O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法的建立

本研究建立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法,确立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA抗体检测方法检测O型口蹄疫血清阴阳性判定标准：抗体效价大于或等于1：32时判为O型口蹄疫抗体阳性;1：16～1：32时判为O型口蹄疫抗体可疑。检测131份阴性血清、口蹄疫亚洲1型阳性血清和A型阳性血清,固相竞争ELISA方法和液相阻断ELISA方法的特异性分别是95．5％,84．7％。固相竞争ELISA方法检测口蹄疫亚洲1型、口蹄疫A型阳性血清时,无交叉反应,O型口蹄疫病毒感染牛、免疫牛和感染猪血清的阳性检出率均为100％,免疫猪检出率为86．7％。     

固相竞争ELISA和液相阻断ELISA在口蹄疫抗体检测中的比较

为对比固相竞争ELISA和液相阻断ELISA在口蹄疫抗体检测中的应用,选择猪血清345份、牛血清110份、羊血清159份,共614份血清样品同时进行O型和A型抗体检测,对比两种检测方法的符合率和对不同畜种的检出率。结果：两种检测方法在O型抗体检测中的符合率为95.3%,在A型抗体检测中的符合率为96.1%,对不同畜种的检出率无明显差异。结论：在大规模检测免疫抗体时,推荐采样固相竞争ELISA检测方法。     

口蹄疫O型固相竞争ELISA抗体检测试剂盒的临床应用

用口蹄疫O型固相竞争ELISA检测血清1 150份,口蹄疫O型免疫血清820份,敏感性为91.83%;试剂盒特异性评价检测血清180份,其特异性为89.4%;固相竞争ELISA和液相阻断ELISA共同检测血清100份,其相关性分析为0.964 1,R2为0.929 5,属于高度相关。3批试剂盒检测血清样品50份,检测结果差异不显著,口蹄疫O型固相竞争ELISA抗体检测试剂盒检测结果比较稳定,具有良好的批间可重复性和稳定性。     

基于单克隆抗体的O型口蹄疫病毒抗体固相竞争ELISA检测方法的建立

为建立评价O型口蹄疫病毒(FMDV)疫苗免疫水平的方法,本研究以单克隆抗体(MAb)3D9为捕获抗体,以HRP标记的MAb 8E8作为检测MAb,经过条件优化建立了基于MAb的检测O型FMDV抗体的固相竞争ELISA(SPCE)方法。对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,MAb 3D9的最佳稀释度为1:25 000,灭活O型FMDV抗原的最佳稀释浓度为1:3,HRP标记的MAb 8E8的最佳稀释度为15 000,当血清1:32稀释时,检测的临界值确定为45%。该方法分别检测A型FMDV抗体阳性参考血清以及牛冠状病毒、牛轮状病毒以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的标准阳性血清,检测结果均为阴性,未出现交叉反应。经检测,当阳性标准血清的抗体稀释度在1:512时,该方法仍具有较好的敏感性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。并将该方法与液相阻断ELISA(LPBE)方法和病毒中和试验(VNT)的相关性进行了比较,结果显示该方法与LPBE和VNT的相关性分别为0.896和0.923。本研究为国内评价O型FMDV疫苗免疫水平建立了一种新的方法。     

3A蛋白间接ELISA试验检测猪口蹄疫感染抗体的研究

用表达的口蹄疫3A蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA试验，对口蹄疫病毒感染血清、免疫血清和其它非口蹄疫病毒血清进行了检测研究。结果表明，3A蛋白间接ELISA试验对口蹄疫具有较好的特异性，可以区分感染口蹄疫病毒的猪血清和疫苗免疫猪血清。     

抗A型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立A型口蹄疫病毒(FMDV)病原学诊断方法,本研究应用纯化的A型FMDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选获得一株稳定分泌单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株5F7.经IFA特异性鉴定,5F7为一株血清型特异性MAb.亚类为IgG1/k.间接ELISA检测杂交瘤细胞上清和腹水抗体效价分别为1:12 800和1:105.硫氰酸盐洗脱法测定其相对亲和力常数为1.5 mol/L.应用该A型特异性MAb及实验室已制备的MAb 3D9初步建立了检测A型FMDV的抗原捕获ELISA方法.该方法可以检出2.0 ng纯化FMDV和1.0×104 TCID50病毒,与O型、Asial型FMDV及牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,组内及组间重复性试验显示变异系数小于8％.本研究建立的抗原捕获ELISA方法为A型FMDV抗原检测提供了一种实用有效的技术手段.     

