核桃JrLFY基因表达载体的构建及工程菌的筛选

为了研究核桃JrLFY基因的功能,利用RT-PCR技术扩增JrLFY基因ORF,设计含NdeⅠ/KpnⅠ酶切位点的引物获得该基因CDS区片段,用限制性内切酶NdeⅠ/KpnⅠ双酶切p RI 101-AN表达载体,利用In-Fusion技术成功构建p RI 101-AN·JrLFY表达载体,并将该表达载体转化农杆菌GV3101感受态细胞,成功获得工程菌,为其基因缺失或过表达等试验提供技术支持。     

枯草杆菌ylyA基因表达载体的构建及诱导表达

ylyA是枯草杆菌的一种功能未知基因,本研究旨在建立YlyA的诱导表达体系,为其结构分析和功能研究奠定基础。PCR扩增ylyA序列,将其克隆到pETMCSIII中构建表达载体pNG252,测序分析无突变后用IPTG诱导6×His-YlyA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,对表达产物进行分析。实验结果表明:pNG252中ylyA插入方向正确,序列无突变;新鲜的转化子培养至OD600为0.7左右时,用0.000 5 mol.L-1IPTG,37℃诱导3 h,YlyA高效表达。因此本研究成功构建了YlyA高效可诱导表达载体并建立了YlyA蛋白的诱导表达条件,所得到的6×His-YlyA融合蛋白,纯化后可用于YlyA晶体结构分析和功能研究。     

抗菌肽Thanatin基因表达载体构建与表达

根据大肠杆菌的密码子偏好性,人工设计并合成了3条寡核苷酸片段,相邻片断有17个碱基的重叠区,通过PCR扩增得到抗菌肽Thanatin基因,将此基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,然后将重组质粒pGEX- Thanatin转化E.coli BL 21,经IPTG诱导进行融合表达.通过SDS - PAGE分析,融合蛋白GST -Thanatin 表达成功.     

棉花GhNCED2基因表达载体构建及转基因烟草表达分析

[目的]9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是高等植物脱落酸(ABA)生物合成途径中的关键限速酶.为了进一步研究GhNCED2基因的功能.[方法]构建该基因植物超表达载体PZP35S - GhNCED2,通过农杆菌介导法转入野生烟草,并利用卡那霉素筛选、PCR扩增验证和RT - PCR表达分析.对转基因烟草T1代分别进行2; NaCl、4℃、20; PEG逆境胁迫处理,利用实时荧光定量RT-PCR分析表明.[结果](1)GhNCED2基因已整合入烟草基因组中,并能在T1代中稳定表达.(2)随着时间的推移其表达量变化规律基本一致呈现先上升后下降的趋势,2; NaCl、20; PEG胁迫后GhNCED2基因相对表达量到达峰值的时间稍落后于4℃胁迫,20; PEG处理后基因的相对表达量要高于其他处理.[结论]干旱、盐碱及低温胁迫均都能诱导GhNCED2基因的大量表达,且该基因对干旱胁迫的响应更加积极,而对冷害更加迅速.     

杜仲EuCHIT1基因表达载体构建及在大肠杆菌中的表达

构建了T7启动子驱动杜仲几丁质酶基因EuCHIT1的原核表达载体pET-EuCHIT1和pMCSG-EuCHIT1,其表达产物分别含6个组氨酸(6His)标签和6个组氨酸连接的麦芽糖结合蛋白(his6-tag–maltose-binding protein,MBP)标签,分别将重组载体遗传转化大肠杆菌细胞BL21(DE3),在37℃、150 rpm条件下培养至菌液OD值为0.4~0.8后,转到16℃、150 rpm条件下以1 m MIPTG诱导培养12 h,表达产物经SDS-PAGE分析,p ET-EuCHIT1/BL21(DE3)表达以包涵体形式存在36.03 kD融合蛋白,pMCSG-EuCHIT1/BL21(DE3)成功表达可溶形式存在的77.21 kD融合蛋白。故可以使用pMCSG-EuCHIT1/BL21(DE3)获得可溶的融合蛋白,为之后的EuCHIT1的多克隆抗体的制备和及功能研究奠定基础。     

水稻OsXCP2基因表达载体及RNAi载体构建

木质部半胱氨酸蛋白酶XCP2(xylem cysteine proteases2)是植物管状细胞凋亡过程中的自溶酶,参与植物与多种病原物互作,但目前未见对水稻XCP2蛋白酶的报道。此研究克隆获得水稻XCP2编码基因orf序列,经BglⅡ和SpeI酶切纯化后,克隆到植物表达载体pCAMBIA1302(含GFP、his tags)。将该基因orf序列信息提交至NCBI比对,查找到其特异序列,利用Gateway技术将该特异序列重组到植物RNAi载体pB7GWIWG2(Ⅱ),并冻融法将重组质粒转化进入土壤农杆菌GV3101。为进一步探究水稻OsXCP2基因在水稻木质部细胞凋亡及水稻与病原物互作中的作用提供条件。     

棉花GhCAD6基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

[目的]以GUS基因为报告基因,构建GhCAD6基因的瞬时表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM-T-CAD6质粒为模板,获得GhCAD6基因目的片段.然后将其克隆到瞬时表达载体pRTL2-GUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CAD6融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CAD6转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色.[结论]构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达,为进一步研究棉花GhCAD6基因的功能奠定了实验基础.     

