暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpCDA5基因的细胞表达及活性分析

cDNA文库免疫筛选到编码暗黑鳃金龟幼虫几丁质脱乙酰酶HpCDA5基因,序列分析表明HpCDA5含有1个几丁质脱乙酰酶结构域,属于Group V类CDA蛋白。构建重组杆状病毒表达载体pFastBac-HpCDA5,转染昆虫细胞sf9,Western blot分析表明HpCDA5在昆虫细胞sf9中成功表达42 kDa的蛋白。利用qRT-PCR方法分析HpCDA5基因组织表达,结果显示HpCDA5基因在中肠中表达最高,为中肠特异表达蛋白。几丁质结合活性表明HpCDA5蛋白只能被强洗脱剂洗脱,具有很强的几丁质结合活性。本研究通过对暗黑鳃金龟几丁质脱乙酰酶HpCDA5的生化特性研究,为进一步明确HpCDA5的生理功能提供理论依据,并为以HpCDA5蛋白为靶标的暗黑鳃金龟生物防治提供支撑。     

昆虫病原真菌抗血淋巴免疫的机理

生物防治发展的一个重要阻力来自防治效果的不稳定,而影响防治效果的一个重要因素是寄主昆虫的免疫抵抗作用。因此,开发昆虫免疫抑制剂,研究昆虫病原真菌(虫生真菌)的抗血淋巴免疫机理,将有利于提高生物防治的效果,成为人们关注的焦点。本文从真菌分泌物对血细胞、囊泡膜型质子泵(V-H+-ATPase)、信号途径Imd等的影响及细胞壁成分的变化等方面,较详细地综述了近年来国内外对虫生真菌抗血淋巴免疫机理的研究进展,指出深入研究虫生真菌抗血淋巴免疫机理,对于明确虫生真菌的作用靶标,昆虫的免疫机制有重要意义,同时对新农药特别是免疫抑制剂的创制具有重要的理论指导和实践意义。     

几丁质酶抑制剂及噻唑烷酮类化合物合成与农用活性研究进展

几丁质酶 (EC 3.2.1.14) 可催化几丁质降解生成几丁寡糖,在几丁质代谢通路中发挥着重要作用,在昆虫、真菌和线虫等有害生物的生长发育过程中不可或缺。以几丁质酶为潜在靶标,有望开发出具有全新作用机制的新型农药品种。近年来,由于噻唑烷酮类化合物被报道具有包括几丁质酶抑制活性的多种农用生物活性,其合成方法受到广泛关注。本文以亚洲玉米螟几丁质酶 (OfCht) 为代表,对几丁质酶结构特点,典型糖类、肽类、虚拟筛选和天然产物源酶抑制剂,以及几丁质酶与抑制剂的结合方式进行了概要性综述,着重针对噻唑烷-4-酮、2-硫代噻唑烷-4-酮和噻唑-2,4-二酮3种噻唑烷酮类化合物的合成方法和农用生物活性研究进行了归纳总结,进而对噻唑烷酮类化合物在几丁质酶抑制活性方面的应用进行展望,以期为基于昆虫几丁质酶独特结构特点进行合理设计和发现新型噻唑烷酮类几丁质酶抑制剂用于未来农业害虫防治提供参考。     

昆虫Ⅱ家族几丁质酶的生理功能、结构特征及其抑制剂研究进展

昆虫几丁质酶可以降解昆虫体壁和围食膜中的几丁质,在昆虫蜕皮等生命活动中发挥重要功能。作为参与昆虫几丁质降解系统的关键酶,Ⅱ家族几丁质酶(ChtⅡ)是少见的多结构域、性质复杂的几丁质酶。对昆虫中编码ChtⅡ的基因沉默会导致昆虫蜕皮失败及死亡率增加。对ChtⅡ的生化性质及晶体结构分析表明,其在几丁质降解系统中起到了“先锋及攻坚”的作用。因此,ChtⅡ有望成为新的杀虫剂靶标。本文综述了近年来关于ChtⅡ的生理功能、结构特征及其抑制剂的研究成果,可为基于昆虫几丁质酶的新杀虫剂创制提供参考。     

