流式细胞仪快速检测鸭茅与多花黑麦草染色体倍性的研究

以鸭茅（Dactylis glomerata）和多花黑麦草（Lolium multiflorum）不同倍性的种质为材料,对流式细胞仪测定牧草多倍体的技术方法和结果进行评价,旨在利用流式细胞仪技术快速确定供试牧草的染色体倍性。采用根尖染色体计数法确定鸭茅‘北绿’品种和多花黑麦草‘Mammoth B’品种为四倍体,以这两个品种的相对核DNA含量和核内DNA复制的平均周期值作为参照,经流式细胞仪检测表明,鸭茅‘早生绿’品种和PI316209种质材料为四倍体,种质PI237602和PI368880为二倍体,PI316209种质的倍性与种质背景信息所提供的倍性存在差异;多花黑麦草‘Musashi’品种为四倍体,‘Tachimasari’和‘Wasehope Ⅲ’两个品种为二倍体。研究结果为流式细胞仪如何在同一物种范围内检测不同倍性样品提供了依据。     

利用流式细胞仪鉴定鸭茅倍性

鸭茅为世界重要禾本科牧草之一,多为四倍体或二倍体。快速鉴定其倍性可为鸭茅遗传背景研究及多倍体材料的创制提供技术支撑,加快育种进度。采用流式细胞术,筛选4种细胞核DNA解离液,对比2种流式细胞仪检测方法,最终建立鸭茅倍性鉴定高效技术体系。结果表明,不同解离液处理后的细胞核DNA含量存在一定差异。利用Otto制备鸭茅细胞核悬浮液效果较理想,峰型完整,碎片峰较少且样本峰信号清晰,其荧光变异系数为5%左右。内外标法检测各有优势,外标法检测更快速更简便,而内标法准确性更高。在以外标检测为主的基础上,共在46份鸭茅材料中鉴定出二倍体鸭茅22份,四倍体鸭茅24份,为鸭茅遗传育种提供材料。     

利用流式细胞仪鉴定9个居群蒙古冰草的染色体倍性

利用3种分离液制备了乌拉尔图小麦细胞核悬浮液,其中Otto缓冲液制备效果最好。选用该分离液制备了9个居群蒙古冰草的单细胞悬浮液,在显微镜下统计细胞数,并利用流式细胞仪检测其染色体倍性,用二倍体乌拉尔图小麦作为对照。结果发现,流式细胞仪检测结果与传统的染色体制片法的结果一致,均为二倍体。     

利用流式细胞术鉴定桑树染色体倍性的方法

利用流式细胞术可以快速、准确地鉴定植物染色体倍性,但需要针对不同植物样本的制备及具体操作对应用方法进行选择和优化。为了建立适合桑树染色体倍性快速鉴定的流式细胞术应用方法,以桑树幼叶为材料,比较以不同解离液及机械解离方法和不同离心漂洗次数制作样本用流式细胞术检测的效果,并用不同染色体倍性桑品种的幼叶为材料,以效果最佳的方法进行验证试验。优化的样本制备方案为:采集0.2 g桑树幼叶,置于预冷的平面玻璃上,加入Mg SO4解离液后,用双面刀片快速切碎,转移至培养皿中静置3~5 min,用300目细胞筛网过滤至1.5 m L离心管中,得到500μL单细胞核悬浮液,再加入PI溶液(最终质量浓度为50μg/m L)和RNase A溶液(最终质量浓度为30μg/m L),4℃避光环境下染色30 min,经300目细胞筛网过滤后用流式细胞仪检测。如果采集叶片后不能立即进行检测,可在-80℃下保存待测。试验结果还表明,用在-80℃保存10 d和40 d的冷冻幼叶与用新鲜幼叶制备的样本所得到的检测效果相似。初步建立的适合桑树染色体倍性鉴定的流式细胞术应用方法效果最佳,具有细胞碎片少、主峰清晰、杂峰少等优点。     

流式细胞术鉴定黄花苜蓿染色体倍性水平

采用流式细胞术检测47份黄花苜蓿种质材料的染色体倍性水平,同时结合传统的根尖染色体制片法进行验证.结果表明,47份黄花苜蓿种质材料中45份为四倍体(2n=4x=32),核DNA含量为1.85±0.09 pg/2c;2份为二倍体(2n=2x=16),核DNA含量为1.016±0.021 pg/2c.研究结果为黄花苜蓿遗传育种、种质资源的合理利用及苜蓿属的系统进化研究提供了理论依据.     