棉花GhCCR4基因表达载体构建及GUS基因的瞬时表达

研究以GUS基因为报告基因,构建CCR4基因的瞬时表达载体,首先酶切带有CCR4基因的 pGEM-T-CCR4载体,获得CCR4基因目的片段,然后将其克隆到瞬时表达载体pGUS/NIa中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的pGUS-CCR4融合表达载体,使目的基因能够和GUS基因同时表达.采用基因枪法将pGUS-CCR4转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h,经GUS组织化学染色,检测到多个洋葱细胞呈现蓝色,表明构建的瞬时表达载体可在植物细胞中高效表达.为进一步在棉花中研究GhCCR4基因的功能奠定了实验基础.     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.     

LMW-GS16基因表达载体的构建

采用PCR方法对来自大麦的LMW-GS16基因进行修饰,在基因5′及3′端分别加入构建表达载体所需的BamHⅠ和SacⅠ限制酶切位点,并将其连接在相应酶切的质粒pBI121上,构建成LMW-GS植物表达载体pBI121-16。重组质粒转化到E.coliDH5α和农杆菌LBA4404中,通过Kanamycin筛选阳性克隆,用PCR方法进行鉴定。对照组转化率为零,转化组阳性克隆特异地扩增出900 bp片段,与目标基因DNA大小一致,转化率为1.0×106/μg DNA。     

猪CR YAB基因原核表达载体的构建及表达条件的优化

将猪CRYAB基因cDNA连接到原核表达载体pRSET A中,构建重组表达质粒pRSET A-CRYAB,经酶切和测序鉴定后,转入表达宿主大肠杆菌BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表明,如期获得了重组蛋白的表达,其主要以包涵体的形式存在,且最佳条件为诱导温度25℃,时间15h,IPTG浓度为0.2 mmol/L.     

拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定

[目的]以拟南芥为材料克隆CDR6基因,构建CDR6基因的过量表达载体并筛选鉴定获得过表达植株.[方法]提取拟南芥mR-NA,反转录成cDNA,并以此为模板克隆CDR6基因CDS全长,通过限制性内切酶切割、T4 DNA连接酶连接,将CDR6基因CDS全长连接到带有35S强启动子的pXB094载体上;然后转化至Trans1-T1感受态细胞中,菌落PCR鉴定阳性单克隆并测序确认.将重组质粒转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,通过浸花法侵染拟南芥野生型植株,通过抗性筛选和鉴定获得预期的转基因植株.[结果]菌落PCR鉴定和测序结果表明CDR6基因已成功构建至pXB094载体;通过抗性筛选并鉴定获得了过量表达阳性植株.[结论]筛选和鉴定获得的过量表达植株为研究CDR6基因的分子功能奠定了基础.     

枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体的构建及木聚糖酶基因的表达

构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体并用菌体自身信号肽引导表达外源木聚糖酶基因,为枯草芽孢杆菌木聚糖酶高效分泌表达系统的建立奠定基础。利用基因工程的原理和方法,将壮观霉素抗性基因(spec)与短小芽孢杆菌的木聚糖酶基因(xynA)克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体GJ148上,构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到已构建载体上,以枯草芽孢杆菌WB700为表达宿主,引导木聚糖酶基因进行表达。最终成功构建枯草芽孢杆菌信号肽筛选载体pYG,将枯草芽孢杆菌信号肽Epr克隆到pYG上,在WB700中引导并表达木聚糖酶基因。试验证明信号肽筛选载体可以成功构建,在克隆入信号肽后可成功表达木聚糖酶基因,为信号肽的系统性筛选和木聚糖酶高效表达提供依据。     

卡拉库尔羊TNF-α基因原核表达载体的构建及表达条件优化

利用反转录PCR (RT-PCR)技术扩增卡拉库尔羊肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因,连接到pET-28b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在不同的IPTG浓度、时间、温度条件下诱导TNF-α的表达.结果表明,原核表达栽体pET-28b-TNF-α构建成功,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,优化的诱导表达条件为诱导温度37℃、诱导时间4h、IPTG浓度1.0 mmol/L.     

