IBDV HI株VP2基因的原核表达

【研究目的】为了研究鸡传染性法式囊病毒的分子生物学特性,【方法】应用反转录（RT—PCR）技术从河南传染性法式囊发病鸡中总RNA克隆出1461bp的VP2基因,并将其克隆于pET-28a载体,筛选并构建了pVP2表达载体。【结果】经IPTG诱导后,在其宿主菌BL21（DE3）中成功表达了53．7ku蛋白。【结论】经SDS—PAGE和Western blotting分析,VP2表达产物以包涵体形式存在,并与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的原核表达及其抗原性

参考GenBank中的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)全基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增了DHV-ⅠVP3基因,将VP3基因与pET-28a(+)表达载体连接后,转化宿主BL21(DE3),用0.1 mmol·L-1的IPTG诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,Western-blotting分析蛋白免疫原性。电泳结果表明,VP3在大肠杆菌中表达量较高,表达产物的分子量约为27 kD。免疫印迹试验表明Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。     

呼和浩特布鲁氏菌分离株bp26基因的原核表达

目的:克隆布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因并构建原核表达系统.方法:用聚合酶链式反应技术扩增得到布鲁氏菌bp26基因片段,与PEASY-E1载体链接,转入BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后,经SDS-PAGE检测重组蛋白表达,用Western blot鉴定目的蛋白的生物活性.结果:DNA测序结果显示,重组质粒bp26基因的插入位点正确,成功构建了重组质粒PEASY-E1-bp26,经IPTG诱导,表达出大小为27kDa的bp26融合蛋白.结论:获得布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因片段,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的bp26融合蛋白.     

番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及鉴定

[目的]使番鸭细小病毒(DPV)VP3在原核表达系统中正确表达.[方法]根据番鸭细小病毒VP3基因序列,设计一对特异性引物,利用PCR技术扩增出VP3基因;将其克隆至原核表达载体p ET-32a,获得重组表达载体p ET-32a-VP3.将重组质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白.[结果]成功表达出与预期大小相符的重组蛋白,约89 k Da;且当IPTG浓度为1.2 mmol/L,诱导时间为6 h时蛋白表达量最大.[结论]该研究通过原核表达系统成功表达了DPV、VP3蛋白,并摸索了蛋白最佳表达条件.     

毛竹PePsbS1基因的分子特征及其原核表达

PsbS蛋白在植物非光化学淬灭(NPQ)中发挥着重要作用。采用同源比对方法从毛竹(Phyllostachys edulis)全长cDNA文库中得到1个PsbS同源基因序列(FP091683),命名为PePsbS1。该基因全长1 069 bp,具有多种光应答元件和参与光应答的顺式作用元件。PePsbS1的开放阅读框为807 bp,编码一个268 aa的蛋白。蛋白结构分析表明,该蛋白由转导肽(53 aa)和成熟蛋白(215 aa)组成,成熟蛋白包含1个叶绿素a/b结合蛋白功能域、4个跨膜区;疏水性分析表明该蛋白组成氨基酸以疏水性氨基酸为主,占42.5%;Blastp分析发现该蛋白与玉米的一致性最高,达80.3%。构建含有PePsbS1编码成熟蛋白序列的原核表达载体pET23a-PePsbS1-mature,转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明,分离纯化获得目的蛋白的分子量约为28 kD,与预测PePsbS1编码成熟蛋白的大小相符。这将有助于对竹子PsbS蛋白结构与功能的深入研究。     

A型口蹄疫病毒VP3基因的克隆及原核表达

从实验室冻存的含A型口蹄疫病毒的细胞中提取FMDV总RNA,通过RT- PCR获得cDNA.并根据FM-DV全基因组序列设计了1对针对VP3基因的引物,通过PCR扩增得到目的基因VP3并亚克隆入pMD 18-T载体.将鉴定出的阳性质粒和表达载体PET32a用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切回收后连接,获得阳性重组质粒PET32-VP3.用IPTG诱导重组质粒表达目的蛋白VP3,并用SDS - PAGE进行检测,表达产物用镍亲和树脂进行纯化.结果证明口蹄疫病毒VP3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达且表达产物得到了纯化,为实验室进一步研究提供了重要的材料.     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR) ,扩增克隆传染性法氏囊病病毒超强毒 (vv IBDV) HZ株 VP2基因 ,并对 VP2基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析 ,同时将VP2基因与真核表达载体 pc DNA3相连接。结果克隆到 VP2基因全序列长 1 356bp,分析表明 HZ株与欧洲超强毒株 UK661高度相似 ,同时将 VP2基因正向插入 pc DNA3的 CMV启动子下游 ,得到了 VP2基因的真核表达质粒。为 IBDV分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础     

