家蚕丝心蛋白轻链基因的克隆及品种间的比较

从蚕品种浙蕾×春晓的蛹中提取基因组DNA ,用PCR的方法克隆出家蚕丝心蛋白轻链基因 3’端 ,包含第 2到第 7外显子区 5 5kb的DNA片段。经测序并与蚕品种J- 139丝心蛋白轻链基因相同区域的比较表明 ,蚕品种间丝心蛋白轻链DNA序列同源性为 95 6 % ,氨基酸序列同源性为 98 8%。     

感染非典型新城疫蛋鸡组织中HSP70抗原肽复合物提取与纯化

为建立从患有非典型新城疫的蛋鸡组织细胞中提取、纯化热休克蛋白HSP70抗原肽复合物的方法,采取三步蛋白纯化法从非典型新城疫蛋鸡肝脏组织中提取、纯化HSP70抗原肽复合物.经分级硫酸铵盐析后,依次用ConA-Sepharose亲和层析和DEAE-Sephacel离子交换层析分离纯化.所得蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting进行蛋白分子量及性质鉴定,Bradford法测定蛋白浓度.分离、纯化得到的蛋白经SDS-PAGE、银染鉴定为单一带,分子量为70ku;Western blotting结果证实为HSP70.每克新鲜肝脏细胞最终获得90～110 μg HSP70.使用本分离纯化方法可获得高纯度HSP70抗原肽复合物.     

猪囊尾蚴总RNA的提取与mRNA的分离

目的为比较对猪囊尾蚴总RNA提取与mRNA分离方法的优点。方法采用Promega公司的SV总RNA分离体系、RNAgents总RNA分离体系和hioDev—Tech的TRIZOL LS试剂,对猪囊尾蚴总RNA进行了提取;用Promega的PolyA Ttract mRNA分离体系和Amersharn的Quickprep微量mRNA纯化试剂盒对mRNA进行分离。结果表明经改良的TRIZOLLS试剂,提取猪囊尾蚴RNA效果好,而PolyA Ttract mRNA分离体系分离的mRNA含量高,纯度好。结论所分离的mRNA适合于构建cDNA表达文库。     

日本血吸虫含EF手性结构域分子序列的分析和初步鉴定

为分离鉴定日本血吸虫含EF手性结构域分子及分析其序列结构特征,首先找到含有EF—hand结构域的分子,按照序列一级结构进行分类,之后进行生物信息学分析。然后用PCR方法以虫卵和成虫cDNA文库为模板扩增分类后的分子,构建重组质粒,诱导蛋白表达并纯化,选取14个纯化蛋白用Western blot进行初步免疫原性鉴定。结果269个原始含EF-hand结构域分子按照序列一级结构分为70个;成功表达和纯化了49个含EF手性分子,进化树分析将其分为9类;Western blot显示,14个纯化蛋白均可被日本血吸虫感染小鼠阳性血清识别。本研究结果为下一步采用这类分子进行动物保护性效果评价以及保护性免疫机制的研究奠定了基础。     

家蚕病原性微孢子虫极丝蛋白的研究

从家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,简称N .b)和蓝萤叶甲微孢子虫 (MPa)中抽提了极丝蛋白 (PTP) ,进行SDS PAGE分析。并选择性分离、纯化了N .b孢子中主要极丝蛋白 ,经氨银染色法鉴定其纯度较纯。将N .b孢子中该主要极丝蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 ,用酶联免疫法 (ELISA)测定其效价 ,滴度为 1∶10 2 40 0。利用制得的抗体进行胶体金标记免疫电镜定位观察 ,发现所纯化蛋白确实存在于极丝上。     

三眠蚕诱导剂SM-1对家蚕丝蛋白合成调控机理的研究——Ⅰ.SM—1对~3H-甘氨酸参入丝蛋白速率和对后部丝腺等有关器官的细胞亚显微结构的影响

本文从3H-甘氨酸参入丝心蛋白的速率和某些有关器官的细胞亚显微结构的变化等方面.初步探讨了3眠蚕诱导剂SM—1对家蚕丝蛋白合成的调控机理.试验结果表明:(1)SM—1处理后.对丝腺体的成长有明显的促进作用.同日龄幼虫的后部丝腺干重,处理组较对照组高10倍左右,(2)SM—1处理后,3H-甘氨酸参入丝心蛋白的速率明显增快.最高参入速度比对照组提早3—4天,处理组的参入速度,最高峰时可较对照组高5倍左右;(3)与丝蛋白合成密切有关的一些细胞的亚显微结构发生明显变化.后部丝腺细胞中粗面内质网增加,核糖体和高尔基体明显增多,核的动态变化更为显著,脂肪体中贮存颗粒亦发生有规则的变化.     

