猪瘟病毒猪细小病毒猪伪狂犬病病毒 PCR检测方法的建立

猪瘟、猪细小病毒感染和猪伪狂犬病是3种最为常见的、引起猪繁殖障碍的传染性疾病，在世界范围内广泛流行，给养猪业带来严重的经济损失。在兽医临床上这3种疾病有时呈混合感染，且临床表现相似，给临床诊断造成很大困难。目前对这3种疾病的确诊方法都存在着繁琐、耗时、特异性差等缺点，因而有必要建立一种特异、快速、灵敏的诊断方法用于这些疾病的临床诊断和检测。     

鉴别猪伪狂犬病病毒的双重PCR方法的建立及初步应用

为了检测猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)的感染情况,并进行强弱毒株的鉴别诊断,本研究建立了快速、简便、灵敏度高、特异性强的鉴别猪PRV的双重PCR方法。针对PRVgE和gB基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对退火温度(50~60℃,按照1℃递增)、引物浓度(0.2~1.4μL,依次增加0.2μL)的优化,结果表明,双重PCR反应的最佳退火温度为56℃、最适引物添加量为1μL。特异性试验结果表明,该方法可以扩增出PRVgE(316bp)和gB(432bp)的目的片段,对PCV2、PTV、CSFV、PPV、PRRSV、大肠杆菌的DNA或cDNA均无扩增。敏感性试验结果表明,PRVgE和gB的最低核酸检出量分别为4.4×10³和3.3×10³拷贝/μL,与单一PCR方法的敏感性相近。应用该方法对广东、广西地区临床送检的56份组织样品进行检测,检测结果显示,强毒感染阳性率为53.6%(30/56),阴性率为46.4%(26/56),未发现有弱毒感染。     

猪伪狂犬病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

当前猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）仍是猪场常见的病原之一,给我国生猪养殖业造成了巨大的经济损失。为建立一种基于SYBR Green的PRV实时荧光定量PCR检测方法,以PRV-gE基因序列为靶标,构建pUCmT-gE重组质粒（并作为阳性质粒）,针对该基因设计特异性引物,并评估该方法的灵敏性、特异性和可重复性等指标。结果表明,该方法检测下限为4.545拷贝/μL,而普通PCR检测下限为4.545×102拷贝/μL;在90.0℃出现单一的溶解峰,并与PCV2（圆环病毒2型）、PPV（细小病毒）、PRRSV（蓝耳病病毒）、PEDV（流行性腹泻病毒）和TGEV（传染性胃肠炎病毒）等不产生交叉反应。此外,该方法对15份疑似感染伪狂犬病的临床样品检出率为20%(3/15),高于常规PCR检出率（13.33%,2/15）。因此,该方法较传统PCR具有更高灵敏性,更适合用于PRV的临床早期诊断。     

非洲猪瘟病毒与猪伪狂犬病病毒双重PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）的方法,本研究根据GenBank中的ASFV 72基因和PR V UL27基因的保守序列分别设计2对特异性引物,通过对双重PCR反应条件的优化,建立快速检测ASFV和PR V的双重PCR方法,并对该方法的特异性和敏感性进行验证。特异性试验结果显示,该方法对ASFV与PRV核酸的扩增能获得246 bp和401 bp的特异性目的片段,而对PRRSV、PEDV和CSFV的核酸扩增均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对ASFV和PRV核酸最低检测量分别为0.01 pg和0.12 pg。结果表明：建立的双重PCR方法具有特异性强、敏感性较好、快速简便等特点,可用于这两种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪伪狂犬病病毒及猪细小病毒二联PCR检测方法的建立

根据猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪细小病毒（PPV）2种病原体的基因保守序列，分别设计并合成了与PRv的gp50基因序列和PPV的VP2基因互补的两对引物，进行单相PCR，分别扩增出预期的217bp片段及158bp片段；同时，用这两对引物对混合的样品中的PRV和PPV的DNA模板进行二联PCP扩增及二联PCR反应条件的优化，结果得到2争与试验设计相符的217bp（PRV）和158bp（PPV）特异性务带：敏感性检测结果表明，对PRv的检测可以达到10^6.11／20μL TCID50对PPV的检测可以达到0．008HA单位的核酸模板。本文建立的PCR方法，可以在24h内对样品进行快速检测，可作为PRV、PPV感染和临床样品检测的可靠手段。     

