减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344株asd平衡致死系统的构建及其特性

为构建能稳定携带外源基因的减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344,本研究在减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344基础上,以χ7213（pREΔasd）为供体菌,ΔcrpΔcyaSL1344为受体菌,利用自杀性质粒介导的等位交换技术成功筛选出缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶基因（aspartic semialdehyde dehydrogenase,asd）的ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株,进一步对其生物学特性进行初步研究。结果显示,其血清型和亲本株ΔcrpΔcyaSL1344及强毒株SL1344相同且该缺失菌株能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344相比有很大差异,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344基本一致,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度比强毒株更加缓慢。1日龄雏鸡攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasdSL1344互补携带asd基因的pYA3493质粒后,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344（pYA3493）毒力较强毒株SL1344降低了至少105倍,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344相比毒力仅相差10倍。结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株构建成功,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株AcrpAasd缺失株的构建及生物学特性初步研究

构建鼠伤寒沙门菌SL1344△cr户△nsd双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以Y7213（pREAasd）为供体菌,SL1344Acrp为受体菌进行结合转移,通过自杀性质粒介导的等位交换技术两步法筛选sI,1344的AcrpAasd双缺失株。该缺失株在有外源DAP的存在下能够正常生长,且能稳定遗传缺失的“sd基因;其血清型与亲本株SL1344Acrp及强毒株SL1344保持一致;其生化特性与亲本株基本相同,但与强毒株相比变化较明显,且生长速度明显减慢;雏鸡毒力试验结果表明其毒力较SL1344降低约10j倍。鼠伤寒沙门菌SL1344AcrpzSasd缺失株构建成功,为进一步开发以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。     

5株鼠伤寒沙门菌基因缺失株的生物学特性比较

为了探讨crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株成为鼠伤寒沙门菌减毒候选活疫苗的可能性,对缺失株的生物学特性进行研究。结果显示,缺失株的血清型仍和亲本菌株相同,其中crp、cya、crp/cya、crp/sipB与亲本菌株相比失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力。通过口服方式把5株crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株接种KM小鼠进行毒力测定和免疫保护性测定,结果它们的半数致死量比野生株的至少高700倍,双基因缺失株的毒力更弱,攻毒后crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株的免疫保护率分别为90.0%,60.0%,50.0%,60.0%,60.0%。结果表明,crp基因缺失株可作为鼠伤寒沙门菌减毒活疫苗的候选株。     

鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株的构建及生物学特性分析

利用λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株,并检测其生长特性、运动性、生物被膜形成能力、胞内存活能力及LD₅₀毒力。结果显示,与野生型菌株相比,oppCDF基因缺失株的生长特性无明显变化;oppCDF基因缺失株可降低鼠伤寒沙门菌的运动性;oppC与oppF基因缺失后可提高鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力;同时,oppC基因缺失可降低在RAW267.4细胞内的存活能力和其在小鼠体内的毒力,oppF基因缺失可显著增强在RAW267.4内的存活能力和对小鼠毒力的影响,而oppD基因缺失后其在小鼠体内的毒力和RAW267.4内的存活率均无显著变化。研究表明,oppCDF基因与鼠伤寒沙门菌的运动性、生物被膜形成和毒力密切相关,为进一步揭示鼠伤寒沙门菌致病作用中的复杂调控和机制提供了理论基础。     

鹅源鼠伤寒沙门菌crp、hfq基因缺失株的构建及生物学特性分析

为构建鹅鼠伤寒沙门菌单基因缺失株并鉴定其生物学特性,本研究以广东地区鹅源鼠伤寒沙门菌流行株A29为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,分别构建crp、hfq基因缺失株(A29Δcrp和A29Δhfq)及相应基因回补株,并分别采用相应引物经PCR鉴定。通过细菌培养,对各菌株生物学特性进行比较;通过PCR鉴定各菌株的遗传稳定性;采用K-B纸片扩散法检测各菌株的药物敏感性;将各菌株纯培养物经腹腔注射4周龄小鼠,测定各菌株对小鼠的毒力,并观察感染后小鼠的临床症状及各组织剖检病变与组织病理变化。PCR和测序结果表明,正确构建各基因缺失株和相应回补株。生物学特性试验结果显示,与亲本株相比,A29Δcrp菌落直径极显著变小(P<0.001),不产酸、不产生H₂S,菌体极显著变短(P<0.001);A29Δhfq菌落边缘不整齐,不产生H₂S,菌体极显著变长(P<0.001),表明crp、hfq基因影响细菌的菌落形态、生化特性和形态特征。菌株遗传稳定试验结果显示,菌株传至60代时,基因缺失株仍能够稳定缺失。药敏试验结果显示,与亲本株比较,A...     