丝蛋白的合成

家蚕丝腺细胞在幼虫期的一个短暂发育的时期合成大量的丝蛋白(silk proteins),丝心蛋白(fibroin)和丝胶蛋白(sericin),丝蛋白的主要成分丝心蛋白是专门在后部丝腺中合成的,而丝胶蛋白则在中部丝腺合成。两种蛋白质都具有独特的,容易鉴别的氨基酸成分。     

奶牛Y精子膜蛋白的提取与分析

奶牛Y精子膜蛋白的提取与鉴定为深入研究Y精子特异膜蛋白在受精过程中的作用，开发经济、安全、高效的奶牛性别控制方法具有重要意义。本研究采用超声波破碎法将精子膜与精子分离，分离后的精子膜粗品采用蔗糖密度梯度离心法进行纯化。纯化的精子膜经膜蛋白提取液（去污剂）提取，透析浓缩。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）银盐染色，成功地提取到膜蛋白。BIO—RAD凝胶成像分析仪分析得知Y精子膜蛋白至少有10种，分子量范围为7．94KD-166．65KD，其中尤以15KD的蛋白含量最多。     

家蚕彩色蚕中红色素和丝心蛋白相互作用的研究

为探讨茧色的形成机理,对红色蚕及其茧、丝腺进行解剖观察,然后测定丝心蛋白的氨基酸组成和含量,最后应用光谱法测定红色素和家蚕丝心蛋白之间的相互作用。结果显示:红色素在丝腺中全部着色,前部、中部、后部丝腺及吐丝管都完全着色,白蚕和红蚕丝心蛋白组分及含量的变化基本相同,丝心蛋白上的酪氨酸残基参与了猝灭过程,结合作用为氢键结合。     

富含蛋氨酸醇溶蛋白在产朊假丝酵母中的表达研究

为构建表达富含蛋氨酸醇溶蛋白的产朊假丝酵母工程菌株,利用基因工程技术,将玉米δ—10kD-醇溶蛋白基因（zein）,酵母的GAP启动子（GAP—P）、终止子（GAP—t）拼接合成表达框,以18S rDNA片段为整合介导区．用放线菌酮（CYH）抗性基因作为筛选标记,结合pBR322质粒构建了同源整合表达载体．把zein基因同源重组整合到产朊假丝酵母染色体上,构建表达zein基因的产朊假丝酵母工程菌株。蛋氨酸含量测定结果显示,重组菌株的蛋氨酸表达量比起始菌株提高了17．14％。该产朊假丝酵母工程菌的构建为下一步提高其蛋氨酸产量的研究和应用打下了良好的基础。     

鲤鱼IgM的分离纯化及其抗血清的制备

为了分离纯化鲤鱼血清免疫球蛋白M(IgM),并制备该蛋白的多克隆抗体,试验用rProtein A FF亲和层析和Superdex200 Increase 10/300GL分子筛的方法分离纯化鲤鱼血清免疫球蛋白M(IgM),并通过SDS-PAGE对纯化蛋白的部分特性进行分析;以纯化后的蛋白为抗原,免疫新西兰大耳白兔制备该蛋白的多抗血清,用ELISA法检测抗血清效价。结果表明:从鲤鱼血清中分离纯化出鲤鱼IgM蛋白,纯化后纯度可达99.53%;重链和轻链的分子质量分别为81.3 ku、26.4 ku;兔抗鲤鱼多抗效价高达1∶640 000以上。说明试验所采用的rProtein A FF亲和层析法可提取到高纯度的鲤鱼IgM,适合在实验室纯化鱼类IgM。     

酵母双杂交筛选猪Calsarcin-3基因相互作用蛋白的研究

旨在研究猪Calsarcin-3(CS3)基因及其互作蛋白对肌细胞钙离子的调控作用,了解快慢肌纤维分化和转化的分子机理.从猪的骨骼肌组织样中提取mRNA,合成并纯化双链cDNA;然后用长白猪的Calsarcin-3基因构建既无自激活活性又无毒性的pGBKT7-CS3诱饵载体;最后通过酵母双杂交系统的杂交方法筛选与Calsarein-3相互作用的蛋白,在GenBank中对相互作用基因进行比对分析,分析Calsarcin-3在骨骼肌中的功能.通过筛选,共筛选出5个与Calsarcin-3基因互作的蛋白,其中,重要的蛋白有帽蛋白Zβ(CAPZB)、肌联蛋白(TTN)和α-肌动蛋白1(ACTA1).结果提示,CAPZB可能与Calsarcin-3共同作用参与尖锐端肌动蛋白丝戴帽;ACTA1可能与Calsar-cin-3共同作用作为一种收缩蛋白在骨骼肌的活动中发挥重要作用;TTN能与Calsarcin-3结合参与维持Z线结构的稳定.     

