甜菜M14品系BvM14-STPK基因的生物信息学分析及响应盐胁迫的表达分析

旨在进一步研究BvM14-STPK蛋白激酶对盐胁迫的应答反应,本研究以甜菜M14品系为材料,使用特异性引物通过聚合酶链式反应进行扩增,获得BvM14-STPK基因cDNA全长,并进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR探究该基因响应盐胁迫的表达分析。生物信息学分析结果表明,BvM14-STPK基因cDNA全长1668 bp,包含1527 bp的最大ORF,编码508个氨基酸;BvM14-STPK蛋白激酶具有典型的蛋白激酶保守结构域。实时荧光定量PCR结果表明,BvM14-STPK基因在甜菜M14品系叶、根中均有广泛表达,叶中的表达量高于根中。该基因在200、400 mmol/L NaCl处理下,在叶片和根中呈现不同的表达状态,表明该基因可以应答盐胁迫,但在不同组织中应答盐胁迫的表达量存在差异。本项研究在挖掘甜菜M14品系优质基因和提高栽培甜菜抗逆性等方面具有重要指导意义,为进一步开展甜菜遗传改良工作奠定基础。     

甜菜M14品系BvM14-Dof3.4基因的克隆及响应盐胁迫表达分析

为进一步研究BvM14-Dof3.4基因响应盐胁迫的功能,以甜菜M14品系根为材料,通过PCR技术获得BvM14-Dof3.4基因cDNA全长序列并进行生物信息学以及盐胁迫应答分析。结果表明：该基因最大ORF为408 bp,编码135个氨基酸,蛋白分子量为12646.63 Da,理论等电点为4.68,为亲水性蛋白;BvM14-Dof3.4蛋白质二级结构和三级结构主要由延伸链和无规卷曲组成;BvM14-Dof3.4蛋白氨基酸序列与NCBI数据库中甜菜(Beta vulgaris)的氨基酸序列相似度为99.26%;系统进化分析表明BvM14-Dof3.4蛋白与菠菜(Spinacia oleracea)Dof3.4蛋白亲缘性较高。结合实验室前期盐胁迫下甜菜M14品系根的转录组数据分析,BvM14-Dof3.4基因参与甜菜M14品系应答盐胁迫过程,在200 mmol/L NaCl处理下上调2.05倍,在400 mmol/L NaCl处理下上调1.41倍。实验成功获得BvM14-Dof3.4基因cDNA全长,并确定该基因响应盐胁迫,该结果对挖掘甜菜M14品系优质基因和提高栽培甜菜抗逆性等方面具有重要意义,为后续进一步开展BvM14-Dof3.4基因响应盐胁迫功能研究提供参考。     

甜菜M14品系BvM14-RIN4基因的克隆及应答盐胁迫分析

为了研究甜菜单体附加系M14品系RIN4基因耐盐功能,本研究以甜菜M14品系为实验材料,通过PCR技术获得BvM14-RIN4基因cDNA全长序列,对BvM14-RIN4基因进行了生物信息学分析、组织特异性和应答盐胁迫分析。BvM14-RIN4基因ORF长度为264 bp,编码87个氨基酸,蛋白分子量为 9.67 kDa,理论等电点为9.64,初步鉴定该蛋白为亲水性蛋白;BvM14-RIN4蛋白质二级结构主要由延伸链和无规卷曲组成;BvM14-RIN4蛋白质三级结构预测出该蛋白的保守结构域和疏水区;系统进化树分析结果表明BvM14-RIN4蛋白与菠菜SoRIN4和藜麦CqRIN4蛋白亲缘关系最近;荧光定量PCR结果显示,BvM14 -RIN4基因在根中表达量是叶的2.26倍,说明其具有组织特异性;该基因在200 mmol/L NaCl处理后的根中上调表达,说明它参与甜菜M14品系应答盐胁迫过程。本研究在挖掘甜菜M14品系优质基因和开展甜菜遗传改良工作等方面具有重要意义,为后续该基因的功能研究提供了重要参考。     

