牛IRX3基因启动子转录调控分析

旨在探究牛IRX3基因组织表达规律,并鉴定其启动子区关键转录因子,以期阐明其转录调控机制。本研究采集3头成年公牛心、肝、脾、肺、肾、皮下脂肪、背最长肌、大肠、小肠、网胃、瘤胃、皱胃及睾丸组织,利用荧光定量PCR检测IRX3基因在不同组织中相对表达量。同时克隆牛IRX3基因1.8 kb启动子区序列并构建其启动子6个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,分别转染3T3-L1和C2C12细胞系。进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,借助定点突变及siRNA干扰技术在3T3-L1细胞系内初步鉴定关键转录因子对IRX3基因的转录调控作用。结果表明,IRX3基因在牛13个不同组织中均有表达,且在肺、肾、心、皮下脂肪、背最长肌中高表达(P0.05)。利用双荧光素酶报告载体检测到牛IRX3基因核心区域在-372/-42 bp。结合定点突变及siRNA干扰技术初步鉴定NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1转录因子对IRX3基因的转录活性有重要的调控作用。综上表明,牛IRX3基因在背最长肌和脂肪组织中表达量相对较高,其启动子1.8 kb区有8个CpG岛,核心区关键转录因子NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1位于CpG岛内且调控IRX3基因转录活性。本研究结果为探究IRX3基因在牛脂肪沉积过程中的分子调控机制奠定了重要理论基础。     

秦川牛PLAG1基因启动子克隆及转录因子预测

【目的】探究秦川牛多形性腺瘤基因1(pleomorphic adenoma gene 1,PLAG1)的组织表达规律,并克隆其启动子区序列,预测分析其关键转录因子结合位点,为探究其转录调控机制提供理论参考。【方法】采集3头20月龄秦川牛成年公牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪、背最长肌、瘤胃组织,用实时荧光定量PCR方法检测PLAG1基因在不同组织中的相对表达量,同时克隆PLAG1基因上游启动子区序列,利用生物信息学软件预测PLAG1基因转录起始位点及启动子核心区域,分析、筛选核心启动子区域的关键转录因子结合位点。【结果】PLAG1基因在秦川牛各组织中均有表达,且在背最长肌中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。PLAG1基因启动子序列全长1 861 bp,生物信息学预测分析发现PLAG1基因核心启动子区位于-297―+42 bp,存在高度保守的Krüppel样因子5(KLF5)、cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)和早期生长反应因子1(EGR1)转录因子结合位点,且CpG岛位于PLAG1基因核心启动子区域内。【结论】PLAG1基因在肌肉组织中高表达,其核心启动子区...     

牛CART基因核心启动子鉴定及转录调控分析

旨在筛选牛CART基因核心启动子区并鉴定调控CART表达的转录因子,探究其转录调控机制。本研究采集3头健康母牛下丘脑组织,提取基因组DNA,通过PCR扩增、测序获得牛CART启动子序列,EMBOSS、MethPrimer、New PLACE数据库分析启动子结构特征;构建4个包含不同截短长度的CART启动子报告基因载体,双荧光素酶报告基因活性检测鉴定核心启动子区;应用DNA pull down结合质谱分析(n=3),功能聚类及结合位点预测分析筛选核心启动子区候选转录因子;构建转录因子过表达载体,转染至293T细胞,分析转录因子对牛CART核心启动子区的转录调控功能(n=3)。结果表明,牛CART基因-1 200 bp～+22 bp区域存在CpG岛和TATA box、CAAT box等顺式作用元件;构建的4个截短启动子报告基因载体均具有转录起始活性,-292 bp～+22 bp片段转录起始活性最强,为牛CART基因核心启动子区;转录因子RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA可与牛CART基因核心启动子区特异性结合;进一步研究证实RFX5、RFX1、TEA...     