抗脂肪细胞特异膜蛋白单链抗体基因的克隆及序列分析

从分泌抗40ku脂肪细胞特异膜蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取纯化mRNA，经RT—PCR扩增抗体轻、重链可变区基因，然后与Linker连接组装成单链抗体基因(scFv)。结果，成功地构建了scFv基因，其排列方式为VH—linker—VL。经序列分析表明，scFv基因全长741bp，VH基因全长369bp，VL基因全长327bp。抗脂肪细胞膜蛋白单链抗体基因的构建为进行该抗体基因的表达奠定了基础。     

白花蛇舌草多糖提取与纯化工艺研究进展

白花蛇舌草多糖具有抗肿瘤、抗菌等多种生物活性。目前,白花蛇舌草多糖的提取方法有超声波法、微波法、热水提取法等,此外,其纯化主要体现在脱蛋白、除色素等。笔者等就近年来国内的白花蛇舌草多糖提取与纯化的研究进展进行综述,并对其提取与纯化方法进行展望。     

蚕丝心蛋白的亚基及其分子量、氨基酸组成研究

试验以家蚕、野桑蚕、天蚕、柞蚕、樗蚕、蓖麻蚕为材料，测定了丝心蛋白及其亚基的分了量和氨基酸组成。结果表明，丝心蛋白亚基的组成家蚕、野桑蚕表现为Ｈ－Ｌ型，天蚕、柞蚕、樗蚕、蓖麻蚕为Ｈ－Ｈ型。家蚕蛾科的蚕类与天蚕蛾科的蚕类在丝心蛋白氨基酸组成上，具有种待异性，各种蚕类丝心蛋白氨基酸组成差异同它们的分类地位相一致。从家蚕和野桑蚕绢丝腺液状丝心蛋白中分离出小亚基，小亚基的氨基酸组成和大亚基有很大不同。     

桑枝多糖的提取与纯化的试验研究

通过正交设计,用一般提取法对桑枝皮中多糖提取条件进行优化,并分别结合微波法提取、超声波提取法和酶解提取法,比较提取效果。将粗提液进行纯化,并比较乙醇沉淀法和大孔吸附树脂的纯化效果。结果：一般提取法中最适的提取条件组合为提取时间100min、溶液—材料比20倍、pH5,同时结合生物酶提取法可将提取率提高18．57％;用AB-8型大孔吸附树脂纯化,可获得纯度84．57％的多糖。     

禽白血病/肉瘤病毒群特异性抗原p27的分离纯化及其抗体的制备

采用细胞培养法增殖禽白血病/肉瘤病毒(ALV/RSV)A亚型,然后对其进行超速离心浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化病毒,再采用电泳分离与电洗脱收集相结合的方法纯化p27蛋白.经检测,提取的p27蛋白具有良好的抗原性与免疫原性.用该蛋白免疫家兔制备的兔抗p27抗体,经ELISA方法检测其效价可达1:6400以上.     

小鼠朊蛋白相关蛋白Shadoo的表达、纯化及多克隆抗体的制备

构建SPRN重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备,提取BALB/c小鼠全血基因组,PCR扩增SPRN基因,克隆至融合表达载体,在大肠埃希菌中表达鼠Shadoo蛋白并纯化;以纯化蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,并检测抗体效价,用Western blot方法分别检测与重组及内源性Shadoo蛋白的反应性.结果表明,成功制备了小鼠Shadoo蛋白兔源多克隆抗体,为研究Shadoo蛋白与PrP蛋白之间的功能调节关系,自身的生理学作用以及Shadoo蛋白在传染性海绵状脑病发病机制过程中的生物学功能奠定了良好的基础.     

禽白血病／N瘤病毒群特异性抗原p27的分离纯化及其抗体的制备

采用细胞培养法增殖禽白血病／肉瘤病毒（ALV／RSV）A亚型，然后对其进行超速离心浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化病毒，再采用电泳分离与电洗脱收集相结合的方法纯化p27蛋白。经检测，提取的p27蛋白具有良好的抗原性与免疫原性。用该蛋白免疫家兔制备的兔抗p27抗体，经ELISA方法检测其效价可达1：6400以上。