鼠伤寒沙门菌T3SS相关基因缺失株的生物学特性分析

为探究沙门菌Ⅲ型分泌系统(STM T3SS)相关基因缺失株的部分生物学特性及致病力,本试验利用λ-Red同源重组技术构建T3SS相关基因缺失株LT2 ΔprgI::scar、LT2 ΔprgJ::scar、LT2 ΔprgH::scar、LT2 ΔprgK::scar、LT2 ΔinvG::scar、LT2 ΔinvC::scar和LT2 ΔspaP::scar,以鼠伤寒沙门菌野生型(STM LT2)作为对照,通过生长曲线测定、遗传稳定性试验、生物被膜形成能力检测、细菌定植试验、细菌泳动性测定和动物致病性试验分析两者间的区别,结果显示：T3SS相关基因缺失株生长性变化不大,能够稳定遗传,但其定植能力、运动能力有不同程度的减弱;对于缺失株LT2 ΔinvC::scar、LT2 ΔprgH::scar、LT2 ΔprgJ::scar和LT2 ΔprgK::scar的成膜能力虽有小幅降低,但仍有较强的成膜能力,其余菌株在缺失后,成膜能力显著降低;LD50测定结果显示,相对于STM LT2,缺失株半数致死量LD₅₀数值均出现上升趋势,分别上升了2.57、4.07、406....     

鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因缺失株平衡致死系统的构建及生物学特性分析

本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd~+的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493)构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸(DAP)阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430(pYA-gfp),对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493),能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。     

STM1863分子特征分析及其基因缺失对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响

为揭示鼠伤寒沙门菌SL-1344菌株RcsCDB系统STM1863调控子分子特征,及对STM生物学特性的影响。本研究通过PCR扩增STM1863基因并进行克隆和测序,预测分析其编码蛋白的分子特征;利用λ-Red同源重组技术构建STM-ΔSTM1863基因缺失突变株,并对其生化特性、遗传稳定性、酸碱胁迫环境中的适应性及粘附侵袭小鼠巨噬细胞的能力进行研究。结果显示：STM1863基因全长159 bp,编码52个氨基酸,具有一个跨膜和d1p32a同系物结构域;与SL-1344亲本株相比,STM-ΔSTM1863缺失株生化特性与亲本株无明显差异,生长速度与亲本株生长速度一致,但STM-ΔSTM1863在p H4.0酸应激下对数期生长速度显著低于亲本株（P<0.05）;粘附和侵袭小鼠巨噬细胞能力与亲本株相比极显著降低（P<0.01）。提示STM1863因参与了STM酸应激和粘附侵袭宿主细胞的调控,本研究为深入揭示STM1863对STM粘附侵袭宿主细胞的调控机制提供了参考。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性

通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12：i：1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。     

鼠伤寒沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定与生物学特性

旨在分离鼠伤寒沙门菌烈性噬菌体,为控制该病原菌感染或污染提供生物制剂.以1株从市售散装牛奶中分离到的多重耐药性鼠伤寒沙门菌为宿主菌,采用人工诱导方法,连续1周每日给3只试验鸡饲喂宿主菌悬液,7 d后,采用双层琼脂平板法从试验鸡粪便中分离培养噬菌体,并对其效价、核酸类型、宿主谱、热稳定性与酸碱耐受性以及对鼠伤寒沙门菌感染...     