鹅MyoG基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在分析鹅MyoG基因启动子活性区域和转录因子,探究该基因的转录调控机制。本研究首先通过PCR扩增泰州鹅MyoG基因5'侧翼区序列1 245 bp并对其进行测序和生物信息学分析,其次,构建4个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,转染C2C12细胞系。进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,对转录因子结合位点HNF4（-521～-503 bp）、USF （-379～-370 bp）和E2（-296～-281 bp）进行定点突变并构建突变报告基因载体,在C2C12细胞系内初步鉴定MyoG基因核心转录调控因子。最后,采集70日龄泰州鹅胸肌、腿肌、心、肝、脾、肺、肾和下丘脑组织样,利用荧光定量PCR检测MyoG基因和核心转录调控因子的组织表达谱。结果表明,扩增得到的鹅MyoG基因5'侧翼区序列包含启动子元件;利用双荧光素酶报告载体检测到鹅MyoG基因启动子区-624～-154 bp区域存在关键顺式调控元件;结合定点突变技术初步鉴定USF是鹅MyoG基因核心转录调控元件。组织表达谱研究进一步表明,MyoG和USF基因在鹅8个不同组织中均有表达,且在胸肌、腿肌和心组织中共同高表达（P<0.01）。鹅MyoG基因5'侧翼区具有启动子转录活性,-624～＋37 bp是核心启动子区,USF是MyoG核心转录调控因子。试验结果为探究MyoG基因在鹅肌肉发育过程的调控机制提供理论依据。     

大白猪MYOD1、AKT3基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性及其可能存在的影响基因表达的分子调控机制，试验采用PCR直接测序的方法对大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性进行检测，同时利用生物信息学分析方法预测了大白猪MYOD1和AKT3基因的核心启动子区、CpG岛和转录因子结合域。结果显示，MYOD1基因共预测到5个核心启动子区、1个CpG岛区域和10个转录因子结合域，且第5个核心启动子区位于CpG岛区域内；AKT3基因共预测到6个核心启动子区，未发现CpG岛的存在。通过直接测序的方法检测到MYOD1基因在G-361T处存在1个SNP突变，但在本试验群体中只发现1种基因型，同时该突变位点位于第1个核心启动子区内；AKT3基因在启动子区T-1709C处存在1个SNP突变，包括TT、TC和CC 3种基因型，其中TT基因型为优势基因型，T为优势等位基因。遗传多态性分析提示，该突变位点多态信息含量（PIC）介于0.25~0.5之间，表现为中度多态。本研究初步探究了大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性并预测了启动子区可能的调控因子和调控元件，为进一步研究MYOD1、AKT3基因对肌肉生长发育的调控机制及将突变位点作为遗传标记用于分子选育提供指导和依据。     

牦牛FKBP6基因启动子区克隆、鉴定与分析

本研究旨在了解牦牛FKBP6基因5′调控区和启动子区特征,为探讨牦牛和犏牛睾丸组织中FKBP6基因差异表达机制提供依据。利用克隆测序获得牦牛FKBP6基因5′调控区序列,采用生物信息学方法分析其序列特征;采用双荧光素酶报告基因系统鉴定牦牛FKBP6基因核心启动子区,利用生物信息学软件预测与精子发生有关的转录因子结合位点。通过克隆测序和序列拼接获得了1 354bp的牦牛FKBP6基因5′调控区序列,与普通牛的一致性为99.71%;牦牛FKBP6基因5′调控区序列含有潜在的启动子区、典型的CAAT-Box和CpG岛,但未见TATA-Box;荧光素酶活性分析发现,牦牛FKBP6基因的核心启动子区位于5′调控区的-263~-167nt区域,含有CAAT-Box、E-Box、CTCF和CREB等与精子发生相关的转录因子结合位点。牦牛FKBP6基因核心启动子的鉴定和精子发生相关转录因子结合位点的发现为进一步研究牦牛睾丸组织中FKBP6基因的表达调控奠定了基础。     