IBDV超强毒HZ株VP2基因的克隆和真核表达质粒的构建

利用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,扩增克隆传染性法低囊病病毒超强毒（ｖｖＩＢＤＶ）ＨＺ株ＶＰ２基因,并ＶＰ２基因进行全序列测定、序列分析和聚类分析,同时将ＶＰ２基因与真核表达载体ｐｃＮＤＡ３相连接。结果克隆到ＶＰ２基因全序列长１３５６ｂｐ,分析表明ＨＺ株与欧洲超强毒株ＵＫ６６１高度相似,同时将ＶＰ２基因正向插入ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,得到了ＶＰ２基因的真核表达质粒。为ＩＢＤＶ分子流行病学和基因工程疫苗的研究奠定了物质基础。     

番鸭细小病毒YL08株VP2和VP3蛋白的原核表达及免疫反应性

为获得番鸭细小病毒(muscovy duck parvovirus, MDPV)重组结构蛋白VP2、VP3,本研究以含有MDPV YL08株VP1基因的重组载体pET-32a-VP1为PCR扩增模板,分别亚克隆VP2、VP3基因。构建了重组载体pGEX-6p-VP2、pGEX-6p-VP3并将它们转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,分别构建了重组菌株pGEX-6p-VP2/Rosetta(DE3)和pGEX-6p-VP3/Rosetta(DE3)。2种重组菌株在IPTG诱导下分别获得了重组蛋白GST-VP2和GST-VP3,分子质量分别为91、86 ku。Western blot分析结果表明,重组蛋白GST-VP2和GST-VP3可特异性结合GST-tag单克隆抗体和MDPV感染番鸭血清,免疫反应性良好。Dot-ELISA比较分析结果表明,在等质量条件下,GST-VP2的免疫反应性强于GST-VP3。     

IBDV VP3结构蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

应用RT-PCR技术从鸡IBDV总RNA中克隆出893bp的VP3基因,并将其进一步克隆于pET-28a载体T7启动子的下游,构建了pETVP3原核表达载体。经IPTG诱导,在其宿主菌BL21(DE3)中成功表达了35.5,33kDa的鸡IBDVVP3蛋白。经SDS-PAGE和Westernblotting分析,VP3表达产物以包涵体形式存在,并与鸡IBDV抗血清特异性反应。     

鸭1型甲肝病毒亚型VP3基因的克隆与原核表达

参照鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)的基因组序列设计了1对VP3基因特异性扩增引物,通过RT-PCR方法扩增获得了DHAV-1a结构蛋白VP3基因,将纯化的VP3基因与pEASYTM-Blunt Zero Cloning Vector连接,构建DHAV-1aVP3基因克隆重组质粒,然后将VP3基因片段插入pET-32a(+)表达载体,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。以1.0mmol·L-1 IPTG于37℃诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot分析表明VP3基因于大肠杆菌中成功表达,其分子量为47kDa,且表达的VP3蛋白能够与Anti-His Mouse mAb发生特异性反应,具有良好的生物活性,为进一步研究DHAV-1aVP3蛋白功能和以VP3蛋白为抗原研制DHAV-1a诊断试剂盒奠定基础。     

猪轮状病毒VP6基因的原核表达载体构建和表达

根据已报道的猪轮状病毒VP6基因序列设计了2对引物,利用pGEM-T-Easy-VP6重组质粒为模板,经PCR扩增获得了1 194 bp的产物。将扩增片段分别插入到pET5α和pGEX-4T-2构建表达载体,并分别在大肠杆菌BL21(DE3)Plyss和ER2566中表达。结果表明:成功构建了重组质粒,而且该片段在大肠杆菌中也成功表达,获得了大小为44 kD的蛋白。     

IBDV VP2蛋白P22表位多肽的原核表达及初步鉴定

为了进一步了解传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白P22多肽抗原表位的功能,根据IBDVVP2蛋白的三维结构,设计合成编码P22多肽的基因序列,通过大肠杆菌密码子优化,并将基因序列P22串联二次合成并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。用IPTG诱导P22基因的表达。表达纯化后的P22多肽经SDS-PAGE电泳和Western-blot分析及传染性法氏囊病毒快速检测试纸条检测。结果表明,P22表位多肽的分子质量约为16kD,并能被His单抗识别,用试纸条检测纯化的P22多肽,呈阳性反应结果。提示IBDV VP2蛋白P22多肽能与IBDV单抗特异性反应。     