甜菜夜蛾SeCDA8的基因克隆、蛋白表达及几丁质结合活性分析

几丁质脱乙酰酶（chitin deacetylase,CDA）能催化几丁质脱乙酰化产生壳聚糖,在几丁质降解过程中发挥着重要作用。本研究通过分析甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）转录组得到编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的全长CDS序列,命名为SeCDA8（GenBank登录号为OL689577）,其开放阅读框为1158 bp,编码385个氨基酸。NCBI Blast和系统进化分析表明其属于肠道特异CDA蛋白,与斜纹夜蛾CDA相似度最高。成功构建原核重组表达载体pET30a-SeCDA8,转化大肠杆菌,经超声破碎后在沉淀中表达45 kD的重组蛋白。重组SeCDA8蛋白的几丁质结合活性分析结果显示,SeCDA8蛋白与再生几丁质的结合活性较高于胶体几丁质,但均较弱。qRT-PCR分析显示,SeCDA8在前肠和中肠前部高表达,推测其可能与围食膜形成有关。通过探究甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶SeCDA8蛋白的几丁质结合活性和组织定位,为更加深入地探究第Ⅴ类CDA的生理功能提供了重要的理论依据。     

海藻糖酶结构及其抑制剂的农用活性研究进展

海藻糖是一种非还原性二糖,在昆虫、真菌等有害生物体内参与能量代谢、逆境恢复、几丁质合成等过程。海藻糖酶 (EC 3.2.1.28) 由于其对海藻糖代谢及其含量调控具有重要作用,且在农业有害生物和哺乳动物体内存在功能差异,已成为开发新型农用化学品的安全型候选靶标。本文对海藻糖酶的晶体结构、海藻糖酶与底物/抑制剂的互作机制研究进展进行了综述;同时对具有农用活性的海藻糖酶抑制剂,如井冈霉素、天然产物salbostatin和trehazolin及其合成类似物、脱氧野尻霉素及其合成类似物、天然生物碱及其合成类似物以及胡椒碱及其类似物的研究进展进行了概述,并重点论述了以胡椒碱为骨架的化合物在农业有害生物防治上的应用。本综述可为靶向海藻糖酶结构进行新型胡椒碱类结构的农用化学品设计与发现提供参考。     

苜蓿实夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因cDNA序列的克隆与序列分析

几丁质脱乙酰基酶(CDA)在昆虫几丁质代谢中具有重要作用.本研究以苜蓿实夜蛾5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到该虫CDA基因的cDNA序列.该序列含有1 984个碱基,包括1个1 626个碱基的开放阅读框,编码一个含541个氨基酸的蛋白,分子量约为61.86 ku.克隆基因推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的3个功能区,分别是几丁质结合区(47～103),催化区(199～355),低密度脂蛋白受体区(124～158).序列比对表明,克隆的苜蓿实夜蛾CDA与其他昆虫的CDA在核苷酸和氨基酸水平上的一致性存在较大差异.苜蓿实夜蛾CDA的氨基酸序列与棉铃虫CDA(GQ411189)一致性达到98%,而与另外3种昆虫粉纹夜蛾CDA(AY966402)、蓓带夜蛾CDA(EU660852)和棉铃虫CDA(GQ411190\GQ411191\EF600051)氨基酸序列间的一致性只有36%～38%,属于两类CDA类群中的一类.基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU1188855.     

苜蓿实夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因

几丁质脱乙酰基酶（CDA）在昆虫几丁质代谢中具有重要作用。本研究以苜蓿实夜蛾5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到该虫CDA基因的cDNA序列。该序列含有1 984个碱基,包括1个1 626个碱基的开放阅读框,编码一个含541个氨基酸的蛋白,分子量约为61.86 ku。克隆基因推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的3个功能区,分别是几丁质结合区（47～103）,催化区（199～355）,低密度脂蛋白受体区（124～158）。序列比对表明,克隆的苜蓿实夜蛾CDA与其他昆虫的CDA在核苷酸和氨基酸水平上的一致性存在较大差异。苜蓿实夜蛾CDA的氨基酸序列与棉铃虫CDA（GQ411189）一致性达到98%,而与另外3种昆虫粉纹夜蛾CDA（AY966402）、蓓带夜蛾CDA（EU660852）和棉铃虫CDA（GQ411190＼GQ411191＼EF600051）氨基酸序列间的一致性只有36%~38%,属于两类CDA类群中的一类。基因的cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU188855。     

乙酰乳酸合成酶及其抑制剂研究新进展

乙酰乳酸合成酶(AHAS)是支链氨基酸生物合成途径中的一个关键酶,是绿色除草剂的重要作用靶标。由于此生物合成过程只存在于植物和微生物体内,因此该类抑制剂对哺乳动物具有生物安全性。近年来,随着AHAS三维结构的阐明,人们不仅深入了解了已有抑制剂的作用机制,并且依此设计开发了一些新型的抑制剂,拓展了其在抑菌活性方面的生物学功能。文章对近年来AHAS及其抑制剂的最新研究进展进行了综述,重点就AHAS的酶学特征、结构特征及结合方式,以AHAS为靶标的新颖除草活性化合物的设计开发以及AHAS抑制剂的抗菌生物活性研究进展等问题详细进行了总结,以期为设计开发靶向AHAS的新型除草剂或抗菌药物提供参考。     