鼠伤寒沙门菌毒力基因SptP的原核表达及生物信息学分析

【目的】试验旨在获得高效表达的鼠伤寒沙门菌SptP蛋白并进行生物信息学分析,为其功能研究和互作蛋白的筛选提供理论依据。【方法】通过PCR技术扩增SptP基因,并将该序列连接至pET-32a （+）载体,构建鼠伤寒沙门菌SptP基因原核表达载体pET32a-SptP。通过热激法将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导表达、纯化重组蛋白,并经过SDS-PAGE和Western blotting验证;应用在线软件对SptP蛋白进行生物信息学分析。【结果】PCR成功扩增出大小为1 632 bp的SptP基因。SptP重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功诱导表达、纯化,得到分子质量为79.7 ku的蛋白。SptP蛋白分子式为C₂₆₂₅H₄₂₅₇N₇₄₅O₈₁₂S₂₅,分子质量为60 047.68 u,无跨膜结构,无信号肽存在,理论等电点为8.75,有57个潜在的磷酸化位点,主要定位于细胞核、细胞质、高尔基体、细胞骨架、分泌系统的囊泡、质膜,占比分别为43.5%、34.8%、8.7%、4.3%、4.3%和4.3%。SptP蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角及无规则卷曲组成,占比分别为43.65%、14.92%、4.42%和37.02%。【结论】本研究构建了表达SptP蛋白的重组质粒pET32a-SptP,获得分子质量为79.7 ku的SptP重组蛋白,阐明了SptP蛋白的基本理化性质和生物学功能,为后续SptP蛋白与宿主细胞互作的作用机制及鼠伤寒沙门菌新疫苗的制备提供理论基础和试验依据。     

鼠伤寒沙门菌cya基因的克隆表达及生物信息学分析

研究旨在克隆鼠伤寒沙门菌cya基因并对其进行生物信息学分析。以鼠伤寒沙门菌SL1344株为模板PCR扩增并克隆了鼠伤寒沙门菌cya基因,构建原核表达质粒pET-32a-cya,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用1 mmol/L IPTG对其进行诱导表达、纯化,同时利用相关的生物信息学软件对其进行生物信息学分析。结果显示,鼠伤寒沙门菌cya基因大小为1 185 bp。经SDS-PAGE和Western blotting分析显示,在原核表达系统中主要以包涵体形式存在,蛋白分子质量大小约为58 ku。生物信息学分析表明,Cya蛋白由394个氨基酸组成,理论分子质量为44.97 ku,分子式为C₂₀₂₆H₃₁₄₆N₅₆₂O₅₇₈S₁₁,等电点（pI）为7.01,其中带负电荷残基总数（Asp+Glu）43个,带正电荷残基总数（Arg+Lys）42个。Cya蛋白无信号肽与跨膜区,为膜内蛋白,含有4个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、27个磷酸化位点、13个线性B细胞结合位点、11个T细胞结合位点。二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲所占比例分别为38.07%、19.80%、5.58%和36.55%。本试验结果为进一步研究鼠伤寒沙门菌Cya蛋白的功能及建立以Cya蛋白为抗原的免疫鉴别检测方法奠定了基础。     

禽致病性大肠杆菌clpV2基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究六型分泌系统2（type VI secretion system 2,T6SS2）clpV2基因对禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli,APEC） TW-XM菌株生物学特性的影响。本研究利用Red同源重组构建clpV2基因缺失株,将clpV2基因克隆到表达载体pBR322中,成功构建回补株。对突变株的部分生物学特性进行分析。结果显示：各突变株均能稳定遗传,且clpV2基因的缺失不影响TW-XM菌株的生长速度以及对多种抗生素的敏感性,但会导致其运动能力和生物被膜形成能力显著下降。综上表明,clpV2基因的缺失会影响TW-XM菌株的部分生物学特性,为进一步研究clpV2基因的功能和APEC的致病机制奠定基础。     