鸡传染性贫血病毒VP1基因的原核表达

根据GenBank上公布的鸡传染性贫血病毒VP1的基因序列设计一系列引物,通过基因扩增得到了鸡传染性贫血病毒(CAV)VP1基因的全长片段和一系列不同N末端截断的VP1基因片段,分别将这些片段插入表达质粒载体pET28a的多克隆位点上,构建成4种重组表达工程菌(E.coli BL21/pET-28-CAVVP1、E.coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd29、E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56、E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137),研究了4种不同长度VP1片段在重组大肠杆菌中的表达,并通过SDS-PAGE电泳筛选最佳表达方式。结果表明:E.coli BL21/pET-28-CAVVP1Nd29能表达分子质量为44ku的可溶性蛋白,E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd56能表达分子质量为40ku的不可溶性蛋白,而在E.coli BL21/pET-28-CAV VP1和E.coli BL21/pET-28-CAV VP1Nd137的诱导表达产物中未见明显的表达蛋白出现。其中可溶性的CAV VP1Nd29蛋白将有可能用于研制CAV诊断抗原和亚单位疫苗研究。     

刚地弓形虫NT株MIC3基因的克隆和原核表达

为构建刚地弓形虫微线体蛋白3(MIC3)原核表达体系,获得高纯度MIC3蛋白用于制备单克隆抗体,评价MIC3蛋白在临床诊断方面的应用价值,根据刚地弓形虫MIC3基因编码的已知序列设计引物,应用PCR技术从刚地弓形虫NT株的基因组DNA中扩增出去除信号肽的MIC3基因,将该基因克隆入pET-32a(+)表达载体,构建pE...     

猪细小病毒自然弱毒N株VP2基因的克隆及原核表达

为了进一步研究猪细小病毒自然弱毒株(PPV-N株)的自然弱毒分子生物学机理,对PPV-N株VP2基因进行克隆、测序和原核表达研究.结果表明,成功构建PPV-N株VP2基因的克隆重组质粒pMD18-T-VP2及表达重组质粒pET32a-VP2,经SDSPAGE及Western blotting鉴定,PPV-N株VP2基因在BL21(DE3)plysS菌中成功进行融合表达,表达出约85.4 KDa的VP2融合蛋白,且表达的VP2融合蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应.PPV-N株VP2基因的成功克隆及原核表达为今后研究PPV-N株的自然弱毒的分子生物学机理和研制PPV诊断抗原奠定了基础.     

鹅细小病毒四平分离株VP3基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅细小病毒(GPV)核苷酸序列,设计并合成了1对引物,对吉林农业大学预防兽医学研究室分离鉴定的GPV四平株(SP)主要保护性抗原蛋白VP3基因进行扩增。所得到的PCR产物片段大小约1.6 kb,与预期片段大小相符。将该片段纯化后与T载体连接,转化到感受态大肠杆菌JM-109中进行克隆。对所提质粒进行快速鉴定、PCR鉴定以及限制性内切酶NheⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒,对重组质粒测序并进行核苷酸序列分析。结果表明:GPV四平株VP3基因长1 605 nt,包含了完整编码GPV VP3蛋白阅读框,且与国内GPV分离株B,GD,HG5/82相应核苷酸序列和氨基酸序列的同源性较高,分别为96.2%,96.3%,96.4%和97.4%,98.7%,98.9%。据此认为,GPV四平株VP3基因可以作为构建具有普遍应用价值的基因工程疫苗的候选基因。     

番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得针对番鸭细小病毒VP3蛋白的多克隆抗体,根据已发表的该病毒基因序列设计一对引物,利用PCR扩增出VP3基因,将其克隆到原核表达载体p ET-32a,转化感受态细胞BL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白。将重组蛋白切胶免疫BALB/c小鼠,制备抗番鸭细小病毒部分结构蛋白的多克隆抗体。结果显示成功获得VP3基因,构建的原核表达重组质粒成功表达预期的重组蛋白,免疫小鼠获得的多克隆抗体能与番鸭细小病毒及VP3蛋白反应。表明制备的多克隆抗体可用于MDPV的检测,并为进一步研究MDPV奠定了基础。     

脑心肌炎病毒VP1基因的克隆与原核表达

【目的】为获得重组脑心肌炎病毒VP1蛋白。【方法】利用RT-PCR方法对脑心肌炎病毒的VP1基因进行特异性扩增,并在pEASY-Blunt Zero载体中进行克隆。测序正确后,用Nde I和Hind III对重组质粒进行双酶切,将目的片段连接入原核表达载体pET-30a,提取质粒pET-30a-VP1,将质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达和纯化。【结果】重组的结构蛋白VP1以包涵体的形式存在,纯化后获得的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在31.5kD处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-30a-VP1。【结论】以原核系统成功表达脑心肌炎病毒VP1蛋白,进一步为犬的脑心肌炎病毒的血清学检测奠定基础。