基于油脂合成期油桐种仁转录组数据的α－亚麻酸代谢途径解析

【目的】油桐种仁中产出的桐油经济利用价值极高。桐油中α－桐酸的含量高达70%,然而植物体内α－桐酸代谢通路的研究还未见报道,这对直接筛选油桐α－桐酸代谢通路相关酶基因造成一定的困难。α－亚麻酸作为α－桐酸的同分异构体,其代谢通路的研究则较为深入,能为α－桐酸代谢通路的解析提供参考。因此,本研究期望在油桐种仁转录组数据的基础上,解析油桐的α－亚麻酸代谢途径,为油桐α－桐酸代谢机理的阐明提供理论参考。此外,通过调控这些基因的表达模式以及开发与之紧密连锁的分子标记,可大大加快油桐遗传改良和分子育种的进程。【方法】采用 RNA-Seq技术对油桐种仁3个不同油脂合成期的转录组进行比较,获得大量差异表达的Unigene,并将这些Unigene归类于128个代谢途径。在此基础上,通过GO分类和Pathway富集性分析,解析油桐α－亚麻酸代谢通路并分析通路中相关酶基因在油脂合成期的表达变化规律。【结果】通过对Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ期的油桐种仁RNA测序,共获得长度为200～3000个核苷酸的非冗余Unigene序列58439条,其中能够比对到公共数据库中已知基因序列的 Unigene共有41059条,占所有非冗余基因的70.3%。不同长度的非冗余 Unigene序列与数据库中序列匹配的效率不同,越长的序列匹配效率越高。序列长度大于2000 bp的序列匹配效率达到98.28%,而500～1000 bp和100～500 bp的序列分别只有78.86%和48.99%的匹配效率。3个种仁油脂合成期的转录组数据中共有105个 Unigene可被富集于α－亚麻酸代谢途径,占所有非冗余 Unigene的0.47%。从3个转录组数据的两两比较中鉴别出一些差异表达Unigene,其中也有一些可被富集于α－亚麻酸代谢途径。通过在KEGG数据库中进行检索后发现,105个 Unigene序列分别对应于14个α－亚麻酸代谢途径关键酶基因,这些基因在其他物种中都有同源基因与之对应。通过基因表达模式分析发现,整体上与合成代谢相关的基因在油脂合成期呈现上调的表达模式,而与分解代谢相关的基因则呈现下调的表达模式。【结论】在油桐种仁转录组数据的基础上,解析油桐α－亚麻酸代谢途径,获得与α－亚麻酸代谢相关的重要酶基因并分析它们在油脂合成期的表达模式,这对后续研究具有重要的启示作用。     

橡胶树胶乳高表达的法尼基焦磷酸合成酶的功能

【目的】天然橡胶生物合成途径是典型的植物类异戊二烯代谢途径,MVA代谢途径是天然橡胶与萜类化合物所需的五碳构成单元IPP和DMAPP生物合成的主要途径之一。由2分子IPP和1分子DMAPP聚合形成的法尼基焦磷酸是乳管细胞天然橡胶生物合成的起始前体,厘清该起始物的合成酶酶学性质不仅有助于阐明天然橡胶生物合成机制,同时也为天然橡胶遗传改良提供酶学理论基础。【方法】对橡胶树热研7-33-97基因组中同源的3个预测的法尼基焦磷酸合成酶(HbFPS1、HbFPS2、 HbFPS3)进行序列特征分析,优选胶乳中高表达的2个法尼基焦磷酸合成酶基因构建原核表达载体,经蛋白纯化与MALDI TOF质谱确证,并同时进行体外酶活性检测,最终评价其对体外橡胶合成效率的影响。【结果】橡胶树基因组含有的3个预测的法尼基焦磷酸合成酶都含有特征性的2个保守结构域“DDIMD”和“DDYXD”及相似的三维空间结构,其中胶乳高表达的HbFPS1和HbFPS2基因编码的蛋白氨基酸序列相似性达到95%,说明HbFPS1和HbFPS2 2个冗余基因可能经历了基因组中同源基因的后期拷贝事件。同时HbFPS1和HbFPS2基因能够...     

