芒果ANR基因的克隆及其表达分析

花青素还原酶(anthocyanidin reductase,简称ANR)基因是植物产生原花青素的关键基因,对于研究原花青素的代谢有重要的作用。根据已经报道的ANR基因的序列设计兼并引物,采用3'c DNA末端快速扩增(3'RACE)、5'c DNA末端快速扩增(5'RACE)方法,从芒果果实内克隆到1个ANR基因,其全长c DNA序列为1 201 bp。该基因开放阅读框为1 008 bp,编码335个氨基酸,等电点为5.41,分子量为36.33 ku。对基因组扩增得到了1 810 bp长度的片段,分析发现,该基因含有5个内含子,内含子位置分别为130~646 bp、733~814 bp、1 017~1 080 bp、1 259~1 349 bp、1 563~1 651 bp。通过系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白与可可、葡萄等果树具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种中ANR基因的表达进行分析发现,该基因在绿色的桂七品种中表达量较高,而在红色的贵妃品种中表达量较低。     

芒果CHI基因的克隆及其表达分析研究

采用RT-PCR和RACE方法从芒果的果实中克隆得到了一个参与花色素苷生物合成的查尔酮异构酶基因(CHI)的全长的c DNA序列,进而对得到的序列采用了TMHMM、DNAman等软件进行生物信息学分析,发现芒果CHI基因包含编码区、3′和5′非翻译区的长度为960 bp的c DNA序列,开放阅读框为753 bp,编码250个氨基酸;等电点为6.46,分子重量为27.03 Kd;对跨膜结构域进行了预测发现,该基因无跨膜结构域;蛋白二级结构元件以无规则卷曲和β-折叠为主;聚类分析发现:该基因与美洲葡萄、葡萄、龙眼和橄榄等植物的亲缘关系较近,而与拟南芥、萝卜、文心兰等亲缘关系较远;分别对红色和绿色的叶片分析发现:该基因主要在红色叶片中表达量比较高。     

芒果C4H基因的克隆及其表达分析

肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)是植物苯丙烷合成途径的关键酶之一,其蛋白质活性和转录丰度直接影响植物中黄酮类化合物和芳香族化合物的生物合成量。根据已经报道的C4H基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE、5'RACE方法,克隆得到芒果果实C4H基因的全长cDNA序列为1 680 bp。该基因开放阅读框为1 518 bp,编码505个氨基酸,分子量为58.08 ku。蛋白等电点为9.52,分析发现该基因主要定位在线粒体中。通过软件预测得到3种三级蛋白结构图;通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与橄榄、可可等植物具有较近的亲缘关系。对不同着色的芒果品种的C4H基因表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量最高,而绿色的桂七品种中表达量最低。     

芒果UFGT基因的克隆及表达分析

花色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径,类黄酮糖基转移酶(UFGT)是花色素苷合成的最后一个酶,它可以将不稳定的花色素催化成花色素苷。根据已经报道的UFGT基因的序列设计兼并引物,采用3'RACE、5'RACE方法,克隆得到芒果果实UFGT基因的全长c DNA序列。该基因开放阅读框为1 392 bp,编码463个氨基酸,分子量为51.15 ku。对基因组扩增得到2 770 bp长度的片段分析发现,该基因含有2个内含子,分别在501~1 095 bp、1 548~2 330 bp。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与荔枝、山竹子等热带果树具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的UFGT基因表达进行分析发现,红色的芒果品种中表达量较高,黄色的芒果品种中表达量较低。     

芒果BCH基因的克隆与表达

β-胡萝卜素羟化酶(BCH)基因是催化玉米黄素合成的关键基因,玉米黄素在植物光保护过程中发挥着重要的作用。采用RACE方法从黄色的金煌芒果的果皮中克隆得到了1个BCH基因,该基因全长cDNA序列为1 160 bp,开放阅读框为888 bp,编码295个氨基酸,分子质量为32.97 ku,分子等电点为9.51。利用生物信息学在线分析软件对其组成成分、疏水性/亲水性、二级结构、功能结构域以及三级结构进行预测和分析。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与温州蜜柑、柚子、大豆、草莓等具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的BCH基因的表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。     