口蹄疫病毒抗体检测

口蹄疫是一种急性、高度接触性、烈性的传染病,是由口蹄疫病毒引起的,常常发生在偶蹄动物,偶尔也见于人和其它动物。世界动物卫生组织已经将该病列为法定申报传染病,我国将其列为一类动物疫病。我国主要通过实施强制免疫来预防控制该病,疫苗免疫之后所产生的抗体水平是评价免疫效果的重要手段,也可以根据免疫后的效果来制定合理免疫程序。本实验室主要通过口蹄疫液相阻断和3ABC非结构蛋白抗体检测试剂盒来进行抗体检测。     

口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒与其改进型试剂盒的比对试验

为了评估田东县动物疫病预防控制中心兽医实验室检验质量,了解同一检测项目不同检测试剂盒检验结果的差异情况,实验室于2020年11月25日进行了口蹄疫O型抗体检测试剂盒比对试验.目的在于检验口蹄疫O型抗体不同检测试剂盒对检验结果的影响及敏感度,以及时发现存在问题,解决问题,不断提高实验室检测能力水平.     

O型口蹄疫抗体金标试纸盒检测免疫动物抗体效价与攻毒保护关系

本研究目的在于用O型口蹄疫金标试纸条研究免疫动物抗体效价与攻毒保护之间的对应关系以及免疫牛抗体消长规律.用金标试纸条检测了口蹄疫O型疫苗质量标准规定的牛、羊和猪免疫和攻毒血清抗体效价及不同免疫程序的牛血清效价.结果显示,当牛、猪和羊免疫血清稀释≥1∶8时,试纸条是阳性结果,表示有99％的被免疫动物属于抗体水平保护范围;被检测血清稀释≤1∶2时,是阴性结果,表示被免疫动物抗体水平属于不保护范围;血清稀释1∶2～1∶8时,是阳性结果,表示有50％的被免疫动物属于抗体水平保护范围.牛在首次免疫8周后加强免疫可以获得良好的保护率和保护时间.通过本试验确定了金标试纸条检测免疫动物抗体效价与攻毒保护之间的关系及牛加强免疫最佳的时间.     

以合成肽为抗原检测O型口蹄疫病毒抗体 ELISA方法的建立和评价

作者以固相法合成特异性FMDV主要保护性抗原VP1上的表位肽,将其与载体蛋白BSA偶联,作为包被抗原,制备检测抗O型口蹄疫病毒(FMDV)抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核.结果表明该方法的敏感性为95.12%,特异性为100%.检测199份血清标本,与UBI FMD VP1试剂盒的符合率达到98.49%,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达到96.98%.该多肽ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控口蹄疫抗体水平.     

南非II型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立

为满足口岸对南非II型口蹄疫检测、监测的需求,在对南非II型口蹄疫抗原表位分析及相关基因合成的基础上,进行融合蛋白pGEX—VP1-VP3的体外表达,采用柱上酶切方法制备VP1-VP3蛋白。将纯化VP1-VP3抗原包被96微孔板,分别优化抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度,确定阴性临界值。经反复优化,建立的南非II型间接ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为6．4ug／ml,血清最佳稀释度为1：200,酶标二抗最佳稀释度为1：4000,阴性临界值（0D450）为0．562。检测样品判定标准为：OD450〉0．622为阳性,OD450〈0．502为阴性,0．502≤OD450≤0．622为可疑。特异性试验结果表明,所建立方法与其它血清型口蹄疫间无交叉反应。南非II型口蹄疫间接ELISA检测方法的建立为我国口岸口蹄疫检疫提供了新的查验方法。     

免疫小鼠血清中猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒的研究

为研制一种小鼠血清中猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）抗体检测试剂盒,以PCV2 Cap蛋白兔多抗作为包被用抗体,捕获纯化的PCV2 Cap蛋白,制备抗原检测板,辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG作为二抗,建立检测小鼠血清中PCV2抗体ELISA检测方法并制备试剂盒。采用所制备的ELISA试剂盒对50份已知阴性血清样本进行检测,临界OD450nm值为0335;采用ELISA试剂盒与IFA分别对100份血清检测,总符合率为96%,检测小鼠血清敏感性效价达1∶16000,与其他常见的猪病毒小鼠阳性血清无交叉反应,2～8 ℃保存15个月稳定,批内变异系数为2.28%～4.17%,批间变异系数为4.27%～6.02%,具有良好的敏感性、特异性、稳定性及重复性;采用ELISA试剂盒对不同来源疫苗免疫组小鼠血清进行检测,均显示良好效果。研究表明,本研究制备的ELISA试剂盒可用于小鼠血清中PCV2抗体效价检测。     