油桐delta 8脱饱和酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

桐油是制备生物柴油的优势原料。delta 8脱饱和酶基因与植物膜脂、鞘磷脂的生物合成及细胞信号传递途径有关。通过简并PCR扩增、3’RACE、5’RACE及编码区扩增获得了油桐delta 8脱饱和酶的全长c DNA序列。该基因全长1 787 bp,ORF的长度为1 344 bp,编码447个氨基酸。经过网上比对分析,发现油桐delta 8脱饱和酶与其它植物的此基因具有较高同源性,其中与蓖麻脂肪酸去饱和酶相似度达83%。研究结果为揭示油桐油脂合成途径及分子定向育种奠定基础。     

油茶FAD2基因全长cDNA的克隆和序列分析

FAD2基因控制油酸转化为亚油酸,是油茶油脂合成代谢的关键酶基因.在构建的油茶.EST文库基础上,采用5'RACE和交错延伸PCR技术获得了油茶FAD2基因的全长cDNA克隆.该基因序列长1 682 bp,开放阅读框为1 149 bp,编码382个氨基酸,并且具有FAD2特有的保守序列和相关特征.经过比对分析,发现油茶的FAD2基因与其他植物的FAD2基因具有较高的相似性.     

植物脂肪酸及其相关代谢酶的研究进展

指出了植物脂肪酸的重要功能、种类及代谢的基本途径,以及与其代谢所涉及到的关键酶的研究进展.探讨了植物脂肪酸其生物复杂的合成途径.涉及乙酰辅酶A、脂肪酸合成酶、脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶等多种酶.     

基于RNA-Seq的油茶种子α-亚麻酸代谢途径及相关基因分析

以油茶果实膨大期和油脂合成高峰期的种子为材料,进行转录组测序和表达谱数据库构建,并对油茶种子α-亚麻酸代谢途径相关基因进行分析。转录组测序获得油茶种子α-亚麻酸代谢非冗余基因 Unigenes序列共112条,与α-亚麻酸代谢密切相关的不饱和脂肪酸合成途径非冗余基因 Unigenes 序列94条,包含12种调控α-亚麻酸代谢主要酶基因。表达谱数据分析显示,果实膨大期和油脂合成高峰期的α-亚麻酸合成代谢途径相关基因具有不同的表达模式,参与油茶种子α-亚麻酸的合成及形成多种不饱和脂肪酸的物质转化。采用实时荧光定量 PCR方法验证油茶种子 LOX,AOS,ACOX,AOC,OPR,AACT,PLA2,HPL,DOX,MFP,FAD2,FAD3等关键基因在油茶种子油脂合成不同时期的相对表达量,结果表明各基因表达规律与表达谱数据分析结果一致。克隆、调控这些相关基因将会为提高α-亚麻酸含量的油茶育种提供依据。     

七彩红竹IhCCR-1基因的克隆与分析

肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是苯丙烷类代谢途径中的关键酶,在七彩红竹木质素和花青素合成代谢流向中起重要作用。依据七彩红竹转录组数据设计特异引物,采用反转录PCR技术从七彩红竹中克隆得到一个新的CCR基因的全长cDNA序列,命名为IhCCR-1(登录号:KP271440)。结果表明,该基因全长cDNA为1 038 bp,编码345个氨基酸的蛋白质,属于酸性稳定蛋白,不存在信号肽,为非分泌蛋白;IhCCR-1蛋白具有保守的KNWYCYGK催化位点,属于NADB-Rossmann超家族,相对分子量为37.61 kDa;Ih CCR-1与其他植物的CCR具有较高的亲缘关系。研究结果将为进一步研究七彩红竹木质素产生的分子机理和综合开发利用奠定基础。     

金银花采收期的试验研究

通过对秦岭山区金银花不同季节采收时期试验分析,研究结果表明,金银花以采收二白期和大白期花蕾入药质量最佳;叶以花期即初生花蕾时至花末期采摘,叶中的绿原酸含量最高,为最佳采叶期;藤中绿原酸含量嫩枝高于老枝,建议修剪时,应修剪枝条上部为最好;同株金银花植物中,药效成分绿原酸含量为：花蕾〉叶〉嫩叶〉老枝。这些为金银花最佳采收期提供了科学的依据。     

