丁雌核发育鱼的异源精子诱导及其与亲本的RAPD比较分析

鱼类人工雌核发育的研究始于20世纪50年代,在随后的50年里发展迅速。雌核发育可以为纯系建立、性别控制、基因定位等研究提供一种有效途径,乃鱼类遗传育种研究工作活跃领域之一[1-3]。丁(Tincatinca)隶属于鲤科、雅罗鱼亚科、丁属,是一种广温性鱼类(0～37℃)。主要分布于欧洲,在我国仅分布于新疆额尔齐斯河流域[4]。由于丁雌鱼生长比雄鱼快,Linhart等[5]对其人工诱导雌核发育和雌核发育子代性逆转进行了研究。但到目前为止,与其他大多数鱼类雌核发育研究工作一样,尚未获得功能性雄鱼。本研究旨在对丁人工雌核发育条件进行探索,…     

团头鲂良种雌核发育群体的建立及其遗传变异

为了巩固经15年选育而成的团头鲂良种－浦江一号的成果，并建立纯系以供进一步研究和开发，1999年和2000年，先后对团头鲂选育系三龄鱼（F5）和二龄鱼（F6）进行了雌核发育（抑制第二次成熟分裂）研究。利用UV照射遗传失活的鲤鱼精子诱导，采用冷,凶制团头鲂第二体排出；探索了适合团头鲂二龄及三龄鱼卵的休克温度、起始时间和持续时间，结果发现：二龄鱼和三龄鱼诱导起始时间均在受精后3min效果最好，而在体温度和持续时间上稍有差异，其中三龄鱼在0－2℃冷休克处理30min、二龄鱼在4－6℃冷休克处理20min效果较好。2年期间，建立了源于选育系3尾雌亲鱼的3个雌核发育群体，共获得正常的雌核发鱼后代1000余尾。RAPD分析发现，选育系群体具有引物S8扩增的1100bp条带，而雌核发育群体具有引物S18扩增的860bp条带；雌核发育群体内遗传相似度显著高于选育系群体，其遗传距离仅为选育系群体内遗传距离的54％。     

热休克诱导鲫鱼纯合雌核发育二倍体的研究

采用热休克的方法诱导鲫鱼纯合雌核发育二倍体。正交试验和重复试验结果分析表明，诱导鲫鱼纯合雌核发育二倍体的适宜条件是：在受精后的第46分钟和第54分钟，采用38℃、持续2min的热休克处理，雌核发育二倍体的产量最高可达18．1％。     

源于五种不同雌金鱼的二倍体产雌后代的性比率

雌核发育后，在雌鱼同配种类(XX)中，所有的予代将是雌性的，但在雌鱼的异配种类(ZW)中，按照性决定轨迹的重组频率或两种性别的遗传生存力，可以产生不同比率的雄性后代。     

黑鲷精子诱导漠斑牙鲆雌核发育研究

采用紫外线遗传失活的黑鲷精子与漠斑牙鲆卵子授精,获得了漠斑牙鲆雌核发育单倍体受精卵,经冷休克处理后诱导出漠斑牙鲆雌核发育二倍体.试验结果表明,黑鲷精子经紫外线照射后(0～180 J/cm2)与漠斑牙鲆卵子受精,胚胎孵化率呈现明显的Hertwig效应.黑鲷精子遗传失活的最适紫外线照射剂量为120 J/cm2.18℃的水温条件下,冷休克处理的最适时刻为受精后4 min.处理持续时间和处理温度组合试验表明,在相同处理持续时间条件下,3℃休克水温处理效果均优于对应1℃休克水温各组,且45 min处理持续时间诱导效果最佳.综合试验结果,黑鲷精子诱导漠斑牙鲆雌核发育的适合条件为:水温18℃,将黑鲷精子经120 J/cm2紫外线照射后与漠斑牙鲆卵子受精,受精后4min,用3℃冷海水处理45min,可获得46.59％的雌核发育漠斑牙鲆二倍体初孵仔鱼.     

二次正交旋转组合设计优化人工诱导翘嘴鲌雌核发育

采用紫外线照射鲤鱼(Cyprinus carpio)精子使其遗传物质失活,并用冷休克方法抑制翘嘴鲌(Culter alburnus)卵第二极体的排出,诱导出翘嘴鲌雌核发育二倍体。运用3因素5水平二次正交旋转组合设计方法,分别建立冷休克起始时间(x_1)、处理时间(x_2)和处理温度(x_3)3个因素与翘嘴鲌雌核发育率(y_1)和孵化率(y_2)两个指标之间的二次回归模型,探究翘嘴鲌减数分裂雌核发育的最优诱导条件组合。并采用响应面分析法(RSM),讨论各因素水平的单因素效应、互作效应对响应值的影响。结果表明,受精后6 min进行冷休克,处理时间为18 min,休克温度为7℃时,雌核发育率达最大(18.60%);受精后6 min进行冷休克,处理时间为23 min,休克温度为5℃时,孵化率达最大(33.00%)。各因素对响应值的影响均是呈开口向下的抛物面关系。根据因素贡献率得到,起始时间对翘嘴鲌雌核发育影响极显著,冷休克处理温度次之,而冷休克处理时间的影响最小。     