猪伪狂犬病病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究针对猪伪狂犬病病毒的gE基因序列进行分析比较,设计了一条TaqMan-MGB探针,建立了区别野毒株及基因缺失疫苗株的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法检测猪伪狂犬病病毒特异性强,能很好的区分猪伪狂犬病病毒与其它病毒。用该方法对83份疑似样本进行检测,与常规PCR检测法符合率达到100%,表明该方法用于检测猪伪狂犬病病毒具有良好的实用性。     

猪伪狂犬病病毒野毒和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法的建立

为了能够同时检测和鉴别猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)。本研究参考GenBank中公布的PRV gE基因和PCV3基因组序列,且基于PRV gE和PCV3 Rep基因的保守区域,利用Primer 5.0引物设计软件设计了2对特异性引物,随后对其扩增条件进行优化,建立了能够同时检测PRV和PCV3的双重PCR检测方法。该方法可以同时扩增PRV的429 bp和PCV3的344 bp特异性片段,而对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。PRV和PCV3的最低检测值分别为502.0和91.2 copies/μL。结果表明该方法具有良好的特异性和灵敏性。本试验建立了能够同时快速检测PRV和PCV3,且具有高度特异性和灵敏性的双重PCR检测方法,为PRV和PCV3的检测提供技术支持。     

猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PRV gE基因和PCV-2 ORF2基因的核苷酸序列,分别设计了2对特异性引物PRV-S/PRV-A和PCV-2-S/PCV-2-A,产物分别为270 bp和189 bp。检测结果显示,该方法具有较高特异性,检测PRV和PCV-2的DNA最低量均为1×10~(-4)μg/μL。对136份临床上疑似为PRV和PCV-2感染病料样品进行检测的结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法可用于临床上PRV和PCV-2引起的单纯或混合感染的传染病病原学诊断。     

多重PCR快速检测猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank上猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的已知序列,利用Primer Premier 5.0及DNAstar软件对上述病毒基因保守区进行引物设计,选出扩增序列为PRV gB基因373 bp、PCV2 ORF2基因430 bp两对引物。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了PRV-PCV2两重PCR检测方法。敏感性及特异性试验结果显示,该mPCR对2种病毒的核酸检测可至1.47×10-6~1.62×10-6 ng,而对灭菌双蒸水、猪细小病毒（PPV）猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）多重PCR的扩增结果均为阴性,作为临床上猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型感染的病原学快速诊断方法具有可行性。     

检测猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的二重PCR方法的建立

作者建立了一种同时检测猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的二重PCR方法。根据GenBank上发表的PPV和PRV基因序列,针对各自保守区各设1对特异性引物,用这2对引物对同一样品中的PPV和PRV进行检测,结果同时扩增出942 bp(PPV)和485 bp(PRV)2条特异性片段。特异性试验表明,对其他几种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该二重PCR能检出PPV 和PRV最低浓度分别为22、11.7 pg/L。该方法的建立对临床上进行这2种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

应用PCR技术检测伪狂犬病病毒

根据伪狂犬病病毒(PRV)的gE基因序列,设计并合成了一对引物,以闽A株DNA为模板,建立了检测PRV的PCR方法。该方法能从猪细小病毒闽A株和FB株中扩增出一条长度为1 808 bp的片段,对Bartha株、gE-株检测为阴性;而以猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和正常细胞的核酸为模板的均为阴性;敏感性试验表明,该体系可检测到10pg的猪细小病毒基因组DNA。表明该方法适用于检测猪伪狂犬病病毒野毒株或非gE基因缺失弱毒株。     