尾叶桉GLU4肉桂酰-辅酶A还原酶基因克隆及原核表达

肉桂酰-辅酶A还原酶(Cinnamoyl Co-A Reductase,CCR)是木质素合成中的关键酶,根据植物中CCR保守序列设计引物,以尾叶桉GLU4嫩茎为材料克隆到其CCR基因,命名为Eu CCR。该基因g DNA长2 918bp,c DNA长1 045 bp,CDS区编码336个氨基酸。EuCCR核酸序列与Gen Bank已登录的桉属植物CCR基因同源性达到96%以上,与伞房属、杯果木属植物CCR的同源性达85%以上,其编码的氨基酸序列经比对发现具有完整FR_SDR_e结构域及NADP结合位点和底物结合位点,与可可树等植物中CCR基因编码序列同源性也在84%以上,确定为CCR基因。对EuCCR蛋白序列理化性质及结构进行生物信息学分析,利用MEGA软件对基因序列进行系统进化树分析。采用pQE30/M15系统对EuCCR进行原核表达,重组质粒成功表达分子量约36 kD的目的蛋白。本研究从尾叶桉GLU4中克隆得到EuCCR基因并原核表达,为该基因的酶学分析以及利用该基因转化调控尾叶桉木质素合成奠定基础。     

马尾松苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase,PAL)是苯丙烷类代谢的关键酶,催化苯丙氨酸转化为肉桂酸,促进黄酮、木质素等次生代谢产物的合成。根据其他植物PAL基因的DNA保守序列设计的简并引物,经过PCR扩增,得到1条864 bp的特异性片段,编码288个氨基酸。通过分析其序列和编码的氨基酸序列,发现其与其他物种的PAL基因高度同源,证实为马尾松PAL基因的核心序列。所得序列已经登陆在NCBI的Genbank中,序列号为GQ142010。     

金银花中绿原酸的提取及纯化方法比较

主要介绍了近10年来金银花中绿原酸的提取及纯化工艺,重点对各种方法进行了分析、论述和比较,并且结合实际生产应用的可行性,提出了合理的操作工艺:先用水提法提取出金银花中的有效成分,再用大孔树脂法对提出物进行纯化,最终可得到提取率及纯度都较高的绿原酸。     

针叶树萜类合成酶研究进展

萜类化合物是植物一类重要的次生代谢物,在寄主识别和信息通讯及3层营养关系等生态关系上具有重要功能。萜类合成酶是萜烯生物合成途径中的重要调控酶之一,特别是在萜烯化合物多样性的调控上具有重要作用。在针叶树中,萜类合成酶的深入研究有助于更好地利用萜类化合物以进行病虫害的防御。综述近年来针叶树中萜烯合成酶的理化性质、基因和氨基酸序列特征以及调控等方面的研究成果,为我国开展这方面的研究工作提供有益的参考。     

油茶丙酮酸激酶基因全长cDNA克隆及序列分析

丙酮酸激酶是糖酵解途径的关键酶,在油料作物脂肪酸合成中有重要作用。在实验室构建的油茶EST文库基础上,采用5′RACE和交错延伸PCR技术获得了油茶PK基因的全长cDNA克隆。该基因序列长2 114 bp,开放读码框为1 737 bp,编码579个氨基酸,蛋白分子量为63 766.5 Da,分子式为C2774H4470N784O875S30,与其他植物的PK基因具有较高的相似性。PK基因系统进化树表明,油茶与蓖麻、杨树、葡萄的亲缘关系最近。     