3种染色体组加倍方法诱导黄河鲇雌核发育的比较

用经紫外线照射后遗传失活的黄河鲇精子、刺激性成熟的黄河鲇卵子,进行雌核发育,采用冷休克、热休克和秋水仙素浸泡等3种染色体组加倍方法诱导黄河鲇卵进行二倍体雌核发育.实验结果表明:在人工诱导黄河鲇二倍体雌核发育过程中,以冷休克处理组的效果最好,胚胎孵化率达到8.1%;其次为秋水仙素处理组,胚胎孵化率达到6.3%;热休克处理组诱导效果较差,胚胎孵化率仅为4.0%.     

3种染色体组加倍方法诱导黄河鲇雌核发育的比较

用经紫外线照射后遗传失活的黄河鲇精子、刺激性成熟的黄河鲇卵子, 进行雌核发育, 采用冷休克、热休克和秋水仙素浸泡等3种染色体组加倍方法诱导黄河鲇卵进行二倍体雌核发育。实验结果表明: 在人工诱导黄河鲇二倍体雌核发育过程中, 以冷休克处理组的效果最好, 胚胎孵化率达到8. 1%; 其次为秋水仙素处理组, 胚胎孵化率达到6. 3%; 热休克处理组诱导效果较差, 胚胎孵化率仅为4. 0%。     

利用紫外线辐射遗传失活精子诱导虹鳟雌核发育

本试验利用紫外线辐射遗传失活精子,热休克诱导虹鳟雌核发育,确定了最佳诱导参数。结果表明,精子经紫外线照射80 s、卵受精后40 min在26℃水浴下持续处理15 min,雌核发育率最高,育成率为21.35%。利用白化体虹鳟品系金黄体色的显性性状作为鉴定雌核发育个体的依据,方法可行。     

七彩鲑雌核发育及其倍性研究

利用紫外线照射对七彩鲑(Salvelinus fontinalis)精子进行灭活处理,使其遗传物质失活,作为同源精子诱导源,与七彩鲑卵子进行受精,采用冷休克方法诱导雌核发育。结果表明:同源精子可以诱导七彩鲑的雌核发育,紫外照射强度为72 m J/cm2;距离为8 cm;冷休克温度为20℃。七彩鲑减数分裂雌核发育倍性测定以鸡(Gallus sp.)红细胞DNA含量(2.5 pg/N)为标准、七彩鲑普通育苗子一代为参照,采用流式细胞术和微卫星标记技术对30尾七彩鲑减数分裂雌核发育鱼苗进行分析,证明了雌核发育鱼苗为雌核发育二倍体。     

牙鲆雌核发育研究进展

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一种重要的海水经济鱼类,其雌性生长速度显著快于雄性。因此,生产全雌牙鲆对提高养殖产量和经济效益具有重要意义。雌核发育是一种特殊的有性生殖方式,在这种生殖方式中,灭活的精子进入卵子,激活胚胎发育,但精核不与卵核融合形成合子,所以雌核发育的个体只具有母本的遗传信息。目前,牙鲆已成为雌核发育技术应用于产业的代表性鱼类。本文对牙鲆人工诱导雌核发育的研究进展进行综述,介绍牙鲆减数分裂雌核发育和有丝分裂雌核发育的诱导方法,以及雌核发育技术在性别控制、克隆制备等育种研究中的应用。最后,作者提出"雌核发育育种体系"构想,并对其在鱼类育种和遗传研究中的应用前景进行展望。     

