棉花CML基因家族成员鉴定与功能分析

【目的】类钙调素(Calmodulin-like,CML)蛋白是1种重要的Ca2+传感器,在调节植物应激反应机制中起重要作用。对CML基因家族进行全基因组学分析,以便深入研究CML基因在棉花逆境胁迫下的作用。【方法】利用生物信息学的方法进行了棉花CML家族成员的鉴定。利用转录组数据和反转录聚合酶链式反应分析陆地棉(Gossypium hirsutum L.)CML基因在盐胁迫下的表达模式。利用病毒诱导基因沉默技术对GhCML44-2基因进行沉默并进行功能验证。【结果】在陆地棉(Gossypium hirsutum L.)、雷蒙德氏棉(G. raimondii Ulbrich)、亚洲棉(G. arboreum L.)中分别获得了154个、74个、78个CML蛋白。进化树和保守基序分析表明,GhCML蛋白分为8个亚类,都含有保守的EF-hand结构域;在盐胁迫下,107个GhCML基因在叶和根中有显著的差异表达,且在根和叶中的差异表达模式不同。启动子分析表明,这些基因启动子中存在多种不同的胁迫响应元件;利用病毒诱导基因沉默技术成功沉默GhCML44-2的棉株相较于对照更加不耐盐。【结论】该研究结果有助于了解棉花CML基因家族的进化与功能,为后续研究其功能提供了一定的理论依据。     

通过GbF3’H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能

【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3’H基因单独沉默以及GbF3’H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3’H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3’H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型<空载体对照相似文献   

棉花黄萎病相关基因GhAAT的克隆与功能鉴定

棉花黄萎病(Verticillium dahliae)是一种土传性真菌维管束病害,严重影响棉花的生产。本研究通过转录组数据分析筛选出一个与棉花黄萎病相关的氨基酸转运蛋白GhAAT基因,该基因在棉花根部响应黄萎病菌诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能。结果显示将该基因在棉花TM-1的叶片和根部沉默后,棉花对黄萎病抗性减弱,证明GhAAT基因参与调控了棉花抗黄萎病功能。发掘棉花抗黄萎病菌重要调控基因并揭示其分子机制对培育棉花抗病品种具有重要意义。     

棉花黄萎病菌与品种互作的格局分析

 以23个棉花品种(系)接种18个黄萎病菌株的抗感表现(病情指数)为分析对象,在聚类分析的基础上用双标图方法研究了寄主 病原的互作格局。结果表明：23个棉花品种分为6个抗病性不同的品种组,18个菌株聚为5个致病力不同的菌株群。5031和50312组成的品种组G1对所有菌株群具有最高抗性,可作为抗黄育种的高抗质源。来自河北成安的VD25与来自江苏常熟的XS4、XS6和XS7组成的菌株群S4与G5品种组存在互作,其致病力最强,是棉花黄萎病的优势菌株群,在抗黄育种和抗黄鉴定中应予以高度重视。S2和S3菌株群与56%的参试品种构成的3个品种组间存在互作,是潜在的优势菌株群。具平均抗病性的G2品种组是黄萎病菌的优良寄主。     

Analysis of Cotton Secondary Metabolites under the Interaction between Verticillium dahliae and Upland Cotton

