实时荧光RT-PCR一步法检测番茄环斑病毒

 根据番茄环斑病毒(ToRSV)各株系RNA1聚合酶基因的保守序列,设计并合成1对引物和1条TaqMan荧光探针,建立了对ToRSV的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法利用TaqMan荧光探针实时监测目的基因的扩增,实现RT-PCR扩增与探针检测同时进行,不需PCR后处理,消除了PCR产物的污染,不需电泳和EB染色,减少了检测步骤,节省了时间。这个方法具有"灵敏、准确、简便、快速"的特点适合于种传病害的快速诊断和口岸检验检疫运用。     

烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的半巢式RT-PCR检测

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式RT-PCR方法对这两种病毒进行了检测,用Trizol快速提取病毒总RNA,并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋白基因设计特异性引物,经过第一轮RT- PCR和第二轮半巢式PCR扩增,TRSV样本分别得到359 bp和206 bp特异性片段,ToRSV样本分别得到340 bp和219 bp特异性片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,TRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在88%～97%的同源性,ToRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在96%～100%的同源性。研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,而半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这两种方法高出10~3倍以上。     

杂交诱捕实时荧光PCR检测番茄环斑病毒

 番茄环斑病毒(Tomato ringspot nepovirus,ToRSV)广泛分布于欧美及大洋洲,能侵染葡萄、桃、苹果、樱桃、番茄及烟草等150多种植物,引起多种病害,严重时导致绝产^[1]。     

抗稻瘿蚊品种多抗1的抗性遗传分析及抗性基因定位

稻瘿蚊是亚洲稻区主要害虫,采用抗虫品种进行防治是最理想的方法。1993～1995年,广东省农科院与国际水稻研究所有关专家紧密合作,对能抗华南4个稻瘿蚊生物型的品种多抗1作进一步抗性遗传分析,确认多抗1对中国稻瘿蚊生物型1和4的抗性受显性单基因控制,这个基因暂定名为GM—6(t)。以多抗1×丰银占1组合的F3代160个家系作基因标记,据DNA库分离个体分析(BSA)原理,用随机扩增多态性DNA(RAPD)标记物OPM6(1.4kb),首次成功地标记了这个抗性基因。随后多态性扩增产物经~(32)p标记,用作探针,检测另一个参考作图群体IR64×Azucena,将这个抗性基因定位在水稻第4条染色体上,位于RG214和RG163两个DNA限制性片段长度多态性(RFLP)标记之间。应用这些分子标记辅助选择有可能不必通过稻瘿蚊的直接筛选,快速准确地选育抗稻瘿蚊品种或进行抗性基因累加。     

北京怀桑地区李矮缩病毒的检测鉴定

在北京怀柔地区核果类果树病毒疫情调查中,对樱桃树上有矮缩、斑驳、皱缩等症状的叶片样品,通过酶联免疫检测为阳性反应,进行RT-PCR鉴定、外壳蛋白基因扩增片段测序,发现该序列与李属坏死环斑病毒(PDV)ch株系分离物(L28145.1)序列的同源性为100%,与分离物(AF208746.1,AF208747.1,AF208743.1)序列的同源性大干97%,说明被检测样品感染有PDV.这是PDV病毒在北京地区发生的首次报道,对该病毒来源及其流行趋势也进行了分析.     

非放射性核酸探针的特点及其应用

在动植物病害检疫中,为了准确而迅速地诊断出病原物,可以采用核酸探针进行分子杂交的方法来检测动植物病原物的特殊核酸序列,但是,探针的制备通常采用放射性元素标记,如~(32)P、~(35)S等,由于放射性元素本身对人的危害性、不稳定性及难以管理等特点,都限制了放射性探针的广泛应用,囚此,用非放射性物质标记制作探针的技术应运而生,这种非放射性物质可以是半抗原,也可以是蛋白质,但最常用的是生物素(Biotin),即维生素H。     