芒果MinSPP基因的克隆及表达载体构建

磷酸蔗糖磷酸酶(sucrose phosphate phosphatase)是合成蔗糖的关键酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机制,从芒果果肉中克隆得到1个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPP,其cDNA全长序列为1 561 bp,开放阅读框为1 275 bp,编码424个氨基酸,蛋白质分子量为48.46 ku,等电点为5.34,对MinSPP基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与克莱门柚具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示从青熟期到成熟期芒果果肉中该基因表达量逐渐上升,从成熟期到完熟期芒果果肉表达量逐渐降低,其中成熟期芒果果肉中表达量较高。本研究深入了解了芒果蔗糖合成的分子机制,进一步构建了pBI121-MinSPP过表达载体,为MinSPP的功能鉴定奠定了理论基础。     

芒果(Mangifera indica)F3’H基因的克隆及其表达分析

花色素苷的合成是红色芒果果实着色的主要代谢途径,而类黄酮3’羟化酶(F3’H)基因是花色素苷合成的一个关键酶,其参与决定了花色、果实颜色、种皮颜色、茎叶表面等花色素苷的生物合成。本研究根据已经报道的F3’H基因的序列设计兼并引物,采用3’RACE和5’RACE方法,克隆得到了芒果果实F3’H基因的全长c DNA序列为1782 bp。该基因开放阅读框为1548 bp,编码515个氨基酸,分子重量为57.44 k D。通过系统发育分析发现该基因编码的蛋白与西洋梨、草莓、大豆等具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的F3’H基因的表达进行分析发现:红色的贵妃品种中表达量较高,而黄色的金煌品种中表达量较低。     

芒果PAL基因的克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)是酚类物质合成的第一个酶,是催化苯丙烷类反应的第一酶。根据已经报道的PAL基因的序列设计兼并引物,采用3′RACE和5′RACE方法,克隆得到了芒果果实PAL基因的全长cDNA序列。该基因开放阅读框为2160 bp,编码719个氨基酸,分子重量为79.18 kD。对基因组扩增得到了2200 bp长度的片段分析发现,该基因未含有内含子序列。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与问荆、杉木、银杏等植物具有较近的亲缘关系。对不同芒果品种的PAL基因的表达进行分析发现,红色的贵妃品种中表达量较高,而绿色的桂七品种中表达量较低。     

洋葱AcSVP基因的克隆及其表达分析

为了研究SVP(SHORT VEGETATIVE PHASE)基因在洋葱花芽分化和发育中的作用,本研究以洋葱"70-1"为试材,克隆得到了1个SVP同源基因,命名为AcSVP,并采用荧光定量PCR对该基因的表达模式进行了分析,结果表明:AcSVP包含1个741 bp的开放阅读框,编码246个氨基酸。氨基酸同源比对结果显示,AcSVP的氨基酸序列与水仙的相似性较高。系统进化结果也显示洋葱的AcSVP与水仙的亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明,AcSVP在洋葱未开放的花蕾中表达量最高,在花薹抽出前的叶中次之,在花中的表达量最低。根据以上研究结果推测,AcSVP可能参与调控洋葱的花芽分化。     

洋葱AcSVP基因的克隆及其表达分析

为了研究SVP(SHORT VEGETATIVE PHASE)基因在洋葱花芽分化和发育中的作用,本研究以洋葱70-1为试材,克隆得到了1个SVP同源基因,命名为AcSVP,并采用荧光定量PCR对该基因的表达模式进行了分析,结果表明:AcSVP包含1个741 bp的开放阅读框,编码246个氨基酸。氨基酸同源比对结果显示,AcSVP的氨基酸序列与水仙的相似性较高。系统进化结果也显示洋葱的AcSVP与水仙的亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明,AcSVP在洋葱未开放的花蕾中表达量最高,在花薹抽出前的叶中次之,在花中的表达量最低。根据以上研究结果推测,AcSVP可能参与调控洋葱的花芽分化。     

芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC的克隆及表达分析（英文）

精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)在植物多胺生物合成中发挥着重要作用。为了研究精氨酸脱羧酶基因(ADC)在芒果中的结构与表达情况,试验采用RACE技术从芒果嫩叶中克隆获得芒果精氨酸脱羧酶基因MiADC,并以MiADC基因的cDNA序列为基础,采用qRT-PCR分析该基因的表达情况。序列分析结果显示:芒果MiADC基因全长3 089 bp,包括575 bp 5’-UTR,2 178bpORF,311bp3’-UTR和25bppoly(A),且无内含子。NCBI比对分析显示:该基因与枳(Poncirus trifoliate)精氨酸脱羧酶基因(HQ008237.1)的相似性最高,为78%;其预测蛋白同样与枳(Poncirus trifoliate)精氨酸脱羧酶(AEE99192.1)的相似性最高,为78%。系统发生树分析表明:芒果MiADC与枳(Poncirus trifoliate)的精氨酸脱羧酶处于同一进化枝上。表达分析显示:MiADC基因在根、茎、叶、花、幼果、成熟果组织中均有表达,且该基因的转录水平受低温处理的影响。因此,芒果MiADC基因可能是一个低温胁迫应答基因。     

梅花PmWRKY40基因的克隆及其表达分析

为揭示梅花WRKY基因的功能,采用RT-PCR技术从梅花品种‘雪梅’(Prunus mume ‘Xuemei’)中分离得到1个WRKY转录因子基因PmWRKY40。序列分析结果显示,该基因cDNA全长1 072bp,完整开放阅读框972bp,编码323个氨基酸,包含1个WRKY结构和1个C2H2型锌指结构。系统进化分析结果显示,梅花PmWRKY40蛋白与欧洲甜樱桃亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明:PmWRKY40基因受低温、氧化胁迫诱导,但诱导程度存在差异。此外,SA处理显著提高PmWRKY40的表达,ABA处理则抑制该基因表达。推测PmWRKY40可能在梅花响应低温胁迫过程中起重要作用。     

桑树硝酸还原酶基因MaNR的克隆及其表达分析

【目的】以桑树栽培品种桂优62号为材料,克隆桑树硝酸还原酶（nitrate reductase,NR）基因全长cDNA和DNA序列并分析其序列特征,在此基础上研究桑树硝酸还原酶基因在桑树细胞脱分化和分化过程中的表达特征以及影响因素,为进一步阐述硝酸还原酶在桑树生长发育中的作用机制奠定基础。【方法】基于单倍体川桑（Morus notabilis Schneid）基因组数据（http://morus.swu.edu.cn/morusdb）注释的scaffold570序列设计特异引物,硝酸钾处理桑树叶片48 h后使用RNAiso Plus（TaKaRa）和改良CTAB法提取总RNA及基因组DNA,分别以cDNA和DNA为模板,用RT-PCR法克隆获得桑树NR全长cDNA和DNA序列,运用生物信息学手段对推定的氨基酸序列进行分析。以桑胚轴为外植体,在无菌条件下,接种在不同氮源、生长调节物质的培养基中,通过桑树胚轴离体再生过程和real-time PCR方法研究硝酸还原酶基因在离体再生过程中的表达差异以及不同氮源、生长调节物质对NR表达的影响。【结果】克隆获得的桑树NR全长CDS序列,长2 730 bp,编码909个氨基酸,推导的蛋白质分子量为102.84 kD,等电点为6.76。基因组序列长5 142 bp,包含5个外显子和4个内含子,具有完整的5个结构域。通过氨基酸序列比对发现,其序列高度保守,与川桑NR序列同源性达95%,与蔷薇科果树NR序列同源性达78%。聚类分析表明,单子叶植物聚为一组,桑树与蔷薇科果树聚为一组。GenBank登录号分别为KF992020.1和KF992021.1。NR在桑根中表达量最高,叶中表达次之,茎中表达最少;谷氨酸显著提高NR在桑叶中的表达量,GA3显著提高NR在桑茎中的表达量。桑胚轴在单一的NH4+-N培养基中,不能被诱导出愈伤组织及丛生芽,在单一的NO3--N培养基中可以诱导出愈伤组织和丛生芽;但丛生芽继代培养在单一NH4+-N的培养基中和单一的NO3--N培养基中都可以生长。real-time PCR结果显示,NR在子叶和胚轴中的表达量高于胚根。桑胚轴在离体诱导愈伤组织和丛生芽分化过程中,NR的表达量逐渐增加,丛生芽形成后NR的表达量降低并趋于稳定。NH4+-N和NO3-N对NR在继代丛生芽中没有显著影响,谷氨酸对NR在继代丛生芽中有抑制作用,随着培养时间延长,丛生芽的NR相对表达量都降低。【结论】获得了桑树NR全长cDNA序列。硝态氮是桑胚轴诱导的必需营养因子,NR的表达受到桑树细胞脱分化和分化影响。     