禽源肠炎沙门菌aroA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

试验旨在研究aroA基因对肠炎沙门菌生物学特性及毒力的影响。利用λ-Red同源重组技术,将从田间分离的禽源肠炎沙门菌的aroA基因进行敲除,经连续传代检测缺失株遗传稳定性,并通过细菌生长曲线、对不同生化反应管的利用情况、生物膜形成能力、对环境应激的抵抗能力及对1日龄雏鸡的毒力比较野生株和基因缺失株之间的差异。结果显示,试验成功构建缺失株,连续传30代未发现目的基因回复突变;在相同培养条件下,缺失株与野生株在相同时间进入对数生长期和稳定期,但缺失株生长速率低于亲本株;缺失株较野生株生化特性未发生改变;缺失株的生物膜形成能力及对酸、碱、高渗和热应激的抵抗能力均显著低于野生株（P<0.05）;1日龄雏鸡分别滴口接种缺失株和野生株,观察14 d,野生株组鸡全部死亡,而缺失株组无死亡。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的肠炎沙门菌aroA基因缺失株,缺失株生化特性和体外生长趋势未发生明显改变,但生物膜形成能力、对环境应激抵抗能力及毒力均明显下降。本研究为进一步研究肠炎沙门菌aroA基因缺失株的免疫原性奠定了基础。     

布鲁氏菌vceA基因缺失株的构建及生物学特性研究

试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。     

Evaluation of immunogenicity and protective efficacy of adjuvanted Salmonella Typhimurium ghost vaccine against salmonellosis in chickens

Background: Salmonella Typhimurium, a non-host-adapted Gram-negative intracellular pathogen, is capable of infecting a variety of animal hosts and humans.

Objective: This study utilized the prime-booster immunization strategy using Salmonella Typhimurium–LTB (S. Typhimurium–LTB) ghost with the aim of inducing a robust immune response for the prevention of avian salmonellosis. In addition, the effect of Montanide^TM ISA 70VG adjuvant on S. Typhimurium–LTB ghost vaccination was investigated.

Animals and methods: A total of 75 chickens were divided into three groups (n=25) for intramuscular immunization: group A (non-immunized control injected with sterile PBS), group B (immunized with S. Typhimurium–LTB ghost), and group C (immunized with S. Typhimurium–LTB ghost plus Montanide^TM ISA70VG adjuvant).

Results: Compared with group A, the immunized chickens (groups B and C) exhibited increased titers of antigen specific plasma IgG and intestinal secretory IgA antibodies. In addition, group C showed enhanced induction of the humoral immune response compared to group B. The populations of splenic CD3+CD4+ and CD3+CD8+ T-cells increased significantly in both immunized groups. In addition, increased mRNA expression of the Th1 cytokines, IFN-γ, and IL-2 were observed in S. Typhimurium antigen-stimulated peripheral blood mononuclear cells from groups B and C chickens. Chickens from both vaccinated groups showed significant protection against virulent S. Typhimurium oral challenge compared to non-vaccinated chickens and a lower challenge strain count was recovered from the internal organs of group C.

Conclusions: Injection of S. Typhimurium-LTB ghost with or without Montanide^TM ISA70VG adjuvant is capable of inducing protective immunity against the virulent S. Typhimurium infection in chickens.     

Construction and Partial Biological Characteristics Analysis of Listeriolysin S llsB Gene Deletion Strain

In order to analyze the effect of listeriolysin S (LLS) llsB gene deletion on the biological characteristics of Listeria monocytogenes (LM),this study used homologous recombination to construct the llsB gene deletion strain LM90-ΔllsB,and the biological characteristics of growth characteristics,median lethal dose (LD₅₀) and organ-borne bacteria were studied in healthy Kunming male mice at 8 weeks old and weighing 40 g±5 g.The llsB gene deletion strain was successfully constructed,and the deletion strain had good genetic stability through continuous passage to 20 generations in vitro.Based on its growth curve examination,we found that the growth rate of the mutant strain was slightly higher than that of the parent strain.The results of mice infection test showed that the LD₅₀ of the parent strain and the deletion strain were 10^6.17 and 10^6.50 CFU,respectively.Compared with the parent strain,the amount of bacteria load of the deletion strain in the liver and spleen of the mice was extremely significantly decreased (P<0.01),the results showed that the infection ability of the mutant strain on mice was obviously weakened.No Listeria monocytogenes was detected in the brain.The results suggested that llsB gene might have direct or indirect regulatory effect on some biological characteristics of LM90,and it would provide a theoretical basis for further understanding of the pathogenic mechanism of LLS,prevention and control of listeriosis.