茶树2个MYB转录因子基因的克隆及表达分析

MYB类转录因子是一类包含一段保守的DNA结合结构域的基因家族,广泛地参与植物发育和植物次生代谢的调节。根据前期芯片杂交和文库筛选得到的2个MYB转录因子的部分序列,采用RT-PCR和RACE技术分离得到它们的全长基因:CsMYB1和CsMYB2,在GenBank的登录号分别为HQ660373和HQ660374。序列分析表明:CsMYB1基因全长1132bp,开放阅读框长879bp,编码292个氨基酸,推测的蛋白分子量约为32.9ku,理论等电点为8.13;CsMYB2基因全长1020bp,其中开放阅读框长675bp,编码224个氨基酸,推测的蛋白分子量约为25.4ku,理论等电点为9.05。2个基因编码的蛋白均具有明显的R2R3MYB结构域,且在R3结构域的下游都含有1个相对保守的C1(LIXXGIDPXTHR)基序。同源性分析表明:茶树CsMYB1和CsMYB2编码的氨基酸序列与其他植物的MYB类转录因子具有较高的相似性,其中CsMYB1编码的氨基酸序列与陆地棉MYB1的相似性为57%,CsMYB2编码的氨基酸序列与葡萄MYBC2的相似性为75%。利用荧光定量PCR技术检测2个转录因子基因在遮荫处理条件下的表达规律,及其在茶树不同组织中的表达特性,结果表明:CsMYB1和CsMYB2在不同组织中均有表达,但表达量具有明显区别,其中CsMYB2在叶片中的相对表达量是根中的100多倍;而遮荫处理能明显降低叶片中的花青素含量,并提高CsMYB1的表达,但对转录因子CsMYB2的影响不大。     

绿原酸的提取及稀土配合物抗菌活性测定

以乙酸乙酯和 0.05 mol/L HCl组成的混合溶液作萃取剂,从金银花中一步提取绿原酸.研究了乙酸乙酯体积分数、温度、浸取时间对提取绿原酸的影响.并用绿原酸与LaCl3·6H2 O反应合成了绿原酸合镧(Ⅲ)配合物,通过元素分析、红外光谱、热重分析和化学分析,确定配合物的组成为:[La(C16H17O9)3]·2H2 O.测试了配体和配合物分别对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的抗菌活性.实验结果表明,提取绿原酸最佳实验条件是:温度 65 ℃,乙酸乙酯体积分数 80 %,浸取时间 3 h.提取物相对原料量的质量分数为 3.21 %,绿原酸的质量分数 86.3 %;绿原酸抗金黄色葡萄球菌的活性比抗大肠杆菌强.配合物对大肠杆菌的抗菌活性比配体明显增强,但对金黄色葡萄球菌的抗菌活性反而比配体弱.     

普通油茶泛素结合酶UBE2-J2的cDNA序列及蛋白质结构分析

泛素结合酶（E2）是泛素/26S蛋白酶体途径中3个关键酶之一,在靶蛋白识别、与泛素连接酶（E3）互作等蛋白的泛素依赖性水解和N-末端规则依赖性水解途径的关键环节中起重要作用。采用Solexa测序技术获得了1条普通油茶E2的全长cDNA序列,命名为 UBE2-J2, 该基因编码239AA,与其它物种的E2具有较高的一致性和相似性;同源建模的结果表明：普通油茶UBE2-J2蛋白具有泛素结合酶催化位点（UBCc）,第8~122位氨基酸碱基为其泛素结合酶基因家族的保守区域,第75~122位氨基酸残基区域中有17个可与泛素形成硫酯键中间产物的残基,其中,87位的半胱氨酸残基是该酶活性中心位点,另有5个残基是与E3酶相互作用的位点。UBE2-J2具有C端延伸结构,故普通油茶UBE2-J2蛋白属于Ⅱ类E2基因家族成员。     

渗透胁迫对小桐子幼苗脯氨酸积累及其代谢途径的影响

植物在渗透胁迫下,积累脯氨酸以降低渗透势是重要的抗逆境调节途径。本研究以聚乙二醇(PEG 6000)不同浓度的溶液模拟渗透胁迫,研究了其对小桐子幼苗脯氨酸积累及其代谢途径的影响。结果表明,PEG 6000处理可显著提高小桐子幼苗的脯氨酸含量及脯氨酸合成代谢关键酶Δ1-吡咯琳-5-羧酸合成酶(P5CS)和鸟氨酸转氨酶(OAT)的活性,而降低了脯氨酸脱氢酶(Pro DH)的活性。RT-PCR分析也显示,10%PEG 6000处理显著上调了P5CS和OAT基因的表达水平,但抑制了Pro DH基因的表达,表明渗透胁迫可通过活化脯氨酸合成的两条途径和抑制其降解途径促使小桐子积累大量的脯氨酸。     

真菌漆酶分子生物学研究进展

概述了漆酶分子生物学的研究情况,包括其理化性质、氨基酸序列分析、基因克隆、基因结构分析和组织分析、基因家系、表达调节及异源表达.     