[Objective] The aim of this study is to investigate the cotton differential metabolites in the interaction between Verticillium dahliae and cotton plant, and to explore new clues for the further study on the defense mechanism of cotton against V. dahliae. [Method] To obtain the cotton root, stem and leaf samples of the pathogen treated and healthy controls, the upland cotton cultivar CCRI 24 was selected as tested cotton material in this paper, and inoculated with V. dahliae conidia or sterile water by injuring root at the 2-true-leaf stage. The 70% (volume fraction) methanol extracts of these samples were separated and detected by ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (UPLC-ESI-MS), and the metabolite data were obtained by the online XCMS software. Through multivariate statistics and student’s t-test, the differential metabolites were investigated. The types of metabolites were putatively identified based on the comparison of the experimental molecular mass and the monoisotopic accurate molecular mass of cotton metabolites. [Result] The efficiency of negative ion mode was higher than that of positive ion detection mode in the cotton metabolites in UPLC-ESI-MS analysis. 576 ions mainly distributed in cotton root were found in the cotton seedling tissues including root, stem and leaf, which were the distinguished differential metabolites between V. dahliae treatment and healthy control. Among them, 77 ions were identified as sesquiterpenoids, diterpenoids, flavonoids, carbohydrates, aliphatics and phenols. In addition to sesquiterpenes, 17 compounds, including caffeic acid, astragalin, isoastragalin, dillenetin, ent-catechin, gossypetin 8-rhamnoside, gossypicyanin, herbacetin 7-glucoside, leucocyanidin, quercetin 3'-glucoside, quercetin 3-glucoside, quercetin 7-glycosides, α,2',3,3',4,4',6-heptahydroxychalcone 2'-glucoside, melibiose, sucrose, sucrose 6-phosphate and 1-tetratriacontanol, had not been reported in the literatures on the interaction between V. dahliae and cotton, which may be the novel pathogenesis-related metabolites on cotton Verticillium wilt. [Conclusion] The putative pathogenesis-related metabolites of cotton Verticillium wilt may play an important role in the interaction of cotton defense against V. dahliae, which provides an important clue for exploring the new resistant mechanism of cotton to Verticillium wilt.     

棉花黄萎病菌VdSge1基因的敲除与功能分析

为了明确棉花黄萎病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)的VdSge1基因功能,本研究利用基因同源重组原理,通过构建敲除载体,对棉花黄萎病菌落叶型强致病力菌株V592的VdSge1基因进行了敲除,获得了4个目标基因敲除的突变体;以野生型菌株V592为对照,通过对敲除突变体生物学性状和致病性测定,结果表明,突变体的菌落生长速度、产孢量明显高于野生型,并且丧失对棉花的致病性。利用q RT-PCR对其他基因在突变体中的表达情况进行分析,结果表明,VdSge1基因敲除后,VMK1、VGB和VdGARP1的表达量随之下降,而VDH1和PevD1的表达却明显上升。由此说明,VdSge1基因与大丽轮枝菌的菌落生长速度、产孢量及致病性密切相关,并且可以影响其他一些基因的表达。     

彩色棉多药和有毒化合物输出蛋白MATE家族基因的鉴定及表达分析

植物多药和有毒化合物输出家族(multidrug and toxic compound extrusion, MATE)是一类可转运阳离子染料、氨基葡糖、多种抗生素与药物等次生代谢产物的转运蛋白家族。本研究利用生物信息学手段从陆地棉基因组数据库中鉴定了MATE家族基因, 并从基因的系统进化关系、染色体分布、基因结构和表达模式等方面对该基因家族特征进行了比较分析。共鉴定出91个陆地棉MATE基因, 命名为GhMATE1~GhMATE91。陆地棉MATE蛋白与拟南芥MATE蛋白均可分为A、B、C、D、E、F和G 7个亚家族, 其中84个GhMATE蛋白具有12个典型的跨膜结构域。染色体定位显示, GhMATE家族成员定位在不同的25条染色体上, 共形成5个基因簇。qRT-PCR分析发现, GhMATE家族基因在棉花各组织中均有表达, 但表达模式各不相同, 其中GhMATE13和GhMATE23在棕色棉纤维中的表达量明显高于在白色棉中, 表明它们可能与棕色棉纤维的颜色形成相关。本研究为进一步解析棉花MATE家族基因的功能和作用机制积累了有价值的资料。     

中植棉2号抗黄萎病的主基因+多基因遗传特性分析

以感病品种861为父本、抗病品种中植棉2号为母本配制杂交组合,构建6个世代群体(P_1、P_2、F_1、B_1、B_2和F_2),并在田间病圃进行抗病性鉴定,利用主基因￣多基因混合遗传模型的多世代联合分析法研究陆地棉抗黄萎病遗传特性。结果表明,中植棉2号抗性遗传符合E-1遗传模型,即2对加性￣显性￣上位性主基因+加性￣显性多基因遗传模型。2对主基因遗传以显性效应为主,且第2对主基因的显性效应比第1对主基因的显性效应大,多基因遗传以加性效应为主。B_1、B_2和F_2的主基因遗传率分别为68.24%、30.71%和82.09%,多基因遗传率分别为0、24.96%和0,环境方差占总表型方差的17.01%~44.33%。     