UCP3基因在巴马猪和藏猪脂肪组织中的表达和甲基化分析

为探究解偶联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的表达和甲基化水平,试验采用实时荧光定量PCR技术检测UCP3基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的mRNA表达水平;针对猪UCP3基因启动子区域（-3 580~+920 bp）,利用在线软件MethPrimer对该区域进行CpG岛预测,并采用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测其甲基化水平,探究UCP3基因甲基化水平在巴马猪和藏猪中的差异。结果显示,巴马猪皮下脂肪组织UCP3基因表达量显著高于藏猪（P<0.05）;在UCP3基因启动子区预测到3个CpG甲基化岛,分别是CpG island1（-3 171~-2 928 bp）、CpG island2（-154~-2 bp）和CpG island3（+648~+806 bp）,其中CpG island1和CpG island3的甲基化水平在巴马猪和藏猪中差异较小,而藏猪CpG island2的甲基化水平（42.61%）高于巴马猪（24.49%）。本研究绘制了2个猪种CpG island2甲基化水平的黑白点图,其中CpG位点为4、8、9、10、11、12、15,藏猪甲基化频率分别比巴马猪高28.26%、17.39%、26.09%、26.09%、26.09%、23.91%和34.78%。在CpG island2处预测到3个转录因子结合位点（SP2、PPARγ和EGR1）。结果表明,巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中UCP3基因mRNA水平的表达差异可能是由于CpG island2的甲基化水平不同所导致,藏猪DNA甲基化水平在一定程度上阻碍了转录因子与启动子调控区域的结合,从而抑制了UCP3基因的表达。     

鹅p21基因克隆、启动子分析及转录调控研究

【目的】 分析鹅p21基因的结构和启动子活性，探讨p21基因的转录调控机制。【方法】 以泰州鹅为试验对象，通过同源克隆、RACE和生物信息学分析等方法获得鹅p21基因全长序列和5′-侧翼区序列特征；构建6个不同缺失片段的启动子区双荧光素酶报告载体并分析其荧光素酶活性，进而确定p21基因核心启动子区；对核心启动子区转录因子结合位点生肌决定因子(MyoD)(+25~+36 bp)进行定点突变，并构建突变报告基因载体，在C2C12细胞系内初步鉴定鹅p21基因核心转录调控因子。【结果】 鹅p21基因cDNA全长1 943 bp，CDS区大小为453 bp，编码151个氨基酸，蛋白序列包含高度保守的CDI家族结合位点。系统进化树分析表明，鹅p21基因与鸭亲缘关系最近，与鸡和火鸡有较强的进化关系。鹅p21基因5′-侧翼区包含启动子元件，—35~+37 bp是核心启动子区，发挥正向调控作用，结合定点突变技术初步鉴定MyoD是鹅p21基因核心转录调控元件。【结论】 本研究获得了鹅p21基因完整的cDNA序列和启动子区域，MyoD是p21基因核心转录调控因子，为探究p21基因在鹅胚胎期肌肉发育过程中的调控机制提供理论依据。     

牛UCP3和MYH1基因启动子在C2C12和3T3-L1细胞中的启动活性分析

为阐明牛解偶联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）和肌球蛋白重链1（myosin heavy chain 1,MYH1）基因启动子的核心区及其在小鼠C2C12和3T3-L1两种细胞株中的启动活性,本研究利用PCR、双荧光素酶和脂质体转染等方法进行关岭牛UCP3和MYH1基因启动子的扩增、重组载体构建和启动子活性分析。结果显示,试验成功构建了pGL3-Basic-UCP3-pro和pGL3-Basic-MYH1-pro重组真核表达载体,分别转染至小鼠C2C12和3T3-L1细胞后发现,UCP3、MYH1基因启动子的核心区分别为UCP3-P6（－385~+3 bp）和MYH1-P5（－255~+15 bp）区域;pGL3-Basic-MYH1-P2~pGL3-Basic-MYH1-P5在C2C12细胞中启动子活性均高于3T3-L1细胞,表明MYH1基因启动子活性在成肌细胞C2C12中较高。本研究阐明了UCP3和MYH1基因启动子的核心区及其启动子活性,为进一步研究UCP3和MYH1基因的转录调控机理提供了科学依据。     