草鱼PepT2基因的克隆及其表达分析

采用RT–PCR和cDNA末端快速扩增技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus) II型小肽转运载体(PepT2)基因全长c DNA序列,对其进行生物信息学和共线性分析,并采用实时荧光定量PCR技术检测分析健康草鱼PepT2基因在不同组织中的表达情况。结果表明：草鱼PepT2基因的cDNA序列全长为2733 bp,包括开放阅读框2169bp(编码722个氨基酸残基),5′非编码区82 bp和3′非编码区482 bp;草鱼PepT2基因结构含有20个外显子和19个内含子;预测蛋白相对分子质量为8.032×10⁴,等电点为6.01,该蛋白具有与哺乳动物同源蛋白类似的12个螺旋跨膜结构,并且在跨膜区9和10之间有1个大的外环,跨膜区氨基酸高度保守,含有6个蛋白激酶C磷酸化位点和3个N–糖基化位点;预测的PepT2蛋白三级结构包含有18个α–螺旋和21个β–折叠;氨基酸序列同源性分析结果显示,草鱼PepT2氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,为86.65%,与其他所比较的物种的同源性则为52.83%～68.15%;系统进化树分析...     

芒果炭疽病菌lac基因的克隆

利用植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(TIANGEN)提取芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)DNA为模板,参考文献资料设计特异性引物,利用聚合酶链反应(PCR)扩增得到长度约920bp的基因片段,再用DNA回收试剂盒回收此片段,将其与载体pMD18-T过夜连接后转化到感受态大肠杆菌JM109中,电泳检测克隆结果后,选择阳性克隆菌液,寄往上海国家人类基因组南方研究中心测序,测序结果与NCBI网站中的参考序列进行同源比对,结果显示该片段与多个植物病原真菌的编码漆酶的lac基因同源性达到70%～92%,这表明本试验扩增克隆获得的lac基因片断是正确的,但未克隆到全长。     

细叶百合LpSVP基因的克隆及其表达分析

从细叶百合(Lilium pumilum)中克隆得到LpSVP基因,该基因ORF全长为675bp,编码224个氨基酸。序列同源性和系统进化树分析表明该基因属于MADS-box基因家族下SVP类基因;生物信息学分析表明蛋白相对分子量为25.783kDa,理论等电点为5.62,为亲水蛋白,没有跨膜结构;亚细胞定位预测于细胞核中;蛋白质二级结构a-螺旋占60.71%,随机卷曲占29.02%,延伸链占10.27%;蛋白质三级结构以同型四聚体形式存在。半定量分析表明该基因在鳞茎、叶片、雌蕊、雄蕊和花瓣中均表达,但表达有强弱差异;实时荧光定量分析表明在花发育过程中该基因表达量先增长后下降。该研究为深入了解LpSVP基因功能奠定了基础。     