高毒力杀虫真菌基因工程菌株选育的进展与方向

病原真菌主要通过体壁侵染昆虫,在害虫防治中具有重要作用.利用昆虫病原真菌研制杀虫真菌农药的主要技术难点是选育高毒力杀虫真菌工程菌,本文综述了高毒力杀虫真菌工程菌构建技术的现状和菌株选育的进展,分析了其中存在的问题.根据昆虫病原真菌致病机制、害虫新靶标发现等方面的研究进展,提出了高毒力杀虫真菌工程菌选育技术的发展方向.     

家蚕几丁质脱乙酰基酶BmCDA7的纯化与生化性质

几丁质脱乙酰基酶是几丁质修饰关键酶,在昆虫几丁质组装过程中发挥重要作用,是潜在的绿色农药靶标。课题组近期研究发现家蚕中肠3个几丁质脱乙酰基酶中,BmCDA7对围食膜几丁质具有最高活性,在进食期高表达,可能参与该时期围食膜形成。本研究通过进一步优化分离纯化条件,建立了金属螯合层析和阴离子交换层析两步分离纯化方法,获得了高纯度的BmCDA7重组蛋白。采用SDS-PAGE结合Calcofluor White M2R显色定性确定了BmCDA7对底物乙二醇几丁质的催化活性。通过测定催化反应过程中释放的乙酸量,确定了BmCDA7的最适反应条件、稳定性及底物选择性。BmCDA7催化反应最适温度为60℃,最适pH为8.0,在温度低于60℃以及中性、偏碱性条件下较为稳定。此外,BmCDA7对乙二醇几丁质、胶体几丁质的酶活力分别为2.9926和0.4270 μmol/（min·μmol）,而对高结晶度的α-几丁质和β-几丁质无活力。这些结果丰富了昆虫几丁质脱乙酰基酶的生物化学基础研究。     

昆虫几丁质酶及其应用研究综述

几丁质作为自然界的一种含氮多糖类生物性高分子,是昆虫表皮、中肠围食膜和气管系统的主要结构成分,保护昆虫免受化学侵蚀、物理损伤和病原入侵。昆虫几丁质酶可以降解昆虫体壁和围食膜中的几丁质,近年来受到了越来越多的关注。通过对昆虫几丁质酶的调控,可直接影响其生长发育,实现对害虫的有效防治。本文综述了昆虫几丁质酶结构、体内表达特性、生理功能和影响因素,及其在害虫防治中的应用与存在的不足,旨在为昆虫几丁质酶在植物保护领域更深入的开发应用提供科学依据。     

木霉几丁质酶及其基因的研究进展

现已报道8种木霉的39个几丁质酶基因,其中22个为42kD内切酶基因.这些42kD内切酶基因的核苷酸序列及其编码的前体蛋白的氨基酸序列极为相似.42kD几丁质酶基因开放阅读框一般有3个内含子,前体蛋白一般有约22AA的信号序列,引导输出.成熟蛋白具有催化域、磷酸化域和耱基化域.基因的表达是诱导型的,受几丁质及真菌几丁质细胞壁的强诱导,受代谢物阻遏.转入植物的木霉几丁质酶基因可正确表达.本文就木霉生防菌株几丁质酶及其基因克隆、几丁质酶基因结构和功能、几丁质酶基因的表达和调控,以及木霉几亍质酶的生防应用前景等几方面进行了综述.     

植物几丁质酶在抗真菌病害基因工程中的应用

植物几丁质酶因能水解真菌细胞壁的主要成分几丁质 ,在抗植物真菌病害反应中发挥了重要的作用。本文对植物几丁质酶的特性、分类、基因的诱导表达及其基因在抗真菌病害基因工程中的应用等进行了阐述 ,指出植物几丁质酶在抗真菌病害基因工程中的巨大应用前景     

几丁质、壳聚糖在植物保护中的研究与应用进展

几丁质（ｃｈｉｔｉｎ）,又称甲壳素,广泛分布于于虾蟹壳、软体动物的外壳与内骨骼,节肢动物的外骨骼及真菌、酵母菌等微生物细胞壁中。与植物的纤维素一样,具有保护及支持生物体的作用。壳聚糖（ｃｈｉｔｏｓａｎ）,又称几丁聚糖,是几丁质经脱乙酰作用而得到的一种...     