陆川猪GPR1基因启动子甲基化及其mRNA表达分析

为了探讨G-蛋白偶联受体1(GPR1)基因启动子甲基化对其在陆川猪和杜洛克猪背最长肌组织中差异表达的影响,试验采用实时荧光定量PCR方法检测GPR1基因mRNA在两个品种猪背最长肌中的表达水平,在线预测的方法预测GPR1基因启动子区CpG岛,亚硫酸氢盐测序(BSP)法分析猪GPR1基因启动子区CpG岛的甲基化水平。结果表明:GPR1基因在两品种猪背最长肌组织中的相对表达量差异显著,在陆川猪背最长肌中的相对表达量明显高于杜洛克猪;GPR1基因启动子区存在一个CpG岛,长度为103 bp,位于-1 031~-929 bp处;GPR1基因启动子区CpG岛在两品种猪背最长肌中的整体甲基化水平差异不显著,但在-126,-116,-64,-10位点甲基化水平差异显著。说明GPR1基因启动子甲基化程度与肌内脂肪沉积存在一定关联。     

系统分析多组织转录组鉴定影响猪脂肪沉积的关键基因

旨在挖掘影响松辽黑猪脂肪沉积的关键基因及脂肪、肝和肌肉在体内的功能。本研究选择体重100 kg左右健康且背膘厚差异显著的6头(高、低各3头)松辽黑猪为试验动物,利用高通量转录组测序技术检测其脂肪、肝和背最长肌组织中基因的表达水平,鉴定不同脂肪沉积猪和不同组织中的差异表达基因,并分析差异表达基因的生物学功能。结果表明,在不同分组的猪中发现135个差异表达基因,其中部分参与了PPAR信号通路、AMPK信号通路、代谢通路、脂肪酸代谢和甘油代谢等通路。经生物学功能分析发现,EHHADH、ME1、SCD、OLR1、PHGDH、ACLY、LEP和CYP超家族基因等基因为影响猪脂肪沉积的关键基因。在不同组织的差异表达表达基因中,脂肪组织中高表达的基因显著富集在胰岛素信号通路、MAPK信号通路、三羧酸循环、氧化磷酸化等通路;肝中高表达基因显著富集在多种物质的代谢、脂肪酸的降解、氨基酸的合成等通路;背最长肌中高表达的基因主要参与了蛋白质的降解、PI3K-Akt信号通路、氧化磷酸化通路、Wnt信号通路、磷脂酰肌醇信号通路等通路。不同组间差异表达基因分析结果提示,EHHADH、ME1、SCD、OLR1、PHGDH、ACLY、LEP和CYP超家族基因等基因是影响脂肪沉积的关键基因;不同组织间差异表达基因表明,脂肪组织是脂肪合成的主要部位,而肝和肌肉组织主要涉及脂肪酸的降解。本研究结果对脂肪性状的遗传改良、机理解析有一定意义。     