应用流式细胞技术鉴定桑树倍性的样品选择

利用流式细胞仪对桑树不同叶位的叶片、同一叶位的不同部位、叶芽和种子胚根等进行倍性测定,筛选合适的桑树倍性鉴定材料。结果表明,未完全展开幼叶的检测效果优于第1叶位叶和第2叶位叶,第1叶位叶的检测效果优于第2叶位叶;同一叶位幼叶叶基部分的检测效果优于叶尾部分;叶芽的检测效果最好,而且制备样品的杂质较少,是用于流式细胞术研究的最佳材料。胚根也可以作为流式细胞仪检测的材料,这为更早检测桑树的倍性提供了候选材料。研究结果为选取不同时间段的不同材料进行桑树倍性检测提供了依据,也为其他植物倍性鉴定取材提供了参考。     

新疆野生无芒雀麦染色体倍性的研究

新疆各地区无芒雀麦种质资源丰富,为选择理想倍性育种材料,本研究以18份无芒雀麦为供试材料,用醋酸洋红染色法统计奇台野生无芒雀麦BL-01根尖染色体数目为28条,依据染色体组基数是7,确定其为四倍体(2n=4x=28)。运用流式细胞仪以奇台BL-01材料叶片的相对核DNA含量峰值为参照,测定18份供试材料的G1期、S期和G2期及变异系数,计算出各材料的细胞周期值,旨在快速鉴定无芒雀麦不同群体的染色体倍性。研究结果表明,18份无芒雀麦种质材料中有四倍体和八倍体两种倍性,其中四倍体共12份、八倍体共6份,对品种乌苏1号流式细胞仪鉴定结果为八倍体。     

不同倍性鸭茅同功酶比较研究

采用生化遗传学的方法,对我国亚热带地区几个二倍体和四倍体野生鸭茅不同生育期的酯酶,过氧化物酶同功酶进行了比较研究。结果表明,鸭茅二倍体各品系之间,四倍体各品种（系）之间的同源性较高,遗传差异较小,二倍体与四倍体之间,酯酶,过氧经物酶同功酶等都有较大差异。     

利用流式细胞仪检测定性牛精液的分离效果

利用德国生产的ＰＡＲＴＥＣ流式细胞仪，对使用Ｐｅｒｃｏｌｌ不连续密度梯度离心技术分离出的荷期坦牛定性精液进行了定性检测，结果表明原精液中，Ｘ－与Ｙ－精子的比例为１．２６：１，富含Ｙ－精子的精液中Ｘ－与Ｙ－精子的比例为０．７３：１。     

苜蓿花药培养再生植株染色体倍性检测研究

本试验采用流式细胞仪对苜蓿(Medicago sativa L.)F₁代杂种花药培养再生植株进行染色体倍性检测。旨在建立高效的苜蓿花药培养体系,提高苜蓿单倍体的诱导效率,寻求一种快速简便的苜蓿倍性检测方法。检测结果为流式细胞仪矩形图上清晰地检测出二倍体、三倍体、四倍体以及二倍体加四倍体的嵌合体。50株苜蓿花药再生植株中有42株四倍体(2n=4x),2n=4x与2n=2x的混合体为5株,二倍体(2n=2x)为2株,三倍体(2n=3x)为1株。本文还讨论了苜蓿花药培养体系的建立,优化,以及筛选出了适宜制作苜蓿细胞悬浮液的缓冲液(15 mmol·L^-1Tris-HCl(pH7.5);80 mmol·L^-1KCl;20 mmol.L^-1NaCl;2 mmol·L^-1EDTA-Na₂;15 mmol·L^-1β-Mercaptoethanol;0.1%(V/V)TritonX-100;0.5 mmol·L^-1Spermine·4HCl)及其流式细胞仪检测苜蓿倍性的适应性程序。     