团头鲂SREBP1基因的克隆及其表达分析

为阐明团头鲂SREBP-1的功能,采用RT-PCR技术克隆获得SREBP-1基因的cDNA序列,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SREBP-1基因在不同发育时期及不同组织中的表达情况。生物信息学分析发现,SREBP-1基因cDNA的编码序列(coding sequence,CDS)为3 426bp(GenBank登录号:MH633449),开放阅读框(ORF)编码1 141个氨基酸,与大西洋鲑、斑马鱼、草鱼、鲤、金线鲃SREBP-1的氨基酸序列相似性较高(74%～99%)。保守结构域分析显示,团头鲂SREBP-1蛋白具有SREBPs家族典型的"碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链"(bHLH-Zip)结构域。表达分析结果显示,SREBP-1基因在团头鲂胚胎发育过程中的表达呈现先下降后增高的趋势,在眼囊期最低,至出膜期达到最高。在团头鲂幼鱼中,SREBP-1在脑组织中的表达量最高,其次是眼、肝脏、心脏、肌肉、脂肪组织、肾脏,鳃中表达量最低。在成鱼中,SREBP-1在脑组织表达量最高,其次是性腺组织、肌肉、肝脏、眼,肾脏、脾脏和心脏中的表达量较低。以上结果表明,SREBP-1基因在团头鲂幼鱼和成鱼的不同组织中的表达模式存在差异。     

家蚕TCTP基因的克隆、分析及其表达

 【目的】在家蚕基因表达谱研究中鉴定了近4万个特异的SAGE标签，为了研究这些标签所对应基因的功能，选择了其中一个SAGE标签，探索这个SAGE标签对应的基因序列，表达特征以及相关的功能。【方法】在SAGE结合GLGI结果的基础上，利用5’RACE获得基因的全长，根据不同物种间该基因的同源性来构建系统发生树，通过PCR检测该基因在家蚕不同时期、不同组织中的表达特征，并在原核表达系统中表达该基因。【结果】从cDNA中获得了家蚕TCTP基因的全长序列，构建了不同物种间TCTP的系统发生树，PCR结果表明TCTP基因在家蚕的各个时期、各个组织中都稳定的表达，并且成功的在原核表达系统中表达了该基因。【结论】从cDNA中获得了TCTP基因的全长序列，并且成功在原核系统中表达，证明了通过笔者的实验方法能够获得新的基因；系统发生树显示亲缘性越近的物种TCTP间的同源性越高；家蚕TCTP基因在家蚕生命的各个时期、各个组织都有重要的生物学功能；这些工作为进一步研究其具体功能奠定了基础。     

鲤Myf-6基因的克隆及其表达分析

根据斑马鱼(Danio rerio)Myf-6基因序列设计引物,用鲤(Cyprinus carpio)肌肉组织总RNA,经RT-PCR扩增获得Myf-6基因开放阅读框(ORF序列)720 bp,GenBank登陆号为GU339054。编码239个氨基酸,与斑马鱼、大西洋鲑、刀鱼、河豚等同源性分别为90%、76%、76%和72%,但与哺乳动物如人、牛、兔、小鼠和绵羊的同源性较低,为59%~60%。利用半定量RT-PCR分析鲤Myf-6基因的mRNA表达特性,结果在心脏、肾脏、脂肪、肝胰脏、肌肉和脾脏中均检测到Myf-6基因的表达,并且在肌肉组织中表达量显著高于其他组织(P0.05)。Myf-6基因表达随着生长发育变化呈下降趋势,在较大规格试验鱼(500 g)的表达极显著低于其他两种规格(50~60 g1、20~130 g)试验鱼的表达(P0.01)。     

水牛Sohlh2基因的克隆分析及其表达

为阐明广西沼泽型水牛Sohlh2基因在水牛不同组织中的表达规律,根据Gen Bank已公布的牛Sohlh2基因序列,设计其编码区(CDS)扩增引物,应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,系统分析了水牛Sohlh2的遗传进化以及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用RT-QPCR技术对Sohlh2基因在水牛组织(器官)的表达进行了分析。结果表明:水牛Sohlh2基因编码区全长1 281 bp,共编码426个氨基酸。多重序列比较分析结果显示水牛Sohlh2核苷酸序列与牛、绵羊、山羊、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为98%、96%、96%、85%、86%、81%和72%,系统进化树显示Sohlh2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。Sohlh2蛋白质呈弱碱性,无信号肽,在细胞中亚定位于细胞核中,存在b HLH结构。水牛Sohlh2基因在水牛垂体、大脑、肝脏、骨骼、卵巢和睾丸等11个组织(器官)细胞中具有不同程度的表达,其中睾丸细胞中表达量最高,垂体和生殖脊细胞中表达量次之,卵丘细胞中表达量低,心脏、肺脏、肌肉细胞和颗粒细胞中不表达。