鸡脂肪组织TCF21基因启动子区DNA甲基化与其表达的关系

旨在研究鸡脂肪组织中TCF21基因启动子区DNA甲基化水平与其表达的关系。以东北农业大学高、低腹脂双向选择品系（简称高、低脂系）第24世代7周龄肉鸡为试验材料，利用RT-qPCR检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平；利用生物信息学和双荧光素酶报告系统分析TCF21基因启动子的结构与功能；利用Sequenom MassARRAY飞行质谱检测高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因启动子区CpG位点的甲基化水平；利用CpG甲基转移酶处理TCF21启动子报告基因质粒，分析DNA甲基化对TCF21基因启动子活性的影响。结果显示，高脂系肉鸡腹部脂肪组织中TCF21基因的mRNA表达水平极显著高于低脂系（P<0.001）；TCF21基因的启动子区存在40个CpG位点，且在启动子的近端和远端均有分布，但不存在CpG岛；将TCF21基因的启动子划分为5个功能区域，分别为R1区域（-2 000~-1 500 bp）、R2区域（-1 500~-1 000 bp）、R3区域（-1 000~-500 bp）、R4区域（-500~-200 bp）和Core区域（-200~-100 bp）；高脂系R2、R3和R2+R3区域的DNA甲基化水平显著或极显著高于低脂系（P<0.05或P<0.001）；R2、R3、R2+R3区域的DNA甲基化水平与TCF21基因mRNA表达水平呈显著正相关（R2区域：r=0.438，P<0.05；R3区域：r=0.371，P<0.05；R2+R3区域：r=0.489，P<0.05）；R2区域的DNA甲基化显著抑制其转录活性（P<0.05）。综上所述，TCF21基因在高、低脂系肉鸡腹部脂肪组织中的表达水平主要与其启动子R2区域的DNA甲基化水平有关。     

巴马香猪VRTN基因克隆、表达及其多态性与繁殖性状的关联分析

旨在研究VRTN（vertebrae development homolog）基因在巴马香猪群体中的编码区序列特征、组织表达情况、脊椎数性状因果突变位点ins291的等位基因频率及其与乳头数和产仔数性状的关联。本研究采集3头0日龄巴马香猪组织,利用cDNA克隆技术获得VRTN基因编码区全长序列并进行生物信息学分析,利用荧光定量PCR技术检测VRTN在心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪组织中的表达情况;采集279头经产巴马香猪母猪血液,检测ins291位点在该群体中的频率分布,并与乳头数、产仔数性状进行关联分析。结果表明,巴马香猪VRTN基因编码区全长2 097 bp,其编码的氨基酸序列在不同物种间存在大量保守区域;VRTN基因编码698个氨基酸,预测为亲水性蛋白质,存在1个螺旋转角螺旋域超家族结构功能区、2个低复杂度区域和2个内部重复结构,并与核受体辅抑制子1（NR6A1）、果蝇同源框基因Prospero的脊椎动物同源蛋白2（PROX2）和富亮氨酸重复序列74亚基（LRRC74A）等蛋白具有相互作用;VRTN基因在0日龄巴马香猪各组织中均有表达,其中在背最长肌组织中表达量最高;巴马香猪保种群体中VRTN基因有利突变位点ins291的等位基因频率为21.15%,不同基因型个体之间平均产仔数、总乳头数、左侧乳头数、右侧乳头数和单侧最大乳头数性状均无显著差异（P>0.05）,但纯合突变型（ins/ins）个体的乳头数性状均高于其他基因型个体。结果提示,在巴马香猪产业化生产中可通过分子育种手段提高VRTN ins291有利等位基因频率,但不影响其产仔数性状。     