人工雄性不育基因及恢复基因表达载体的构建

结合Cre／loxp定位重组系统和杂种一代的育种特点,构建了雄性不育基因表达载体pCABARTABn和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre。将位于质粒pTTABn中的雄性不育基因表达盒(含TA29启动子、barnase基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp2个同向lox位点之间,再将上述表达盒连同lox位．占、切下插入pCAMBar,获得以除草剂Basta为筛选剂的雄性不育基因表达载体pCABARTABn。PCR方法从溶原菌BM25．8基因组DNA扩增出Cre基因,克隆测序验证无误后插入PBI 525 CaMV 35 S-35S双启动子和Nos终止子之间,再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点,得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre。     

人工雄性不育基因及恢复基因表达载体的构建

结合Cre/loxp定位重组系统和杂种一代的育种特点,构建了雄性不育基因表达载体pCABARTABn和相应的恢复基因表达载体pBINPLUSCre.将位于质粒pTIABn中的雄性不育基因表达盒(含TA 29启动子、barnase基因及Nos终止子)切下插入中间克隆载体pGloxp 2个同向lox位点之间,再将上述表达盒连同lox位点切下插入pCAMBar,获得以除草剂Basta为筛选剂的雄性不育基因表达载体pCABARTABn.PCR方法从溶原菌BM 25.8基因组DNA扩增出Cre基因,克隆测序验证无误后插入PBI 525 CaMV 35 S-35 S双启动子和Nos终止子之间,再将表达盒切下插入pBINPLUS质粒相应位点,得到恢复基因植物表达载体pBINPLUSCre.     

登革病毒E蛋白基因表达载体的构建

利用高效表达载体pET系统，构建广东地区登革流行株E蛋白基因的高效表达载体，表达载体经酶切及测序鉴定表明载体构建正确。为探讨E蛋白在登革病毒致病机制中的作用。以及针对本地登革病毒高效、特异的单克隆抗体和高效价的特异高免血清的制备奠定了基础。     

牛Nanog基因真核表达载体构建及有效干扰序列筛选

 【目的】构建牛Nanog基因的真核表达载体pVenus-Nanog,筛选对其有效的干扰序列。【方法】以含有牛Nanog基因的PMD-18T-Nanog重组质粒为模板,经PCR扩增目的片段,将其克隆到真核表达载体pVenus上,酶切及测序鉴定正确后命名为pVenus-Nanog。将pVenus-Nanog用脂质体瞬时转染牛皮肤成纤维细胞,用荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blotting分别检测Nanog的表达情况。针对牛Nanog基因的CDS区设计并合成3对干扰序列,分别命名为S1、S2、S3及阴性对照N.C.,用脂质体共转染pVenus-Nanog和siRNA于成纤维细胞,用半定量RT-PCR分析干扰效率。【结果】酶切分析与测序结果表明重组载体pVenus-Nanog构建成功,荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blotting结果显示其能够在牛成纤维细胞中高效表达。脂质体共转染pVenus-Nanog和siRNA后,半定量RT- PCR结果显示S1效果最好,干扰效率达75%,S2和S3分别为20%和70%。【结论】成功构建了牛Nanog真核表达载体pVenus-Nanog,且获高效表达。通过脂质体共转染法筛选出了牛Nanog基因的有效干扰序列,为研究该基因在胚胎干细胞及早期胚胎中维持多能性调控网络中的作用机制奠定了基础。     

小黑麦天冬酰胺合成酶基因表达载体构建及功能验证

[目的]对所克隆的小黑麦天冬酰胺合成酶基因(TriAS)的功能进行验证.[方法]构建TriAS-PZP植物表达载体,并通过沾花法侵染拟南芥.在盐胁迫条件下对转基因拟南芥种子萌发情况进行调查,并测定其幼苗中丙二醛含量和SOD酶活性.[结果]构建了TriAS-PZP植物表达载体,将TriAS基因已整合入拟南芥基因组中,并能够在拟南芥中稳定遗传.转TriAS基因拟南芥在盐胁迫条件下萌发率、幼苗根长增长速度均较野生型高,且丙二醛含量和SOD酶活性却均低于野生型.[结论]构建了所克隆基因TriAS的过量植物表达载体,证明所克隆的小黑麦天冬酰胺合成酶基因促进了拟南芥耐盐性能的提高,表明该基因具有增强植物耐盐性的功能.     

一个耐镉基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究MNB1基因在植物应对镉胁迫响应中的功能,构建拟南芥中MNB1基因过量表达载体,通过筛选鉴定最终获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥c DNA为模板,PCR扩增MNB1基因全长,将该基因连接到过量表达载体上;然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,浸花法转化野生型植株;最后利用转基因筛选与遗传鉴定获得MNB1转基因阳性植株。[结果]MNB1基因CDS全长1 368 bp,酶切连接后转化大肠杆菌鉴定得到阳性菌落,测序结果经比对完全正确。通过抗性筛选及PCR电泳检测获得阳性转基因植株。[结论]MNB1基因过表达载体构建成功并获得相应转基因植株,为进一步研究该基因调控植物镉胁迫响应中的功能及其分子机制奠定基础。