紫外辐射灭活大黄鱼和黄姑鱼精子及其激活大黄鱼卵子发育为胚胎的效果

为探讨大黄鱼(Larimichthys crocea)和黄姑鱼(Nibea albiflora)精子的紫外辐射灭活适宜剂量及其激活大黄鱼卵子发育为胚胎的效果,以Ringer氏液为稀释液,按1:30稀释大黄鱼和黄姑鱼精子,采用自制紫外灭活装置[紫外辐射强度2200μW/(cm~2·s),紫外波长254 nm]对这2种鱼的精子进行紫外照射处理及活力测定,然后与正常大黄鱼卵子进行人工授精,授精后一部分卵未作冷休克处理,另一部分卵进行了冷休克处理(受精2 min 30 s,3℃海水,冷休克10 min),并进行了早期胚胎成活率和仔鱼孵化率的测定与比较。结果显示:1)大黄鱼和黄姑鱼精子的激活率与紫外照射处理时间呈负相关,精子的快速运动时间变化呈典型的Hertwig效应。2)未冷休克组中大黄鱼和黄姑鱼诱导的早期胚胎成活率与精子的紫外照射时间总体呈负相关,而仔鱼孵化率呈Hertwig效应。3)冷休克组中大黄鱼和黄姑鱼精子诱导的早期胚胎成活率和仔鱼孵化率随紫外照射时间的增加呈Hertwig效应,分别于2 min 20 s和1min 30 s时达相对峰值,此时,大黄鱼早期胚胎成活率和仔鱼孵化率分别为(38.3±4.3)%和(66.5±5.1)%,黄姑鱼早期胚胎成活率和仔鱼孵化率分别为(43.3±3.3)%和(67.7±6.3)%。分析认为,大黄鱼和黄姑鱼精子遗传失活的紫外辐射剂量分别以308 m J/cm~2和198 m J/cm~2为佳。本研究旨在为大黄鱼雌核发育技术的改进提供依据。     

翘嘴鳜人工雌核发育的初步研究

采用紫外线照射灭活精子,经冷休克诱导染色体加倍的方法对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)进行人工诱导雌核发育育种。灭活翘嘴鳜精子,紫外线照射剂量80 mJ/cm2是最佳的辐射剂量。冷休克结果表明,在0～3℃冰水下,冷休克起始时间为授精后3～7 min均有效,以5 min为最适;冷休克持续时间10-50 min均有效,以30 min最佳。综合以上两项因素,授精5 min后,休克时间持续30 min组的原肠胚存活率和孵化率均为最高,与其他处理组差异显著(P<0.05),此时雌核发育率最高,达到4.72%。     

花鲈冷冻精子诱导漠斑牙鲆雌核发育

采用紫外线(UV)对冻存的花鲈精子进行照射使其遗传物质失活,作为异源精子诱导源,与漠斑牙鲆卵子进行“授精”,可以诱导漠斑牙鲆卵进行雌核发育。结合静水压处理,抑制第二极体排出,成功获得了漠斑牙鲆雌核发育二倍体鱼苗。实验表明,同源精子和异源精子均可在紫外线照射遗传失活后诱导漠斑牙鲆卵雌核发育,经实验筛选出异源精子诱导漠斑牙鲆雌核发育的最佳条件为花鲈冻存精子采用80 mJ/cm²的紫外线照射,然后与漠斑牙鲆卵子进行授精,培育水温18 ℃条件下,受精后4~5 min,施以65 MPa的静水压休克处理6 min,可有效诱导漠斑牙鲆卵的雌核发育。采用形态学、流式细胞仪DNA含量分析和微卫星标记技术对雌核发育鱼苗进行了分析,证明了雌核发育鱼苗为雌核发育二倍体。本文首次报道了采用异源冷冻精子诱导漠斑牙鲆鱼卵进行雌核发育的技术方法,为漠斑牙鲆性别控制和遗传改良提供了技术手段。     

普安银鲫异精雌核发育子代稻田养殖试验

普安银鲫〔Carassius auratus(Linnaeus)〕属鲤形目、鲤科、鲃亚科、鲫鱼属,俗称鲫壳鱼,系贵州省普安县青山镇一带独特的高原自然环境条件下形成的一个鲫鱼地方种,1991年经上海市水产研究所鉴定为营天然雌核发育的鱼类。兴国红鲤是江西省兴国县自然环境的长期影响下逐渐形成的一个鲤鱼地方种,1985年经全国水产原良种审定委员会审(认)定     

雌核发育草鱼的遗传结构分析和微卫星鉴别方法的建立

采用微卫星标记检测草鱼群体的遗传多样性,并根据纯合度的变化建立了雌核发育草鱼的鉴别技术。结果显示,8个位点共扩增出33个等位基因;在普通草鱼中,平均纯合度和PIC分别为0.203 1和0.552 8;在雌核发育群体中,则为0.716 1和0.357 2;2个群体间遗传相似度为0.873 3。其中,5个位点在雌核发育草鱼中纯合度明显提高,雌核发育草鱼在这5个位点的扩增总条带数为5~7个,普通草鱼则为8~10个,由此可100%区分2个草鱼群体。通过概率计算,理论鉴别概率达到99.92%。研究表明,雌核发育技术对草鱼的群体遗传结构改变较大,是快速建立纯系、固定优良性状的有效手段;根据群体遗传纯合度的改变、扩增条带数目差异,应用多态性微卫星分子标记可以简单、有效地区分雌核发育群体(或与之相似的高度近交群体)与普通群体。     