葡萄的两种检疫性病毒的多重RT-PCR检测

 本研究利用多重RT-PCR技术,对葡萄的检疫性病毒中番茄环斑病毒(ToRSV)和烟草环斑病毒(TRSV)进行检测,并研究了反应体系中各个参数对多重RT-PCR的影响。结果表明:可以在同一反应体系中实现对ToRSV和TRSV的RT-PCR检测,但模板浓度、引物浓度、循环数等3个因素对检测结果的准确性有较大的影响,3个参数的增加都会导致非特异性扩增的增多,而dNTP以及Taq酶的浓度对实验结果并无较大影响。     

十字花科蔬菜黑斑病菌的PCR鉴定

 在对十字花科蔬菜黑斑病菌(Alternaria sp.)3个种及相近种的5.8SrDNA和其侧翼ITS区进行测序的基础上,分别设计合成了鉴定白菜黑斑病菌3个种的特异性引物。PCR扩增结果表明:Abre1和Abre2引物对能特异性扩增芸苔链格孢(A.brassicae)371bp的片段,Abra1和Abra2引物对能特异性扩增甘蓝链格孢(A.brassicicola)457bp的片段,Ajap1和Ajap2引物对能特异性扩增萝卜链格孢(A.japonica)411bp的片段,而且其它近源种未扩增出目标片段,说明这3个引物对可以作为十字花科蔬菜黑斑病菌3个种快速检测鉴定的分子特征标记。     

黄瓜花叶病毒分离物核酸酶保护试验(RPA)方法的株系分化研究

 采用黄瓜花叶病毒((CMV)亚组Ⅰ株系Fny-CMV及亚组Ⅱ株系Ls-CMV的RNA₂的特定序列片段的cDNA克隆,体外转录,同时掺入³²P标记制备负链RNA探针,再与纯化的甜椒上的CMV中国分离物的RNA进行杂交,检测其与探针之间的同源性。共检测样品分离物3份。试验结果表明:河南新乡和北京密云的CMV甜椒分离物与Fny-CMV的核苷酸有高度同源性,隶属于Fny-CMV为代表的亚组Ⅰ株系。来自福建的样品与亚组Ⅱ的Ls-CMV株系有高度同源性,隶属于CMV亚组Ⅱ株系。本试验同时利用源于我国CMV亚组Ⅰ的K株系的RNA₂两个EcoR Ⅰ位点间1657-2125 nt的核苷酸序列为探针,同样与以上3份CMV中国分离物进行RNA杂交,进一步比较分析了这几个分离物与我国亚组Ⅰ的K-CMV株系的关系,证明了我国CMV存在亚组与株系分化。     

樱桃灰霉病菌LFD-RPA快速检测方法的建立

 灰霉病是樱桃的主要病害,由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染所致。该病菌可为害樱桃的花、叶、果实等多个部位,尤其在樱桃生长中后期及贮藏期发病率极高,危害严重。依据樱桃灰霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立了樱桃灰霉病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。结果表明,该方法检测条件为37℃扩增30 min,能特异性地检测灰葡萄孢,灵敏度为100 fg·μL^-1,略低于常规PCR(10 fg·μL^-1)和荧光定量PCR(7.43 fg·μL^-1);检测方法用时短,PRA扩增仅需30 min,LFD检测仅需10 min。本研究建立的快速检测方法可用于樱桃灰霉病菌的实时监测及病害的田间快速诊断。     

10种植物病毒的基因芯片检测技术研究

 本研究设计了10种植物病毒和各种对照的探针, 将探针固定在醛基化玻璃片基上制备基因芯片。用常规的Trizol法提取植物总RNA, 根据病毒的外壳蛋白基因或复制酶基因设计特异性引物, 经RT-PCR扩增相应区段并用Cy3-dCTP进行标记。将标记的PCR产物与芯片杂交, 扫描仪对杂交结果扫描, GenePix Pro 4.0软件对杂交图像进行分析。结果表明, 该芯片可以从病毒感染样本中检测到特异性识别信号, 检测灵敏度比RT-PCR高10~100倍, 所以, 基因芯片能对植物病毒作出快速、准确的检测。     