甜菜M14品系BvM14-STPK蛋白激酶在原核表达系统中低温诱导表达及纯化

为获得纯化的BvM14-STPK蛋白激酶，本研究采用低温16℃，0.5 mmol/L IPTG对转BvM14-STPK的大肠杆菌进行诱导，利用Ni2+亲和层析技术对菌液上清进行纯化，并利用SDS-PAGE对纯化蛋白进行检测。结果表明37℃，0.5 mmol/L IPTG诱导后，BvM14-STPK蛋白以包涵体形式存在，不能对目的蛋白进行纯化分析研究；通过优化诱导条件，确定在低温16℃，0.5 mmol/L IPTG过夜诱导，在上清中获得大量BvM14-STPK可溶性目的蛋白，对菌液上清纯化并经SDS-PAGE检测到BvM14-STPK目的蛋白。在目的蛋白纯化过程中，发现150 mmol/L咪唑洗脱液纯化BvM14-STPK目的蛋白效果最好。本研究成功纯化出目的蛋白BvM14-STPK。     

基于组学技术探究甜菜耐盐机理研究进展

为揭示甜菜盐胁迫下的分子响应机制,利用组学技术发现并鉴定关键基因及蛋白,迅速给予甜菜耐盐机理新的依据。本研究综述了转录组学、蛋白质组学、代谢组学、基因组学在甜菜耐盐机理中的研究进展。目前研究指出转录组学、蛋白质组学可筛选出甜菜耐盐关键候选基因,如BvM14-SAMS2、BvM14-glyoxalase I、BvNHX等,并利用基因组学对所发现基因进行验证。同时,探讨代谢组学在甜菜盐胁迫研究中的应用,以期通过代谢产物的定量与定性测量评估基因功能,为甜菜盐胁迫相关研究提供新信息与新思路。下一步应不断深化各组学技术间的融合,强化多学科交叉融合意识并积极创新,以发掘更多优质的甜菜耐盐遗传种质资源与基因资源。     

甜菜M14品系BvM14-STPK蛋白激酶在原核表达系统中的低温诱导表达及纯化

为获得纯化的BvM14-STPK蛋白激酶,采用低温16℃,0.5 mmol/L IPTG对转Bv M14-STPK的大肠杆菌进行诱导,利用Ni2+亲和层析技术对菌液上清进行纯化,并利用SDS-PAGE对纯化蛋白进行检测。结果表明37℃,0.5 mmol/L IPTG诱导后,BvM14-STPK蛋白以包涵体形式存在,不能对目的蛋白进行纯化分析研究;通过优化诱导条件,在低温16℃,0.5 mmol/L IPTG过夜诱导,在上清中获得大量BvM14-STPK可溶性目的蛋白,对菌液上清纯化并经SDS-PAGE检测到BvM14-STPK目的蛋白。在目的蛋白纯化过程中,发现150 mmol/L咪唑洗脱液纯化BvM14-STPK目的蛋白效果最好。本研究成功纯化出目的蛋白BvM14-STPK。     

马铃薯StWRKY15在转基因烟草的耐寒性分析

WRKY转录因子在植物的正常生长发育以及逆境生长过程中起着重要作用.本研究以4℃作为低温胁迫水平,对'青薯9号'马铃薯组培苗进行胁迫处理.通过RT-qPCR技术对马铃薯的5个WRKY转录因子基因进行表达分析,筛选出对低温响应的基因,构建表达载体遗传转化烟草,初步分析基因的功能.结果 显示,4℃低温胁迫下,马铃薯中的StWRKY15基因上调显著(P＜0.05);STRING预测分析StWRKY15编码蛋白的互作蛋白,主要包括StWRKY72编码蛋白、StGRAS6编码蛋白、c2结构域QUIRKY蛋白;通过双酶切方法成功获得重组质粒PRI101-StWRKY15;冻融法介导转化烟草,过表达StWRKY15基因显著提高了转基因烟草的耐寒性.4℃低温胁迫下,StWRKY15基因的过表达明显增加了脯氨酸、可溶性糖及总蛋白含量,降低了丙二醛含量;胁迫10d时,转基因烟草的长势优于野生型烟草.综上所述,可推断出StWRKY15对低温胁迫有响应,在逆境胁迫下可减轻植株受到的损伤,在一定范围内增强转基因烟草的耐寒性.本研究为进一步了解马铃薯WRKY转录因子的功能提供了理论依据.     

