究调控寄主植物免疫的机制提供理论依据。【方法】以葡萄霜霉菌Pv5-27菌株作为试材,采用RT-PCR方法扩增获得8个PvGH基因全长,并对其基因及编码蛋白进行生物信息学分析;利用酵母信号肽诱捕系统（SST）验证PvGH的分泌活性;利用实时荧光定量PCR技术检测葡萄霜霉菌侵染葡萄叶片过程中PvGH的表达模式;同时利用农杆菌介导的PVX病毒表达系统在本氏烟上瞬时表达PvGH效应蛋白,分析其对INF1和BAX触发的烟草PCD的抑制能力以及促进烟草疫霉侵染的能力。【结果】8个PvGH基因序列与通过全基因组预测的序列完全一致,长度为1 092—1 392 bp,分别编码364—464个氨基酸,与其他卵菌同源蛋白相似性高达60.62%—86.36%。8个PvGH均不含跨膜结构...     

与大豆疫霉根腐病抗性基因Rps1-c连锁的分子标记研究

以大豆疫霉根腐病近等基因系Williams和Williams79为材料,对它们的基因组DNA进行RAPD分析,160个10-nt随机引物中,只有引物OPQ-04在Williams79中扩增出特异条带,在Williams中未扩增出,且3次重复均获得一致结果。经进一步检测在其它抗病材料中也出现该特异条带,推测该特异条带与大豆抗疫霉根腐病抗性基因Rps1-c连锁,得到显性RAPD标记OPQ-04700。