新疆野扁桃自交不亲和基因Cullin1的克隆及生物信息学分析

旨在为今后研究新疆野扁桃的分子调控奠定良好基础。通过利用Rt-PCR技术及生物测序等方法,从新疆野扁桃的幼嫩叶片中,克隆得到了一个全新的新疆野扁桃Cullin1基因全长c DNA,命名为Pet Cullin1。并进一步的利用在线软件分析发现:Petcullin1基因全长为2677 bp,其开放阅读框2217 bp,该基因的氨基酸共有738个编码,预测得出Petcullin1蛋白的分子式为C3887H6064N1028O1133S34,原子总数为12096,相对分子质量为85814.61,理论推导出其半衰期为30 h,带正负电荷的残留的总数分别是108和113,不稳定指数和平均疏水指数分别为40.19、-0.452,该蛋白属于水溶性不稳定蛋白。     

棉花冠菌素不敏感因子GhCOI1基因分离和对大丽轮枝菌的抗性分析

为了解决黄萎病对棉花的危害,利用基因工程技术培育抗病棉花品种是当前育种的主要目标。从棉花中克隆了一个黄萎病抗性基因GhCOI1,其编码冠菌素不敏感因子。GhCOI1基因序列全长2 213 bp,编码一个600氨基酸的多肽,分子量为68 k Da,等电点p I是7.06。GhCOI1含有典型的F-box和LRR结构域。组织表达分析表明,该基因在根器官优势表达,并且其表达受到大丽轮枝菌浸染诱导。利用病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术,抑制了GhCOI1基因在棉花植株中的表达;通过大丽轮枝菌接菌分析表明,GhCOI1基因沉默能够引起植株的抗性下降,发病加重。研究结果表明GhCOI1参与棉花对大丽轮枝菌抗性调控,因此,其可以作为棉花抗病育种的候选基因。     

陆地棉开花相关基因GhFLP1的克隆与功能验证

为了明确陆地棉开花促进因子基因的作用,以中棉所36叶片基因组DNA和cDNA为材料克隆得到了开花相关基因Gh FLP1,分析了其特征及功能。该基因全长为537 bp,包含339 bp开放阅读框,编码112个氨基酸。预测分子量约为12.176 kDa,理论等电点为9.13。组织特异性表达分析表明,该基因在花蕾中优势表达,且在早熟品种(中棉所36、中棉所74)中表达量高于中熟品种(中棉所60、鲁棉研28)。启动子序列分析和外源激素处理实验表明该基因受水杨酸和赤霉素调控。农杆菌介导转化拟南芥发现,该基因能促使拟南芥莲座叶减少,开花期提前。荧光定量结果表明,在转基因拟南芥中,内源开花相关基因AtFT、AtLFY、AtAP1和AtSOC1表达量不同程度上调,AtFUL表达量基本不变,AtFLC表达量下调。研究结果显示该基因可能参与陆地棉开花时间的调控,为创制转基因早熟棉花新材料打下基础。     

棉花抗黄萎病相关基因的序列和表达分析

黄萎病是棉花生产的主要病害,克隆抗病基因是培育棉花抗黄萎病品种的关键。本文根据前期的定位结果,结合棉花基因组测序信息,提取定位区段内基因组序列,预测获得63个基因。Gene Ontology分析表明63个基因参加多种生物进程,其中6个基因参与植物抗逆进程。根据Gene Ontology分析和前人研究结果,选择15个基因进行序列分析。启动子序列分析表明启动子区域包含各种抗逆的调控元件,其中6个基因包含了W-box元件。对海7124和苏棉8号棉花幼苗进行黄萎病菌处理,取病菌处理后不同时期的根,选择14个基因进行表达分析,结果表明在黄萎病菌处理后,有8个基因表达出现变化,其中在海7124和苏棉8号之间表达差异最大的基因是跨膜蛋白(Transmembrane protein 214-a isoform 1)、细胞色素P450(Cytochrome p450)和Udp-糖基转移酶UGT89A2(Udp-glycosyl transferase 89a2-like)基因。本研究为抗病基因克隆提供了候选基因。     