转录因子BvM14-GAI耐盐功能研究

转录因子在植物应答逆境胁迫过程中发挥着重要作用,GAI蛋白是植物转录因子家族的重要一员,对其研究主要集中在光响应机制领域,而该蛋白响应耐盐机制研究报道较少。实验室前期已经获得甜菜 M14品系盐胁迫转录组中上调表达基因BvM14-GAI的cDNA全长,本研究试图阐明该基因参与盐胁迫的功能。通过构建该基因植物表达载体,利用农杆菌介导花序浸染法转化拟南芥野生型和GAI基因突变株,检测150 mmol/L NaCl胁迫下异源表达和异源互补拟南芥植株的表型和生理生化指标。0 mmol/L NaCl处理时,以拟南芥野生型和GAI基因突变株为对照,异源表达和异源互补植株的根长、鲜重和干重均显著低于对照,说明BvM14-GAI基因为生长负调控因子;150 mmol/L NaCl胁迫处理后的根长、鲜重、干重及K⁺/Na⁺差异不显著,但甜菜碱、SOD和POD酶活性的含量显著增加,表明转录因子BvM14-GAI通过增强渗透调节和抗氧化酶系统提高异源表达和异源互补拟南芥植株的耐盐功能。研究结果不仅拓展了植物GAI基因响应非生物胁迫的功能,而且对阐明甜菜M14品系耐盐分子机制和培育耐盐作物品系具有一定研究价值。     

甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶提高植物抗逆性功能分析

为研究甜菜M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因(BvM14-CCoAOMT)的功能,本研究采用叶盘法将M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因转化烟草,获得T1代转基因植株,而后以野生型及转空载体植株为对照,分别在对照、100 mmol/L NaCl、200 mmol/L NaCl、100 mmol/L甘露醇及200 mmol/L甘露醇的培养条件下进行植株生理指标的抗逆性分析。研究发现在100 mmol/L NaCl、200 mmol/L NaCl盐胁迫条件下,转基因植株的鲜重、木质素含量以及叶绿素含量均显著高于对照植株。此外,研究结果表明转基因植株在100 mmol/L甘露醇胁迫条件下根长和叶绿素含量显著高于对照植株,如转基因植株的根长和叶绿素含量分别为0.68 cm和 0.31 mg,而野生型植株的根长和叶绿素含量分别为0.51 cm 和0.18 mg。研究结果表明转M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因烟草植株对盐和干旱胁迫具有较强抗性,这为进一步深入研究M14品系咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因功能奠定重要基础。     

甜菜ERF转录因子基因克隆及非生物胁迫响应分析

ERF(Ethylene-responsive element binding factors)是调控植物生长发育和响应胁迫的重要转录因子，在植物应对生物及非生物胁迫反应、调控胁迫相关功能基因的表达、提高植物的抗逆性中起着重要的作用。分析甜菜ERF转录因子基因在非生物胁迫下的表达规律，旨在为深入研究ERF转录因子在甜菜逆境胁迫应答中的作用机制提供理论依据。本研究以高糖型甜菜品系‘BS02’为试材，利用RT-PCR方法克隆得到Bv＿ammr基因，并对其进行生物信息学分析。该基因CDS区长906 bp，编码301个氨基酸。蛋白质分子量为33.19 kD，理论等电点为8.61，其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主，具有一个AP2保守结构域；氨基酸序列的同源性和进化树分析显示其编码蛋白与马兜铃菌毛所编码的蛋白亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR方法观测非生物胁迫下该基因表达模式，结果表明，Bv＿ammr基因对低温、高温、干旱、盐、ABA等非生物胁迫有不同程度响应。     