苹果小吉丁虫微卫星开发及其种群遗传结构分析

为研究苹果小吉丁虫Agrilus mali Matsumura的种群遗传结构,采用磁珠富集法以生物素标记探针(AC)_(12)和(AG)_(12)构建苹果小吉丁虫微卫星文库,根据阳性克隆测序获得的微卫星侧翼序列设计引物,筛选和开发苹果小吉丁虫多态性微卫星标记,并利用开发的微卫星标记对其不同地理种群的遗传结构进行分析。结果显示,从微卫星文库中的300个阳性克隆中筛选得到248个含有微卫星片段的克隆子,阳性克隆率为82.7%,其中完美型微卫星131个,占52.8%;不完美型90个,占36.3%;混合型27个,占10.9%,表明磁珠富集法开发新微卫星标记的效率较高。从获得的248个苹果小吉丁虫微卫星中筛选获得7个多态性微卫星位点,这7个位点在苹果小吉丁虫8个地理种群样本中的等位基因数为10~23个,有效等位基因数为1.674~12.218个,多态信息含量为0.304~0.796。8个苹果小吉丁虫种群的观测杂合度为0.095~0.676,期望杂合度为0.469~0.755,Shannon指数为0.791~1.621,遗传距离为0.071~0.788。采自新疆维吾尔自治区的7个苹果小吉丁虫种群之间遗传相似度较高,但其与辽宁省种群的遗传相似度较低。     

环渤海湾地区甜樱桃小果病毒及樱桃病毒A的鉴定与调查

为了解环渤海湾地区甜樱桃[Cerasusavium (Linn) Moench]中樱桃病毒的发生情况,选取该地区代表性樱桃示范园中甜樱桃品种‘红灯’为研究对象,以生长期功能叶片为材料,根据樱桃小果病毒-1(Little cherry virus-1,LChV-1)、樱桃小果病毒-2(Little cherry virus-2,IChv-2)和樱桃病毒A(Cherry virus A,CVA)基因组序列设计特异性检测引物进行RT-PCR扩增,结果扩增出与LChV-2、CVA预期片段337 bp和652 bp大小相符的目的片段,测序结果与基因组(基因登录号NC-005065、NC-003689)对应片段一致性分别为89.0％、98.2％,未检测到LChV-1.本研究完成了对环渤海湾地区甜樱桃‘红灯’样品LChV-2、CVA的检测调查,LChV-2检出率43.1％,CVA检出率60.8％;在该地区首次发现LChV-2、CVA复合侵染植株,复合检出率37.3％0.结果表明该地区CVA发生较为普遍,可与LChv-2等其他病毒共同加重对甜樱桃的危害.     

南方菜豆花叶病毒(SBMV)两典型株系特异cDNA和RNA探针的制备及应用

南方菜豆花叶病毒（ＳＢＭＶ）主要有２株系：菜豆株系（ＳＢＭＶ－Ｂ）和豇豆株系（ＳＢＭＶ－Ｃ）,血清学方法不能予以区分。根据已报道的核酸序列设计了２对特异引物,进行ＲＴ－ＰＣＲ扩增并克隆到载体Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中,序列测定予以证实后利用随机引物法合成放射性ｃＤＮＡ探针,再进行体外转译合成地高辛ＵＴＰ标记的ＲＮＡ探针。２种探针均可分别特异地检测Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ膜上的ＳＢＭＶ－Ｂ和ＳＢＭＶ－Ｃ。ＲＮＡ探针检测ＳＢＭＶ－Ｂ和ＳＢＭＶ－Ｃ灵敏度分别为：０．１μｇ和０．０１μｇ。     

中国小麦花叶病毒(CWMV)复制酶基因在病株体内的表达分析

中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是引起我国小麦花叶病的重要病原之一,其基因组由2条单链正义RNA片段(RNA1-2)组成。本研究根据发表的基因组序列设计特异性引物,扩增了CWMV复制酶基因的部分片段(nt102~1101),并克隆至原核表达载体pGEX-6P1,然后导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS中诱导表达。重组的复制酶蛋白经亲和层析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。Western-blot分析表明该抗体具有高度的特异性,能用于病株体内CWMV复制酶蛋白的检测。检测分析显示在病株体内,CWMV基因组RNA1可直接充当其复制酶基因的mRNA;在感染的细胞中,其复制酶组分主要是RNA1 ORF1编码的蛋白,分子量约153 kDa,且特异性地定位于膜结构上。     

