蛇莓RAPD与ISSR-PCR反应体系优化

采用单因素试验结合正交试验,对PCR反应体系中的5种主要反应因子Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板DNA浓度进行优化筛选,确立了适合蛇莓基因组DNA的RAPD和ISSR反应体系,RAPD反应体系(20μL):Mg2+1.5 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶1 U、引物0.2μmol/L、DNA模板60 ng;ISSR反应体系(20μL):Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 250μmol/L、Taq酶0.5 U、引物1μmol/L、DNA模板60 ng。利用确立的体系对24份蛇莓种质进行扩增,结果条带清晰明亮,多态性好。     

思茅松SSR-PCR反应体系优化研究

以思茅松杂交亲本JG1号基因组DNA为模板,利用正交设计实验对影响SSR-PCR反应体系的主要因子进行了优化,建立了一套最佳思茅松SSR-PCR反应体系。结果表明:在25μL最佳反应体系中,各组分最佳含量分别为Mg~(2+) 2.0 mmol/L、DNA 60 ng、引物0.50μmol/L、Taq DNA聚合酶0.25U、dNTP 0.20 mmol/L。利用11份个体对此SSR反应体系进行验证,获得扩增谱带清晰且多态性较好,证明该体系稳定可靠。     

果梅ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以果梅品种桃梅为试材, 通过单因子试验分别研究了DNA模板浓度、引物浓度、 Mg2 浓度、 dNTPs浓度、退火温度及循环数等对果梅ISSR-PCR反应的影响. 建立了果梅ISSR-PCR 的最佳反应体系 20 μL反应体系中含10× buffer 2 μL, 2.5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTPs, 0.32 μmol/L引物, 20～80 ng模板DNA, 1 U Taq DNA聚合酶. 利用优化的反应体系, 对19个果梅品种进行体系稳定性检测, 结果表明该反应体系的重复性和稳定性良好.     

蛇莓ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用单因素试验对蛇莓ISSR—PCR反应体系中的6种主要反应因子（模板DNA、Mg^2＋、Taq DNA聚合酶、BSA、dNTP及引物）进行优化筛选，确立了适合蛇莓ISSR分析的最佳PCR扩增反应体系，即10μl PCR反应体积中含：1×TaqDNA聚合酶配套缓冲液（10mmol／L Tris·HCl，pH值9．0；50mmol／L KCl；0．1％Triton X-100），1．75mmol／L Mg^2＋，2mg／ml BSA，0．2mmoL／L 4×dNTP，10ng模板DNA，18pmol引物，0．5U Taq DNA聚合酶。     

梨属植物RAPD反应体系的建立与优化

以鸭梨、杜梨为材料,对梨属植物DNA的提取及RAPD反应体系进行了系统优化,建立了梨属植物最佳反应体系及参数。结果表明,适当提高抗氧化、抗酚类物质的浓度(2%β-巯基乙醇,2%PVP-40,20 mmol/LNa2S2O5),提取的基因组DNA纯度较高;反应体系中含有Mg2+2.0 mmol/L,dNTPs浓度200μmol/L,引物0.4μmol/L,模板DNA 1.6 ng/μL,Taq DNA聚合酶0.06 U/μL,可成功用于梨属植物RAPD扩增。说明改良的CTAB法能成功用于梨属植物DNA提取,建立的最佳反应体系可用于梨属植物RAPD扩增。     

茶藨子总DNA提取及ITS-PCR体系的优化

利用Tiangen DP305试剂盒对茶藨子(Ribes L.)总DNA进行提取,应用单因子试验分析了DNA模板、dNTPs、引物和Taq酶对ITS-PCR扩增结果的影响,并建立了茶藨子ITS-PCR扩增反应的优化体系,最优反应体系为:25μL体系中,10×PCR buffer 1μL、Mg2+0.4 mmol/L、引物浓度0.5μmol/L、dNTP浓度为1 mmol/L、Taq酶的用量1.0 U、DNA模板用量为50 ng。优化后的反应体系可作为茶藨子属植物ITS-PCR的基本反应体系,为进一步开展茶藨子属的分类和系统发育研究奠定基础。     