新型2,4-二苯基-1,3-噁唑啉类杀螨剂的研究进展

乙螨唑是日本八州化学工业株式会社于20世纪80年代中期发现并于1998年商品化的惟一的2,4-二苯基-1,3-唑啉类新型杀螨剂,其通过抑制在哺乳动物和高级植物中没有而只存在于昆虫表皮和真菌细胞壁的几丁质的合成,可高选择性地防治害虫和害螨,具有高效、低毒和对非靶标生物安全的特性,符合当今绿色杀虫剂的要求和目标。本文概述了该类杀螨剂的先导发现、结构修饰及构效关系以及作用机制的研究进展,旨在为设计新颖、高效、低毒、绿色的2,4-二苯基-1,3-唑啉类杀虫、杀螨活性分子提供参考。     

亚洲玉米螟几丁质酶的双靶向天然产物抑制剂及其抑制机理

多个几丁质酶可协同催化昆虫表皮几丁质的水解,在昆虫蜕皮发育过程中发挥不可或缺的作用,是潜在的绿色杀虫剂作用分子靶标。本文通过对1680种天然产物进行高通量筛选,获得了3个靶向亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis来源的几丁质酶OfChtI和OfChi-h的双靶标抑制剂:漆树酸、邻苯二甲酸二 (2-乙基己基) 酯 (DEHP) 和紫菀酮。它们对OfChtI的抑制常数 (K_i) 分别为0.57、0.53 和3.95 μmol/L;对OfChi-h的抑制常数分别为0.48、1.42 和27.33 μmol/L。分子对接结果表明,三者均通过疏水堆积作用结合在靶标酶的底物结合位点上。此外,漆树酸的1位羧基氧原子作为氢键受体,与OfChtI的Arg274和OfChi-h的Arg439侧链胍基氢原子形成氢键。DEHP的羰基和烷氧基氧原子作为氢键受体,与OfChtI的Arg274侧链胍基氢原子形成氢键;DEHP的烷氧基氧原子作为氢键受体,与OfChi-h的Arg439侧链胍基氢原子形成氢键。杀虫活性测定结果表明,在2 mmol/L浓度下,漆树酸和DEHP对亚洲玉米螟幼虫的致死率为33.3%,紫菀酮没有表现出明显的杀虫活性。该研究对于同时靶向多个几丁质酶的新型绿色农药的创制具有参考意义。     

枯草芽孢杆菌XF-1中脱乙酰几丁质酶在大肠杆菌中的表达及其抑茵活性

根据脱乙酰几丁质酶同源基因序列设计引物,扩增、克隆和测序了枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis菌株XF-1的脱乙酰几丁质酶基因（CSrlo该基因编码区为834bp,编码由277个氨基酸组成的约30kD的蛋白质,其基因序列与枯草芽孢杆菌菌株B168的脱乙酰几丁质酶基因的相似性达到99％,氨基酸序列相似性为98％,在第19、47、60、256和257位的氨基酸发生了变化,分别由异亮氨酸代替了菌株B168脱乙酰几丁质酶中的甲硫氨酸、缬氨酸代替了谷氨酸、苏氨酸代替了异亮氨酸、天冬氨酸代替了谷氨酸、赖氨酸代替了天冬酰胺。菌株xF一1对稻瘟病菌Magnaportheoryzae和芸薹根肿菌Plasmodiophorabrassicae有抑制作用,而菌株B168没有。菌株xF－1和B168的CSFI基因在大肠杆菌Escherichiacoli中的表达产物均具有脱乙酰几丁质酶活性,但前者的表达产物对稻瘟病菌及芸薹根肿菌具有抑制作用,而后者没有。表明脱乙酰几丁质酶是xF－1抑制根肿病作用机制之一,且上述5个氨基酸替代可能与抑菌机制有关。     

高效产几丁质酶微生物的分离和筛选

正几丁质酶是具有生物催化活性、能水解几丁质的一类水解酶,许多微生物可通过胞外诱导产生该酶。几丁质广泛存在于植物病原菌、线虫卵和昆虫的细胞壁中,防治植物土传病害时,在土壤中加入几丁质可以刺激土壤微生物胞外分泌几丁质酶,从而抑制病虫害发生(郑秀丽等,2006;孙建波等,2010)。     

复合物Ⅱ抑制剂的作用机制和研究进展

复合物II是线粒体电子传递链上重要功能复合物,已经成为农用杀菌剂方面的关键靶标。该类杀菌剂在植物病原真菌保护中发挥着重要的作用。本文在综述复合物II结构和泛醌结合位点作用机制的基础上,总结了复合物II抑制剂的类型和结构特征,介绍了最新的研究进展,旨在为开发新的复合物II抑制剂提供思路。