兰花5种病毒可视化基因芯片检测方法建立

为建立运用可视基因芯片技术快速、准确检测兰花病毒的方法,选择黄瓜花叶病毒、齿舌兰环斑病毒、建兰花叶病毒编码外壳蛋白(coat protein,CP)基因、辣椒褪绿病毒编码核衣壳蛋白N基因、落葵皱纹花叶病毒编码CI蛋白基因为目标基因,设计引物和探针(5'标记一段poly T)。利用多重RT-PCR方法进行病毒核酸扩增,将扩增产物与固定于芯片的特异性探针杂交,经清洗、可视化显色后进行结果分析。在优化的检测条件下,本研究筛选出2组多重引物组合Cm(F2-R2a)、Ba(F1-R1);Or(F1-R1)、Cy(F2-R2)和Ca(F1-R1),5条特异性探针。所建立的可视基因芯片具有较好的特异性和重复性,可检测出病毒阳性质粒的量为不低于10~3拷贝·μL~(-1)。     

美国进境樱桃果实中梨火疫病菌的检测

为了筛选快速、灵敏的梨火疫病菌检测方法,利用常规PCR、套式PCR和实时荧光PCR方法分别对美国进境的326批樱桃果实中梨火疫病菌进行检测。结果显示,3种PCR方法的检出率不同,不同引物或探针的检出率也存在差异。在常规PCR中,引物Ams3/Ams4c、P29A/P29B和PEANT1/PEANT2的检出率分别为35.28%、24.85%和16.87%;单管套式PCR和套式PCR的检出率分别为23.01%和50.61%;4种实时荧光PCR的检出率分别为17.48%(探针PA)、32.21%(探针Ams)、29.14%(探针ITS)和23.93%(SYBR GreenⅠ)。在所有试验方法中由引物P29A/P29B和PEANT1/PEANT2组成的套式PCR的检出率最高。检测结果证实了进境樱桃果实中存在梨火疫病菌DNA,套式PCR和常规PCR(引物Ams3/4c)可用于进境樱桃样品中梨火疫病菌的常规检测。     

莴苣花叶病毒RT-RPA检测方法的建立

根据莴苣花叶病毒(Lettuce mosic virus,LMV)的外壳蛋白保守位点设计引物,并构建片段大小为428 bp的内标质粒,利用引物和内标质粒对可侵染莴苣的5种病毒和与LMV同属的3种病毒进行反转录重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)检测。结果表明,该方法特异性强,可从阳性样品RNA中扩增出大小为272 bp的目标片段,而其他7种病毒RNA、空白对照以及阴性对照均未扩增出条带;灵敏度高,能检测出稀释100倍的LMV RNA,与常规RT-PCR灵敏度一致;速度快,整个扩增过程只需要40 min,不需要特殊设备。本研究建立的RT-RPA检测方法可应用于LMV的快速检测。     

梨火疫菌的株系和近缘种

多年来 ,学者们一直认为 ,梨火疫菌(Erwiniaamylovora)在遗传上是高度保守的。从世界各地的梨火疫病流行区分离到的梨火疫菌十分相似 ,只有寄生专化性的微小差异。但近些年来 ,随着对梨火疫菌分子生物学研究的深入 ,导致了一些株系和近缘种的发现 ,改变了这一传统认识。按照寄生专化性可将梨火疫菌分为苹果株系、悬钩子株系和亚洲梨株系。按照对抗生素的敏感性可分为抗生素敏感株系和抗性株系。从地理分布和起源又可分为美国株系、韩国株系和日本株系。此外还有基于培养形状 (如菌落大小 )、噬菌体和血清学的株系划分[1] ,但并没有得到广泛…