棕榈科植物SSR分子标记反应体系的建立

以棕榈科植物的DNA为材料,通过对SSR反应体系中模板DNA、dNTPs、引物、Taq聚合酶和MgCl25个因素采用单因素试验法设定5个梯度,并比较不同的浓度、不同的用量对扩增效果的影响,建立最佳反应体系。研究最终确定了20μL PCR反应体系的最佳条件为:模板DNA 2μL,dNTPs 0.2μL,引物1.0μL,Taq聚合酶0.2μL,MgCl22.0μL。该优化体系稳定可靠,适合应用于棕榈科植物SSR分析。     

沙棘SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的SRAP-PCR反应体系,对影响SRAP-PCR的Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、模板DNA浓度进行了优化.优化后的反应体系为Mg2+3.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶2U/25μL、引物0.8 μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、模板DNA 30ng/25μL,反应总体系25 μL.利用此体系从30对引物组合中筛选出17对适合沙棘SRAP-PCR的引物,有助于沙棘的分子标记辅助育种研究.     

三叶草RAPD反应条件的优选

以红三叶(Trifolium pretense L.)、白三叶(Trifolium repens L.)和杂三叶(Trifolium Hybridum L.)三种三叶草为材料,对RAPD反应条件中的dNTP浓度、随机引物浓度、模板DNA用量、Taq DNA聚合酶用量、退火温度以及预变性时间分别进行梯度试验.结果表明,该反应体系体积为25 μL:ddH2O,19.1 μL;10×Buffer,2.5 μL;Primer,200 nM;dNTP,200μM;Taq DNA聚合酶,1U;Template DNA 1ng/μL.通过试验建立了一套稳定的RAPD反应体系,该反应体系扩增效果良好.     

单雌蓖麻ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以单雌蓖麻提取的基因组DNA为材料,采用单因子试验方法,分别研究了Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶以及模板DNA用量5种因素对ISSR-PCR反应的影响;建立了适合单雌蓖麻IS-SR-PCR扩增的反应体系,即在20μL反应体系中,10×PCR buffer 2.5μL(Mg2+free),模板DNA 20 ng,2.0mmol/L MgCl2,引物浓度1.0μmol/L,dNTP 0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U。     

西蓝薹RAPD-PCR反应体系的建立与优化

以新型蔬菜西蓝薹为研究对象,采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取基因组DNA,并通过单因素多水平梯度试验,筛选了Taq酶、引物、DNA模板、Mg2+、dNTPs的浓度或用量,建立了西蓝薹RAPD-PCR的最佳反应体系:25 μL反应体系中含0.8 U Taq酶、0.40 μmol/L引物、30 ng DNA模板、1.6 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、2.5 μL 10×PCR buffer.利用优化的反应体系,对5个西蓝薹品种进行体系稳定性检测,结果表明该反应体系的重复性和稳定性良好.     

半矮生桃基因组DNA的提取及SSR-PCR反应体系的优化

为获得高纯度高质量的DNA和建立稳定的SSR-PCR反应体系,采用常规CTAB法和改进CTAB法提取半矮生桃基因组DNA。结果表明:改良CTAB法提取的DNA纯度高,多糖和蛋白质含量低,可用于SSR反应。同时,通过对影响SSR反应的6个要素设计正交试验,确定了最优的SSR-PCR反应体系,20μL反应体系为:25 mmol/LMg2+1.5μL、2.5 mmol/L dNTPs 2μL、5 U的Taq酶0.22μL、10×Buffer缓冲液4μL、10 mmol/L引物0.6μL、20 ng模板0.8μL,优化的退火温度为57.6℃。     

野牛草ISSR-PCR反应体系的优化与建立

根据正交试验设计原理探索野牛草[Buchloe dactyloides(Nutt.)Engelm.]ISSR-PCR反应体系中各主要成分的最优化用量,对影响野牛草ISSR-PCR反应体系的主要因素[d NTP、Taq DNA聚合酶、引物(Primers)、Mg~(2+)的用量]进行优化,获得野牛草的ISSR-PCR最适反应体系为20μL的反应体系,包括引物(2.0μmol/L)4.0μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2μL、MgCl_2(25 mmol/L)1.6μL、d NTP(2 mmol/L)2.0μL和模板DNA(20 ng/μL)3.0μL。该优化体系的建立为利用ISSR分子标记进行野牛草种质资源遗传多样性研究、种质资源鉴定等奠定了基础。     

