PrP106-126对星形胶质细胞层黏连蛋白和纤黏连蛋白表达的影响

星形胶质细胞增生是朊病毒病早期的主要病理学特征.PrP106-126 (prion protein peptide 106-126)具神经毒性,导致星形胶质细胞增生.层黏连蛋白(laminin,LN)和纤黏连蛋白(fibronectin,FN)是星形胶质细胞胞外基质的主要成分.利用PrP106-126和PrP106-126制备的小胶质条件培养基(condi-tioned medium from microglia,MiCM)分别作用于体外培养的星形胶质细胞,应用RT-PCR和Westernblot技术探讨PrP106-126对星形胶质细胞的增殖及其胞内LN、FN表达的影响.试验分为5个处理(空白对照、Scr对照、PrP106-126、MiCM、MiCMPrP106-126).结果表明,PrP106-126可促进星形胶质细胞增殖、LN和FN的表达,但促增殖和FN表达作用有赖于活化小胶质细胞细胞因子的共同参与.     

PrP106-126毒性多肽影响小胶质细胞IL-1β、TNF-α的mRNA表达量变化的研究

体外合成的人PrP106-126毒性多肽具有PrP~(Sc)类似的特性,如富含β折叠,具有部分蛋白酶抗性,可以在脑组织内沉积形成淀粉样斑块等等.因此PrP106-126可作为替代PrP~(Sc)研究TSE发病机制的理想模型.PrP106-126对神经元的损伤作用可能主要通过两种途径:一方面它可与神经元表面的相关受体相结合通过信号转导途径直接对神经元造成损伤,另一方面它可激活小胶质细胞产生炎性介质或NO等毒性物质间接引起神经元凋亡.激活的小胶质细胞主要产生IL-1β、TNF-α两种炎性介质,这两种细胞因子的持续产生可致使神经元凋亡.本研究旨在对PrP106-126多肽作用小胶质细胞过程中,IL-1β、TNF-α的mRNA表达量随时间变化的规律,为阐明TSE发病过程中,小胶质细胞促进神经元凋亡的作用机制提供基础数据,并为一定程度上抑制小胶质细胞激活,减轻其对神经元的损伤作用奠定理论基础.     

REST缓解由PrP106-126毒性多肽诱导的原代神经元死亡

为检测神经元限制性沉默因子(REST)蛋白过表达或干扰对由PrP106-126毒性多肽引起的原代神经元死亡的影响,首先通过脂质体转染法将已经构建好的pCMV-HA-REST质粒转染原代神经元,或利用靶向REST的小干扰siRNA技术干扰原代神经元中REST蛋白的表达。用PrP106-126毒性多肽刺激构建好的REST过表达或干扰的原代神经元,利用Annexin V-FITC试剂盒检测细胞活性;利用TUNEL和Hoechest试剂盒,在激光共聚焦显微镜下直接观察细胞凋亡情况;在透射电镜下观察原代神经元亚细胞结构的变化和损伤情况;使用JC-1线粒体膜电位试剂盒检测线粒体膜电位的改变,同时检测凋亡相关蛋白FOXO1、细胞色素C以及Caspase-3的变化情况。结果显示,受到多肽刺激后,REST的过表达可减轻由毒性多肽引起的神经元死亡、神经元空泡化、细胞器损伤,抑制线粒体膜电位的改变,维持促存活蛋白FOXO1的表达,阻止线粒体向胞浆中释放细胞色素C以及Caspase-3的激活。相应地,干扰REST后,可加剧毒性多肽对神经元的损伤并抑制FOXO1的表达。这表明REST蛋白的过表达可缓解由PrP106-126毒性多肽引起的神经元死亡,对神经元起保护作用,为进一步阐释REST对朊病毒及相关神经退行性疾病引起的病理性损伤的治疗作用和神经保护机制提供依据。     

PrP106—126诱导小胶质细胞BV-2抗氧化性能的变化

小胶质细胞活化是朊病的病理学特征之一。朊蛋白多肽PrP106—126具神经毒性,是研究异常腕蛋白（PrPSc）的理想工具。为探讨PrP106—126对小胶质细胞氧化压力的影响。本研究以小胶质细胞BV-2为细胞模型,PrP106—126作用48h,应用MTT和流式细胞仪检测细胞的活化情况,应用分子探针技术对细胞的氧化压力（reactiveoxygenspecies,ROs）进行检测,并通过荧光定量RT—PCR对与R0s相关的酶的mRNA表达进行了测定。结果表明PrPl06—126显著促进小胶质细胞BV-2的活化,并提高胞内的ROS水平;定量RT—PCR显示,PrP106—126显著降低细胞S0D-1（P〈0．01）表达水平、提高胞内Cat（P〈0．01）的表达水平;对Grx、Trx-1、和Trx-2mRNA的表达水平有升高的趋势,但未达到显著水平（P〉0．05）,对SOd-2、GPx、GR无显著性影响（P〉0．05）。从分子水平初步阐明小胶质细胞ROS升高的机理。     

REST缓解由PrP106-126毒性多肽诱导的原代神经元突触和神经纤维的损伤

为了检测REST蛋白过表达或干扰对由PrP106-126毒性多肽引起的原代神经元纤维的影响,本试验通过免疫荧光技术和免疫印迹方法分别检测受PrP106-126刺激后的原代神经元中REST表达的变化情况。通过脂质体转染方法将已经构建好的pCMV-HA-REST质粒转染进入原代神经元,或利用靶向REST的小干扰siRNA技术干扰原代神经元中REST蛋白的表达。用PrP106-126毒性多肽刺激转染了REST过表达或干扰质粒的原代神经元,利用免疫印迹检测突触后蛋白PSD-95的变化情况;利用免疫荧光观察突触后蛋白和神经纤维的损伤情况。结果显示,受到多肽刺激后,REST从神经元的胞浆向胞核转移的同时表达量也逐渐增加,24h时达到顶峰,之后缓慢减少。生理情况下,过表达REST促进突触后蛋白PSD-95的表达;病理情况下,REST的过表达减轻由毒性多肽引起的突触损伤、神经纤维断裂。相应地,干扰REST后,加剧毒性多肽对神经纤维的损伤。结果表明,REST蛋白的过表达缓解PrP106-126毒性多肽对原代神经细胞造成的病理性损伤,为进一步阐释REST对朊病毒及相关神经退行性疾病引起的病理性损伤的治疗作用和神经保护机制提供了理论依据。     