DNA甲基化调控牛AQP1基因的胎盘特异性印记

为揭示牛AQP1（aquaporin 1）基因在不同组织及胎盘中的印记状态，以及DNA甲基化修饰在印记中的调控机制，本研究采用基于SNP的PCR产物直接测序的方法，对32头健康雌性成年荷斯坦奶牛心组织及15个自然分娩后的胎盘试验样本进行检测，确定了5头杂合子个体牛和3个杂合子胎盘，对其组织（心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪）和胎盘进行AQP1等位基因表达分析及印记状态分析，利用亚硫酸氢盐测序法分析AQP1基因位于启动子和第一个外显子区的CpG岛在牛心、肝组织、2个胎盘和对应精子中的DNA甲基化状态。结果发现，在杂合子牛被检测的7个组织中，AQP1基因呈现双等位基因表达；而在胎盘中，AQP1基因为单等位基因表达。通过分析杂合子胎盘对应的亲本基因型，发现AQP1基因为母源等位基因表达，即父源印记。进一步比较分析AQP1基因启动子区CpG岛在牛组织、胎盘及对应精子中的甲基化状态，在双等位基因表达的心脏、肝脏组织中，该区域未发现差异甲基化区（differentially methylated regions，DMR）；而在单等位基因表达的胎盘中，存在差异甲基化区，同时父源等位基因精子中为重甲基化状态。以上结果说明，牛AQP1基因为胎盘特异性单等位基因表达的父源印记基因，且AQP1基因位于启动子和第一个外显子区的CpG岛甲基化修饰参与调控牛胎盘的印记表达；在被检测的组织中为双等位基因表达。     

水牛HSD17B1基因启动子荧光素酶报告基因载体构建与分析

试验旨在筛选水牛HSD17B1基因启动子活性区域及影响因素，并预测其转录结合因子，为探究该基因在水牛繁殖性能中的调控机理提供理论依据。以水牛血液基因组DNA为模板，PCR扩增得到3个HSD17B1基因启动子活性区域序列，并定向克隆至pGL3-promoter载体；将重组质粒转染到水牛卵泡颗粒细胞，通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性，并探究其与促黄体素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡素（follicle stimulating hormone，FSH）的关系；利用生物信息学方法对HSD17B1基因启动子区进行转录结合因子预测。结果显示，本试验成功克隆了3个不同长度的HSD17B1基因启动子片段，并成功构建了双荧光素酶报告载体。经不同长度启动子片段的活性检测发现，pGL-pro-HSD17B1-1500活性最强，证实－866/－1 500 bp为HSD17B1基因核心启动子区域，表明该区域对HSD17B1基因转录调控有重要作用。荧光素酶活性检测结果显示，添加LH可增强HSD17B1基因启动子活性。生物信息学分析发现，HSD17B1基因启动子区存在6个转录因子结合位点：Sp1（－2 327/－2 317 bp）、HOXA4（－2 162/－2 146 bp）、Sp1（－1 409/－1 395 bp）、Sp1（－1 391/－1 380 bp）、Sp1（－1 345/－1 319 bp）和GATA1（－812/－801 bp），但无CpG岛，有1个TATA-box和2个CAAT-box。本研究成功构建了HSD17B1基因启动子荧光素酶报告载体，确定了HSD17B1基因启动子核心区域，并证明LH可增强启动子活性。     

过表达NR4A1促进山羊皮下脂肪细胞分化

旨在克隆山羊NR4A1基因的CDS区序列,明确其组织和细胞表达模式,以及探究过表达NR4A1基因对山羊皮下脂肪细胞分化的影响。本试验利用双酶切法构建山羊过表达载体pcDNA3.1-NR4A1。以1周岁简州大耳羊（n=5）为试验动物。利用RT-PCR方法和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）技术克隆NR4A1基因编码区序列并明确其时空表达特性,再将山羊pcDNA3.1-NR4A1载体转染皮下脂肪细胞使NR4A1过表达,利用形态学方法检测过表达后脂滴聚集的变化,同时采用qPCR方法检测脂肪分化标志基因相对表达水平的变化。结果获得山羊NR4A1基因的编码区序列是1 797 bp,编码598个氨基酸;NR4A1在山羊各组织中广泛表达,且在山羊背最长肌中的相对表达水平最高（P<0.01）,在山羊皮下脂肪细胞分化60 h表达量最高（P<0.01）;过表达NR4A1基因显著促进山羊皮下脂肪细胞的脂滴积累,并且显著提高C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、LPL、SREBP1和AP2的相对表达水平（P<0.05）。NR4A1基因可能是山羊皮下脂肪细胞分化的正调控因子,且可能是协同脂肪分化标志基因的表达量来实现的。