杜仲内树皮化学组成及抽提成分的研究

研究了杜仲内树皮及其抽提物的一般物、矿物质、脂肪酸与单糖的化学组成.结果表明,碳水化合物(92.97%)、钙(5.1769mg/g)、α - 亚麻酸(27.4%)及葡萄糖(130.51mg/g)分别是杜仲内树皮的一般物、矿物质、脂肪酸与单糖的主要组成成分.采用Sephadex LH - 20柱色谱及薄层色谱等方法,从其70%丙酮提取物水溶性部分分到5种化合物,经波谱分析及理化性质化合物分别鉴定为:紫云英苷(1)、异槲皮苷(2)、槲皮素 - 3 - O - 木糖葡萄糖苷(3)、异绿原酸 A(4)、异绿原酸 C(5).化合物3～5为首次从该植物中分得.     

马占相思纤维素合酶基因AmCesA1的克隆及分析

【目的】马占相思是我国南方广泛种植的一种造纸用树。纤维素合酶(CesA)在植物纤维素合成途径中发挥主要调节作用,是控制木材纤维品质和产量的重要因素。本研究克隆马占相思的纤维素合酶基因,研究它对激素的应答,为了解马占相思的纤维素合成和获得高纤维素得率的马占相思良种提供帮助。【方法】采用RT-PCR和RACE技术,从马占相思幼苗中获得1个CesA基因,命名为AmCesA1(AY643519)。利用生物信息学软件对该基因进行分析。使用Southern分析确定该基因的拷贝形式。采用实时荧光定量PCR确定该基因在不同组织中的表达量以及基因在赤霉素(GA_3)、6-BA、茉莉酸甲酯(MeJA)处理后的表达变化。【结果】AmCesA1的cDNA大小为3 793 bp,其开放读码框为3 249 bp,推测这个基因编码1 082个氨基酸;蛋白分子式为C5495H8491N1457O1579S50,分子质量为121.83 kDa。正电荷氨基酸残基数(Arg+Lys)的数目为121,负电荷氨基酸残基数(Asp+Glu)的数目为125;等电点为6.51,为酸性蛋白质;它的不稳定系数是40.82,属于不稳定蛋白质。AmCesA1的氨基酸一级结构分析显示它具有纤维素合酶保守的D,D,D,QxxRW功能域,具有植物纤维素合酶所特有的P-CR区及HVR区和N端的锌指结构,在C端存在6个跨膜区域,但在N端的2个跨膜区域并不明显。二级结构分析显示它具有较多的α-螺旋、无规则卷曲,β-转角很少,β-折叠数目因算法的不同存在较大差异。聚类分析表明,AmCesA1与大豆GmCesA1和蔓花生Ad CesA1相似性较高。但并没有出现预期同木本植物亲缘较近的结果。进一步与拟南芥纤维素合酶家族氨基酸序列比较,发现AmCesA1与拟南芥的AtCesA1和AtCesA10比较相似,其相似性为86%和80%,从而推测它的功能与拟南芥的AtCesA1和AtCesA10相近。Southern分析显示,马占相思基因组中,AmCesA1是以多拷贝形式存在。实时荧光定量PCR表明,AmCesA1广泛表达于根、茎、叶部位,且差异不显著。AmCesA1对GA_3、6-BA、MeJA处理均有响应,其中GA_3处理响应相对最强。【结论】本研究克隆到的马占相思AmCesA1为植物CesA基因家族中的一员,推测其参与初级细胞壁的形成。该基因对赤霉素、6-BA、茉莉酸甲酯处理均有响应,其中基因的表达量在不同的激素处理中都有不同程度的上调。表明该基因参与马占相思对激素应答的正调控。