口蹄疫病毒感染与免疫鉴别诊断及免疫评价二联试纸的优化

【目的】建立口蹄疫病毒(FMDV)感染与免疫鉴别诊断及免疫评价二联试纸稳定的生产工艺,促进其产业化生产及临床应用。【方法】本研究以胶体金免疫探针结合猪IgG,FMDV结构蛋白(SP)及非结构蛋白(NSP)的表位多肽偶联载体蛋白制备人工抗原,设置两条检测线精准拦截抗体的检测模式,以试纸条特异性及敏感性为评价指标,对胶体金免疫探针用蛋白、试纸拦截用多肽抗原、检测线位置及喷膜缓冲液、金标蛋白保存液、样品垫缓冲液以及样品稀释液等参数进行优化。采用优化后的试纸检测266份田间猪血清样品,并与口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(LPB ELISA)和3ABC阻断ELISA抗体检测试剂盒(3ABC ELISA)检测结果进行对比,计算该试纸与商品ELISA试剂盒的符合率。【结果】经优化后,口蹄疫感染与免疫鉴别诊断及免疫评价二联试纸生产工艺参数如下：以胶体金标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)为免疫探针;选择混合多肽的形式设置拦截线,以非结构蛋白多肽(BSA-NSPs)喷涂T1线,结构蛋白多肽(BSA-SPs)喷涂T2线,以0.1 mol/L Tris-HCl为喷膜缓冲液;以ddH₂     

猪“O”型口蹄疫基因工程苗免疫猪的免疫效力、安全性及抗体消长

对猪“Ｏ”型口蹄疫基因工程疫苗进行免疫效力和安全性的观察,同时检测了免疫猪的抗体消长。结果表明,该基因工程疫苗对猪体是安全、有效的。免疫猪抗体乳鼠中和指数在免疫后４个月仍可达２．０,血凝价仍达２７．５。     

西尼罗河病毒病竞争ELISA检测方法的初步建立及应用

本研究用表达的西尼罗河病毒(WNV)囊膜蛋白E结构域III蛋白作为包被抗原,单抗8F4A4作为竞争检测抗体,初步建立了能够对乙型脑炎病毒(JEV)和WNV进行鉴别诊断的竞争ELISA方法。优化的最佳抗原包被浓度为530ng/mL,单抗的最佳稀释倍数为1:8000,待检血清的最佳稀释倍数为1:10。通过对56份阴性样品进行检测确定了该方法的临界值为30%,以此为判定标准对临床220份血清进行检测,结果均为阴性。此方法的建立弥补了商品化试剂盒不能区分JEV和WNV感染的缺陷,为我国西尼罗河病毒病的流行病学调查提供了一种有效的抗体检测方法。     

猪圆环病毒2型IgM抗体间接ELISA的建立

猪圆环病毒2型(PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症的重要原发性病原,其感染的早期检测有助于及时采取防控措施。以重组衣壳蛋白(Cap蛋白)作为包被抗原,通过对反应条件的优化,建立了PCV2 IgM抗体间接ELISA,其最适抗原包被浓度为1.25 μg／mL,最适血清稀释度为1∶100,临界值为0.35。该检测方法与其他5种常见猪疫病阳性血清无交叉反应,特异性良好。批内、批间重复试验的变异系数均在2%~6%,重复性好。对100份临床样本的检测结果表明,该检测方法与国外同类试剂盒相比,敏感性为90.3%,特异性为92.8%,总符合率为92%。试验结果表明,所建立的PCV2 IgM间接ELISA特异性好和敏感性高,适用于PCV2感染早期的流行病学调查。     

广东省猪群口蹄疫免疫抗体水平调查

采集广东省不同地区11个猪场的不同类型猪的血清样品3 108份,采用液相阻断-酶联免疫吸附法,以口蹄疫结构蛋白抗体滴度作为评估疫苗效力的指标。本试验共采集种公猪血清样品77份,结果显示平均抗体滴度为(1.859 1±0.078 1,1∶72);仔猪血清样品514份,平均抗体滴度为(1.793 3±0.027 9,1∶62);经产母猪血清样品604份,平均抗体滴度为(1.967 2±0.024 2,1∶92);后备母猪血清样品有1 913份,平均抗体滴度为(1.790 8±0.015 2,1∶61)。从统计结果来看,经产母猪的免疫状态是最好的,但总的来说,猪群的整体免疫水平不高,免疫形势不容乐观,口蹄疫的防治水平仍须提高。     

一种用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和方法

本文建立了一种用于口蹄疫病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和方法。分析所有已报道的口蹄疫病毒通用型基因组序列,分别设计引物和荧光探针,通过实时荧光RT-PCR检测,得到口蹄疫通用型的特异性荧光曲线,可以确定血清型,检测结果准确、可靠。