鉴别猪伪狂犬病病毒强弱毒的高效纳米PCR 检测试剂盒及初步应用

试验建立了鉴别猪伪狂犬病病毒（PRV）强弱毒高效纳米PCR检测方法,并对相关条件进行优化,组装了试剂盒。根据PRV保守序列设计3对引物分别扩增PRV基因组的gB（431 bp）、gE（316 bp）和gG（202 bp）3个基因,用于区分PRV强毒与基因缺失毒株,优化反应条件后建立了纳米PCR检测PRV强弱毒的方法并组装试剂盒,对试剂盒进行了特异性、敏感性、批内批间可重复性及保存期评估试验,并对临床样品进行检测。特异性试验表明,此试剂盒对于PRV能够扩增出431（gB）、316（gE）和202 bp（gG）的目的片段,对于PRV-Bartha-K61能够扩增出431和202 bp的目的片段,对于猪捷申病毒、非洲猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒及大肠杆菌等DNA或cDNA均未扩增出条带。敏感性试验表明,此试剂盒的方法比常规PCR方法敏感100-1000倍,最低核酸拷贝数检出量可以达到101 copy/μL数量级。试剂盒的批内、批间检测结果无明显差异,稳定性良好。-20℃至少可保存12个月。在对中国黑龙江、吉林等7个省市的临床送检的117份样品进行检测,结果显示,PRV强毒阳性率为51%,阴性率为49%,未发现有弱毒感染。鉴别PRV强弱毒纳米PCR试剂盒的研制,对PRV感染的早期检测、野毒株和疫苗株的鉴别、疾病控制等都有重要意义,而且也可以用于其他动物PRV感染的检测和早期诊断。     

实时荧光定量PCR检测伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用

根据GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列(EF552427),利用Premier express设计并合成1对引物和相应的TaqMan探针,从猪伪狂犬病病毒(PRV)感染的细胞中提取DNA,进行PCR扩增.将鉴定正确的gE基因片段克隆入pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒.以该阳性重组质粒为荧光定量PCR标准品模板建立标准曲线.对探针浓度、引物浓度、镁离子浓度和退火温度进行优化,建立了最佳的荧光定量PCR反应体系和扩增程序.经临床应用表明,该荧光定量PCR方法的建立为猪伪狂犬病病毒的早期诊断并定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础.     

猪伪狂犬病PCR检测方法的建立与应用

根据Genbank中PRV gD基因序列设计引物建立了检测猪场狂犬病的PCR方法并对某省25份猪伪狂犬病疑似病料进行检测，结果在2S份病料中，检出伪狂犬阳性病料7份，阳性率接近30%。通过检测结果及特异性和敏感性实验发现此检测方法敏感度很高。这种检测方法适合科学研究、临床诊断以及流行病学调查。     

猪伪狂犬病病毒套式PCR检测方法的建立与应用

对伪狂犬病病毒(PRV)国标PCR方法进行优化,建立一种高灵敏度的套式PCR方法。根据伪狂犬病病毒gD基因序列,设计并合成了2对引物,通过反应体系和条件的优化建立套式PCR方法。通过灵敏性试验、特异性试验、病料检测对比试验等验证建立方法的适用性。结果表明,建立的方法检测伪狂犬病病毒DNA的极限为2.6×10-7 ng/mL,灵敏度比国家标准方法提高了1 000倍,从疑似PRV感染组织病料中能大幅度提高阳性检出率。本研究成功建立了一种灵敏度高、特异性好的快速检测猪伪狂犬病病毒的套式PCR检测方法。     

猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的建立与应用

参考GenBank中收录的猪伪狂犬病病毒gE基因序列,应用Primer5.0软件设计了一对引物,扩增目的片段为632 bp.进行PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性及符合性试验,建立了PRV的PCR检测方法.应用该方法对临床疑似发病样品进行了检测,PRV检出率为14.6%.表明该方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于PRV的临床发病诊断及流行病学监测等.     

Taq Man实时荧光定量PCR检测猪伪狂犬病病毒方法的建立与初步应用

根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守序列,设计合成引物和探针,优化反应条件,建立实时定量荧光PCR方法.实验结果表明,当50 pmol/L的引物O.3μL和5 pmol/L的探针0.5μL时,反应体系获得的CT值较小,而荧光强度增加值最大;制作的标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系;可检测到相当于20拷贝/μL的病毒DNA;与猪细小病毒、圆环病毒和猪瘟病毒等不发生交叉反应;敏感性比常规PCR电泳检测高约100倍.该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点.