鸭茅栽培品种与野生材料遗传多样性比较的SSR分析

为揭示鸭茅栽培品种与野生材料间遗传多样性的差异,本研究利用25对SSR引物对23份鸭茅材料(包括品种、四倍体、二倍体等)进行扩增,获得了251条清晰条带,平均每对引物扩增10.04个条带,多态性比率为100%,多态性信息含量(PIC)的变化范围为0.24(A01E14)～0.42(A01F24,A03B16),平均值为0.33。23份材料的遗传距离变化范围为0.1065～0.6061,平均遗传距离为0.3870,6个栽培品种的平均遗传距离为0.3088,低于所有材料遗传距离的平均水平。聚类分析将相似地理来源、相同倍性和品种分别聚类,主成分分析与聚类分析结果一致。AMOVA分析结果表明,类群内的遗传变异大于类群间的遗传变异;不同类群的遗传多样性比较表明,野生材料类群与栽培品种类群遗传多样性差异不明显,而四倍体类群较二倍体类群具有更丰富的遗传多样性。     

中国主要鸭茅品种农艺性状变异研究

鸭茅系世界著名多年生冷季型优质牧草,在我国草地畜牧业发展和生态建设中起着重要作用。为系统地探明我国鸭茅品种(系)在表型水平上的多态性及变异规律,本研究对我国鸭茅8个品种和1个新品系单株的物候期、抗锈病能力、越夏率、生长速度、鲜干草产量、鲜干草茎叶比、鲜干比、分蘖数、植物学表型性状及DUS性状进行了系统研究,结果表明,1)各鸭茅品种(系)生育期、抗锈病能力、越夏率、生长速度、生产性能差异明显,以‘02-116’新品系表现较为突出;2)供试12个表型性状在品种(系)间差异均达到极显著(P＜0.01)水平,变异系数变幅为21.64%(倒二叶长度)～106.20%(穗叶距),穗叶距、株高、茎上部节间长度、倒二叶宽度、株幅等性状与鸭茅产量显著相关;3)主成分分析表明前4个主成分因子累计贡献率达68.225%,鸭茅植株株型的形成和生长速度的动态变化,在很大程度上由叶片长度、叶片宽度、株高、穗叶距等共同决定;4)各品种(系)在7个供试DUS性状上均表现出不同程度的群体差异;5)品系‘02-116’与品种‘川东’、‘古蔺’等在主要形态上存在一定差异。     

鸭茅杂交种的SSR分子标记鉴定及其遗传变异分析

以140个鸭茅杂交种单株及其亲本(01996、YA02-103)为材料,用SSR分子标记技术研究杂种与其亲本间扩增谱带的多态性,以甄别真假杂种。SSR标记在供试材料中的扩增带型表现为互补型、父本型及其他型。利用3对特异引物A01G20、A03N16、A03K22可快速准确地鉴定出杂交种111份。试验所用的100对SSR引物中有13对引物分别在杂种和双亲之间存在扩增多态性。13对引物在供试材料中共扩增出多态性条带76条,平均每对引物扩增出6条,多态性百分率为84.24%。供试材料具有丰富的遗传变异,利用SSR进行鸭茅杂种鉴定及遗传变异分析是可行的。     

国外引进鸭茅种质形态变异研究

鸭茅(Dactylis glomerata L.)是在世界范围内广泛栽培种植的一种重要禾本科牧草,具有高产、优质、抗逆性较强等特点。以84份国外引进鸭茅种质为研究对象,对其11个形态学性状进行研究分析,旨在为筛选优良鸭茅种质提供依据。结果表明:不同种质鸭茅的植物形态学特征存在广泛变异,其中以小穗数变异最大,小花数、茎粗次之,而叶宽变异最小。变异系数与主成分分析结果显示,小穗数、小花数、株高和内稃长4个性状是造成鸭茅表型差异的主要因素。以11个形态性状为基础的聚类分析可将所研究的84份材料分为3类,每一类都由不同地域来源的鸭茅构成,表明鸭茅种质资源的多样性由品种间基因型不同所致。     