甘蔗鞭黑粉菌ISSR-PCR反应体系的优化

以甘蔗鞭黑粉菌交配型分离物为试验材料,采用CTAB法提取基因组DNA,并对影响甘蔗鞭黑粉菌ISSR-PCR反应体系中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立起适合甘蔗鞭黑粉菌基因组DNA的ISSR-PCR反应体系。优化的反应体系为:在25μL体系中,rTaq DNA聚合酶1.5 U、Mg2+浓度为2.0 mmol/L、dNTP浓度为0.2 mmol/L、引物浓度为0.2μmol/L、DNA模板10～20 ng、10×PCR buffer 1μL、用重蒸水补足25μL。     

中国鲎微卫星引物扩增圆尾鲎DNA的PCR反应体系优化

采用正交设计法,从dNTPs浓度、引物浓度、Mg2＋浓度、Taq DNA聚合酶用量4个因素3个水平出发,优化设计圆尾鲎DNA的PCR反应体系（引物为中国鲎微卫星引物）.并采用直观分析方法分析正交试验结果,最终建立了圆尾鲎SSR-PCR最佳反应体系：总体积20μL,Taq DNA聚合酶1.5 U、dNTPs 0.16 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2＋2.0 mmol/L;并通过PCR梯度实验进一步优化模板DNA质量浓度、退火温度及退火时间,获得最佳反应条件：模板DNA质量浓度为30 ng/μL,退火温度为48℃,退火时间为20～25 s.对最佳反应体系和反应条件进行了检验,结果显示该反应体系稳定性高、重复性好.     

蝴蝶兰SRAP反应体系的建立与优化

以蝴蝶兰嫩叶提取的DNA为材料,蝴蝶兰SRAP反应体系中的重要参数Mg2＋、Taq酶、模板DNA及随机引物,建立了一套适合蝴蝶兰基因扩增的SRAP反应体系：25μL的反应体系中Mg2＋浓度为2.0mmol/L,Taq酶1.0U,DNA模板40ng,上下游引物0.8mmol/L。该体系扩增条带清晰,重复性好,有望在蝴蝶兰属植物的遗传育种研究中运用。     

花生MITE反应体系优化及其遗传多样性分析

为了建立适宜不同来源花生种质遗传差异分析的MITE反应体系,本研究从反应体系总量、Taq PCR Mix用量、引物浓度、模板DNA浓度及退火温度、循环次数方面对反应体系进行优化,得到的最佳反应体系为:反应总体积10μL,模板DNA 20 ng,引物(15μmol/L)2μL,Taq PCR Mix 5μL.反应程序为9...     

芦笋基因组DNA提取与ISSR反应体系的优化

ISSR标记技术在芦笋上目前还未见相关的研究报道。本研究在改进芦笋基因组DNA提取方法基础上,以芦笋基因组总DNA为模板,对芦笋ISSR反应体系的重要参数进行优化试验,建立了一套适用于芦笋稳定可靠、重复性强的ISSR反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量50 ng、Mg2+浓度2.0 mmol/L、正反引物各0.2μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、TaqDNA聚合酶1 U以及1×Buffer。     

大豆孢囊线虫ISSR反应体系的建立与优化

采用正交设计对大豆孢囊线虫ISSR-PCR反应体系的4因素(Taq酶、模板DNA、d NTPs、引物),在4个用量水平上进行优化试验。结果表明:大豆孢囊线虫ISSR-PCR的最佳反应体系为在25μL反应体系中,含Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0. 34μL、模板DNA 1. 2μL、d NTPs(2. 5 mmol/L) 1. 5μL、引物(10μmol/L)0. 8μL、10×PCR Buffer 2. 5μL。引物PTY26最适退火温度为55℃。用引物PTY188和PTY888对大豆孢囊线虫最佳ISSR-PCR的反应体系进行验证,结果表明该反应体系和程序有较好的重复性和稳定性。     

白花蛇舌草ISSR反应体系的建立与优化

通过单因素考察结合正交试验的方法,基于反应体系中Taq DNA聚合酶量、DNA模板用量、d NTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度等5因素4水平条件对ISSR反应体系进行优化。白花蛇舌草ISSR-PCR的20μL最佳反应体系为引物浓度0. 562 5μmol/L,Mg2+浓度2. 75 mmol/L,d NTPs浓度0. 375 mmol/L,DNA模板量60 ng,Taq DNA聚合酶1. 25 U,2. 0μL 10×Taq Buffer,其余用dd H_2O补齐。该试验建立并优化了白花蛇舌草ISSR-PCR反应体系,为白花蛇舌草种质资源遗传多态性的研究提供参考依据。