雌核发育橙黄色锦鲤的遗传、性腺发育及外形等特征研究

用经紫外线灭活的团头鲂精子激活橙黄色锦鲤的卵子,在4℃的水温下冷休克处理卵子30 min使其染色体加倍,获得了孵化率为30.6％、存活率为24.2％的雌核发育锦鲤,表明该雌核发育锦鲤研制方法具有较高的效率.利用外周血细胞培养方法制备了雌核发育锦鲤染色体并利用核型分析方法对其核型进行了分析,发现雌核发育锦鲤染色体数目为100,核型公式为22 m+34 sm+22 st+22 t;表明雌核发育锦鲤为二倍体,其核型与锦鲤母本一致.利用石蜡切片方法,随机选取10尾1龄雌核发育锦鲤性腺进行检测,发现其性腺全部为卵巢;并且在繁殖季节随机检测100尾2龄雌核发育锦鲤,没有l尾能挤出精液,表明雌核发育锦鲤全部为雌性,为证明雌性锦鲤的性别决定类型为XX提供了重要证据.此外,还对雌核发育锦鲤与母本的的SOX基因遗传关系、外形、体色等进行了比较,结果表明雌核发育锦鲤与母本有相同的SOX基因扩增片段,为证明其为雌核发育锦鲤而非杂交后代提供了重要证据;同时,雌核发育锦鲤保留了母本体态优美的特点,且具有色泽更鲜艳等优点,表明该雌核发育方法产生了遗传改良效果.雌核发育锦鲤的获得为该观赏鱼的提纯复壮、遗传改良以及性别决定和性别控制研究奠定了基础.     

施氏鲟精子诱导匙吻鲟雌核发育

采用照射强度为10 188 μW/(cm2·s),照射距离为15 cm的紫外线对施氏鲟(Acipenser schrenckii)精子进行4～7 min的照射,用照射后的精子对匙吻鲟(Polyodon spathula)卵进行人工授精,以探索精子的最佳紫外线照射时间.设计热休克起始时间、持续时间和休克温度3因子、3水平的正交试验,以探索人工诱导匙吻鲟雌核发育的理想热休克条件.结果表明:用紫外线照射5 min处理的施氏鲟精子,与匙吻鲟卵受精所得胚胎经染色体观察均为单倍体(n=60),表明照射精子遗传失活的有效性和可靠性;若热休克处理前受精卵保持在(18±013)℃,在一定的休克温度(35～39℃)条件下,于不同时间(受精后16～20 min)起始热休克,持续处理2 min均能诱导受精卵染色体加倍.对热休克处理条件的优化结果表明,将受精卵于受精后18 min,在37℃的水中热休克处理2 min,二倍体诱导率最高,达18.8%.染色体鉴定显示,该条件下处理的胚胎均为二倍体(2n=120),未发现单倍体和非整倍体.本研究为进一步分析异源精子诱导匙吻鲟雌核发育机制以及匙吻鲟性别决定的分子机制奠定了基础.     

黄姑鱼雌核发育诱导及鉴定

为建立黄姑鱼雌核发育诱导方法,实验利用紫外线照射使黄姑鱼精子遗传失活,与卵子授精后再通过冷休克抑制极体排放进行倍性恢复,成功诱导出黄姑鱼雌核发育二倍体。精子经强度为3 800μW/(cm²·s)的紫外线照射10～100 s,受精卵孵化率呈现明显的Hertwig效应;当照射时长达到60 s以上,各实验组全部孵出仔鱼均呈现单倍体综合症。精子的紫外线照射时间、受精卵冷休克起始和持续时间等三因素三水平正交实验结果表明,精子经紫外线照射60 s,受精2 min后卵子在3～4 ℃海水中持续冷休克10 min为最佳诱导条件组合,可以获得最高的孵化率(16%)。最佳组合仔鱼形态和细胞相对DNA含量与正常二倍体一致,经微卫星标记检验证明全部不含有父本基因,为雌核发育二倍体。实验报道了成功诱导黄姑鱼雌核发育二倍体的条件,为进一步开展黄姑鱼良种选育和性别控制工作奠定了基础。     

异育银鲫在广西钦州试养报告

鲫鱼在我国已知有二个种(黑鲫和鲫)和一个亚种(银鲫)。异育银鲫是中国科学院水生生物研究所以黑龙江省方正县双凤水库的银鲫作母本，江西兴国红鲤作为父本育出的一个鲫鱼养殖新对象。母本银鲫是三倍体雌核发育。父母红鲤与银鲫是不同种的鱼，这两种鱼人工远缘“杂交”所产生的鲫鱼新一代，名为“异育雌核发育银鲫”简称叫“异育银鲫”。