多肽PrP106-126对小脑颗粒神经元凋亡相关基因表达的影响

试验旨在研究多肽PrP106-126对小脑颗粒神经元凋亡相关基因表达的影响。本研究利用多肽PrP106-126作用于小脑颗粒神经细胞,对该多肽影响小脑颗粒神经细胞凋亡基因的表达进行了检测。结果表明:bax、caspase-3和myc基因在PrP106-126多肽作用后表达显著增加,而bcl-2基因表达明显下降,进一步验证了bax、caspase-3和myc基因具有诱导凋亡作用,而bcl-2基因则具有抑制凋亡作用。     

朊蛋白多肽PrP 106-126对N2a细胞活性及PrP mRNA表达的影响

朊病(prion disease)是由正常细胞朊蛋白PrPC错误折叠成异常朊蛋白(朊病毒)引起的.朊病毒的神经致病性在病理学上表现为神经元空泡化、神经元丧失和胶质增生等.     

Fe~(3+)与PrP106-126共同诱导下N2a细胞的氧化应激状态

利用PrP106-126多肽的神经毒性,结合Fe3+对细胞氧化应激可能的诱导作用,建立N2a细胞的氧化应激模型,以研究氧化应激在Prion疾病过程中的作用,及其诱导神经细胞退行性损伤的机制。试验表明,通过毒性多肽PrP106-126与Fe3+共同作用,模拟神经细胞的氧化应激状态是可行的。效果较佳的攻毒浓度和攻毒时间分别是不高于50μmol/L的毒性PrP106-126多肽,不高于500μmol/L的Fe3+,最佳攻毒时间为12h。     

PrP106-126诱导的N2a细胞神经毒性中神经营养因子受体p75NTR的表达变化研究

神经元死亡是朊病毒病的主要病理学特征。朊蛋白多肽PrP106-126能够对神经细胞表现神经毒性,引起细胞凋亡。细胞表面蛋白神经营养因子受体p75^NTR的胞外区域可以与PrP106-126结合并产生促凋亡作用。作者以小鼠成神经瘤细胞N2a为细胞模型,应用荧光定量RT-PCR和Western Blot技术,以及DNA Ladder和AnnexinV-FITC/PI双重染色流式细胞凋亡检测技术对p75^NTR介导的PrP106-126神经毒性分子机制进行了研究。结果发现在PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡过程中,p75^NTR的mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著升高,以p75^NTR多克隆抗体sc-6189阻断PrP 106-126与p75^NTR的相互作用后,减弱了PrP106-126诱导的N2a细胞凋亡效果。该研究揭示了PrP106-126诱导的N2a细胞毒性中p75^NTR受体的表达变化,为解释朊病毒病的发病机制提供了重要数据。     

大鼠大脑皮质星形胶质细胞体外分离培养和纯化

星形胶质细胞是胶质细胞中数量最多、分布最片的细胞亚群，担负着胶质细胞的大部分功能，参与多种神经系统疾病病理过程。研究星形胶质细胞的反应对阐明动物多种神经系统疾病的病理发生和分子作用机制具有重要意义。但星形胶质细胞在体内与其他细胞混杂在一起，研究其病理性反应，必须对其进行分离和纯化，     

牛朊蛋白27-30基因的克隆与表达

利用PCR技术，从含有牛朊蛋白（Prion protein，PrP）基因Prnp的开放阅读框的克隆质粒BoPrnp—T中扩增出约420bp的目的基因（PrP猢基因）。将PrP^27-30基因和载体pPIC9K分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，T4DNA连接酶作用后，转化至E．coli JM109中，构建重组表达载体pPIC9K-boPrP^27-30。pPIC9K-boPrP^27-30经限制性核酸内切酶SalⅠ线性化后电转至毕赤酵母GS115中，经G418筛选后得到高拷贝的重组菌株GS115／pPIC9K-boPrP^27-30。GS115／pPIC9K-boPrP^27-30经1．0％甲醇诱导后，表达产物用SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明牛PrP^27-30基因在毕赤酵母细胞中获得表达，表达产物的分子量约为27Ku，能够被单克隆抗体SAF-70识别。     

金黄地鼠（Mesocricetus auratus）朊蛋白基因的克隆及其原核表达

采用RT-PCR技术从金黄地鼠(Mesocricetus auratus)脑组织获得朊蛋白基因(Prion protein nucleic acid,PRNP)开放阅读框(Open reading frame,ORF),截去其N端信号肽(66 bp)和C端GPI锚定位点(69 bp)形成朊蛋白编码区PRNPx;将编码区重组于融合表达质粒Pet-DsbA中,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中经IPTG诱导表达,并经Western-blot验证。结果表明,金黄地鼠PRNP基因ORF区全长为765 bp,编码254个氨基酸的前体蛋白,核苷酸序列与已发表金黄地鼠序列(M14054)同源性为99.87%,其第116个氨基酸发生了同义突变由GCT变为GCC;朊蛋白在大肠杆菌得到高效表达,产物是相对分子质量为47 000的融合蛋白。