陆地棉油菜素内酯信号基因GhBES1家族的鉴定及表达分析

BES1基因是植物激素油菜素内酯信号转导过程中的重要转录因子,为了解陆地棉油菜素内酯信号基因Gh BESI家族,通过对陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库的全面分析和鉴定,获得21个GhBES1基因,这些基因分布在不同的亚基因组,有9对基因在A亚组和D亚组上存在对应关系,AD亚组对应基因序列一致性高于95%。根据进化分析,21个GhBES1基因分为4个亚家族,除了亚家族Ⅲ,其他3个亚家族在拟南芥中均有对应基因;除了亚家族Ⅳ基因和亚家族Ⅱ中GhBES1-1基因外,其他GhBES1基因均有2个外显子。亚细胞定位结果表明,21个GhBES1蛋白主要定位到细胞核、细胞质等部位,其中7对基因的蛋白亚细胞定位完全一致。GhBES1基因在根、茎、叶、顶端分生组织中均有表达,但不同亚家族基因在不同组织中的表达水平存在差异。研究结果为棉花GhBES1基因家族功能的深入研究奠定了基础。     

陆地棉GhDAHP基因的克隆与表达分析

棉花黄萎病是制约棉花产业健康发展的一种重要病害,在生产上未发现有效的根治办法,使用现代基因工程技术,从基因库中挖掘抗黄萎病相关基因,为棉花抗黄萎病育种工作的提供理论基础。本研究根据在GenBank中检索到抗黄萎病基因SDAHP(GU479467,1,3-脱氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶),从陆地棉基因组数据库中检索到3个同源基因(NM_016893351.1,XM_016849738.1和XM_0168151150.1),根据3个同源基因核苷酸序列设计引物,以陆地棉cDNA为模板进行克隆,获得3个目的基因,依次命名为GhDAHP-1、GhDAHP-2和GhDAHP-3。利用ProtParam和Prot Scale等在线软件对目的基因进行生物信息学分析;RT-PCR分析黄萎病菌诱导后目的基因在陆地棉叶片中的表达量。结果表明:GhDAHP-1序列全长1983 bp,氨基酸总数为539,分子质量约59.45378 kD,理论等电点pI为8.7;GhDAHP-2序列全长1832 bp,氨基酸总数516,分子质量约57.02998 kD,理论等电点pI为7.68;GhDAHP-3序列全长1652 bp,氨基酸总数517,分子质量约56.95491 kD,理论等电点pI为8.52。系统进化树分析,GhDAHP与雷蒙德氏棉(Gossypium raimindii)、木本棉(Gossypium arboreum)的亲缘关系最近。棉花叶片在黄萎病菌的处理下,GhDAHP基因表达量呈现先升高后降低的趋势,推测受到黄萎病诱导后,GhDAHP基因可能参与了黄萎病菌侵染的防卫过程。     

绿色棉苯丙氨酸解氨酶基因GhPAL1的克隆和实时定量表达分析

本研究以拟南芥(Arabidopsis thaliana)苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因cDNA序列(AAC18870.1)为探针,在GenBank中与棉花EST进行tBLASTn比对,将同源性高的EST序列拼接后获得一条棉花PAL全长cDNA基因序列,以此序列为模板设计引物,通过RT-PCR扩增从绿色棉纤维分离出了一个绿色棉PAL基因全长cDNA序列,将该基因命名为GhPAL1(GenBank登录号:JN032297)。序列分析表明,该cDNA全长2347bp,含有一个编码721个氨基酸的开放阅读框。实时荧光定量PCR分析发现:该基因在绿色棉纤维中的表达模式与白色棉纤维相似,但两者在同一时期的表达量差异显著,其在花后6d绿色棉纤维细胞中的表达量是同期白色棉的6倍以上,从该基因的表达特征推测GhPAL1基因可能在绿色棉纤维色素合成过程中发挥重要作用。