甜菜抗非生物胁迫研究进展

本研究主要从旱涝、盐碱、高低温以及土壤重金属污染4方面综述了非生物胁迫对甜菜生长发育、生理生化及分子水平的影响。研究发现甜菜在非生物胁迫下净光合速率下降,渗透调节物质浓度改变,活性氧代谢物质含量产生变化,生长发育受到影响;甜菜抗水分胁迫基因包括PSC5、PSCR、2-cysprx、NADK、cprx1、AVP1、Bv-txas等,MYB转录因子和NAC转录因子也在非生物胁迫中起重要作用;甜菜M14品系具有抗旱、耐盐等优良特性。WRKY家族转录因子、BvM14-Tpx、BvM14-CCoAOMT等基因、过氧化酶BvpAPX及各类盐应答蛋白质在抵抗盐胁迫中起促进作用;甜菜抗高低温研究较少,研究表明低温胁迫产生了甜菜抽薹基因的差异表达,甜菜SbSEC14基因在逆境条件下起到信号传导的功能;甜菜抗重金属胁迫研究进展近些年发展迅速,BvGS、BvMTP11、BvHIPP24、BvGST基因陆续被克隆。本研究提出今后应进一步加强甜菜抗非生物胁迫机制及应用的挖掘与创新;充分挖掘野生种中DREB基因,通过转基因技术培育抗逆性强的甜菜品种（系）;在单一逆境研究基础上,进一步开展多逆境条件下的抗逆研究;在生产上应用外源调控物、抗氧化剂、硅等抵御非生物胁迫对甜菜的生长发育影响。     

BvM14-GAI基因的克隆及亚细胞定位

GAI蛋白属于GRAS家族中的DELLA亚家族,参与植物发育、光合、抗逆等重要的植物生长过程。实验室前期在盐胁迫的转录组数据中发现甜菜M14品系GAI基因(BvM14-GAI)受盐胁迫上调表达,为了进行该基因生物学功能的研究,本研究以甜菜M14品系为材料,通过PCR技术获得BvM14-GAI基因cDNA全长序列,并进行生物信息学以及亚细胞定位分析。研究成功获得了BvM14-GAI基因cDNA序列;生物信息学分析显示,BvM14-GAI基因开放阅读框为1824 bp（包括终止密码子）,编码607个氨基酸,理论分子量为66 kDa,等电点为5.37;蛋白多重序列比对和系统进化树分析显示,BvM14-GAI蛋白与菠菜(Spinacia oleracea)和藜麦(Chenopodium quinoa)中GAI蛋白亲缘关系最近;亚细胞定位预测显示定位在细胞核。进一步将BvM14-GAI基因与pCAMIA2300-eYFP载体重组,构建亚细胞定位载体,利用冻融法转化农杆菌EHA105,进行烟草注射,结果显示BvM14-GAI蛋白定位在细胞核。本研究成功获得BvM14-GAI基因的cDNA全长,并确定该基因的烟草亚细胞定位在细胞核中,结果为后续该基因功能的研究提供了重要参考。     

盐胁迫下耐盐甜菜生理及其蛋白差异表达分析

为了探究甜菜在盐胁迫条件下生长及蛋白差异表达的变化,本研究以耐盐甜菜‘T510’为试验材料,采用室内营养液培养的方式,分析了0、140、280 mmol/L NaCl胁迫条件下甜菜生理和蛋白组变化。结果表明:随着盐分浓度的升高,甜菜的干物质、胁迫指数、叶绿素含量明显降低。相反,丙二醛和可溶性蛋白含量明显升高。利用双向电泳分别在对照组、低盐组(140 mmol/L NaCl)、高盐组(280 mmol/L NaCl)中检测到514、579、562个蛋白点。在低盐-对照、高盐-对照和低盐-高盐中分别有17、40、21个差异表达蛋白（变化倍数>2,P<0.05）。通过质谱分析最终分别鉴定出12、23、11个差异表达蛋白。这些差异蛋白主要参与光合作用和物质代谢。同时,发现磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶家族蛋白PEPC,Zn结合脱氢酶家族蛋白亚型1和ATP合酶的γ链在响应盐胁迫过程中表达量变化较大。因此,对于耐盐甜菜来说,盐胁迫主要影响与光合作用和物质代谢相关的蛋白表达,其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶家族蛋白PEPC、Zn结合脱氢酶家族蛋白亚型1和ATP合酶的γ链的作用明显。以上这些发现为甜菜及其他作物的耐盐育种提供有价值的理论依据。