喜马拉雅鸭茅野生二倍体与同源四倍体农艺性状的对比研究

本研究对供试的喜马拉雅野生二倍体鸭茅及其同源四倍体鸭茅进行单株和条播种植,旨在获得不同倍性水平鸭茅农艺性状特性。结果表明,喜马拉雅野生二倍体具有营养生长期比同源四倍体长,后期生长迅速,生育期比同源四倍体长的特点;同源四倍体各构件中的叶量(P<0.01)和单株产量(P<0.05)明显地高于同期喜马拉雅野生二倍体鸭茅。随着倍性的增加,增加了分蘖数、生殖枝数和千粒重,但是生殖枝所占的比重、穗量、种子数、发芽势和发芽率均降低,导致同源四倍体的育性不及喜马拉雅野生二倍体鸭茅。在干物质产量方面,同源四倍体每次刈割的产量和年干物质产量比喜马拉雅野生二倍体鸭茅分别提高20.3%~72.8%和18.3%~41.5%,枯草比例下降23.9%。从供草的均衡分析,同源四倍体供草均衡性优于喜马拉雅野生二倍体。在饲草营养价值方面,不论野生二倍体还是同源四倍体,随着成熟度的增加,粗蛋白、粗脂肪、灰分、钙含量、磷含量和半纤维素含量明显下降,中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性木质素增加,而且随着倍性水平增加,同期生长不同倍性鸭茅的各营养成分增减不一,尤以完熟期的鸭茅随倍性水平的增加,钙含量明显地增加。     

放牧对鸭茅能量积累及分配的影响

通过长期放牧试验，探讨了不同放牧强度下亚热带高山草地鸭茅种群能量积累规律及能量在不同构件之间的分配特征。在无放牧的对照草地及采食率分别为55％、65％、80％的放牧草地，鸭茅热值随放牧强度的增加而呈单峰曲线型变化，一定强度范围内的放牧干扰提高了鸭茅热值及能量的积累；根部能量的积累随放牧强度的提高而逐渐减少。在禁牧草地，鸭茅种群能量主要被低密度的大分蘖丛所分摊，随着放牧强度的提高，种群能量则逐渐均摊给高密度的小分蘖丛。     

鸭茅重要种质DUS测试及农艺性状评价筛选

以我国主栽的32个鸭茅品种(系)为研究对象,对其开展了DUS测试,并基于农艺性状进行了综合评价筛选,以期筛选出适合我国南方及长江流域地区生长的优质鸭茅种质资源。结果表明:供试鸭茅品种(系)可根据其物候期的差异,主要分为早、中、晚熟3种类型,生育期介于230~307d。各供试鸭茅品种(系)在抗锈病、越夏率、生长速度、草产量、茎叶比、鲜干比、分蘖数等均差异明显,呈现出不同程度的群体差异,以‘滇北’、‘01472’、‘Cristobal’、‘宝兴’、‘波特’等表现较为突出。供试14个DUS性状在各鸭茅间表达程度各不相同,可用于区分供试鸭茅品种(系),并得出关于鸭茅产量、抗性及品质的供试种质综合排序,最终筛选出17份表现较为优异的鸭茅资源。     

野生鸭茅植物学形态特征变异研究

对25份野生鸭茅种源进行植物学特征变异性研究,结果表明:1)不同种源鸭茅的植物形态学特征存在广泛变异。其中,种子千粒重变异最大;旗叶长度、花序形状次之;穗叶距、花药宽度、旗叶宽度等性状变异中等;而花序长度、株型、叶宽、种子长度变异最小。2)鸭茅植物形态学特征间存在明显相关性,花序直立、紧缩的鸭茅,叶片窄长,茎秆粗壮,旗叶较长,雄性生殖器官发育良好,结种性能强;而花序下垂、开展的鸭茅则与之相反。3)聚类分析表明,不同野生鸭茅种源可划分为3类,其中花序下垂种源聚于一类;而花序直立的种源分居另两类。4)从形态学特征及相关农艺性状分析,花序直立的鸭茅更具开发利用潜力。     

中国野生鸭茅遗传多样性的ISSR研究

以宝兴鸭茅和国外安巴鸭茅品种为对照,用ISSR分子标记技术对四川、重庆、云南、贵州、新疆等地的32份野生鸭茅材料进行遗传多样性研究。试验筛选出引物12个,共扩增出多态性带88条,平均每个引物扩增的多态带数为7.3条,多态性条带比率(PPB)为83.18%,材料间遗传相似系数为0.692 0~0.926 0。这说明我国鸭茅具有较丰富的遗传多样性。根据研究结果进行了聚类分析和主成分分析,可将32份中国野生鸭茅材料分为五大类,同一地区的鸭茅品种(系)基本聚在同一类,呈现出一定的地域性分布规律。并对我国鸭茅种质资源的收集保存提出建议。