CRISPR/Cas9介导靶向敲除拟南芥REVOLUTA基因突变体的鉴定

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行定点编辑,为获得基因缺失突变体提供了新的工具.HD-Zip Ⅲ家族成员REVOLUTA(REV)是植物发育过程中的关键转录因子.本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥REV进行特异性定点编辑,构建REV基因编辑表达载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟...     

CRISPR/Cas9介导的拟南芥TT1基因的敲除

在菜油品质上黄籽相较于褐籽更为优良,且更易于合成高质量的生物柴油。已有研究表明TT1(TRANSPARENT TESTA 1)基因是类黄酮代谢途径中的关键基因,为了通过CRISPR/Cas9基因编辑载体验证TT1基因在白菜型油菜中的功能,本研究先在拟南芥中进行了TT1基因的编辑。构建了CRISPR/Cas9 TT1基因编辑载体,通过农杆菌介导侵染拟南芥花序的遗传转化方式将编辑载体引入拟南芥Columbia生态型,通过表型观察发现T1代12株阳性苗中产生了11株表型株,其中1株表现为褐籽,2株表现为黄籽,9株表现为黄籽和褐籽的嵌合。测序检测分析其突变型结果发现,TT1靶位点处有单碱基缺失、单碱基插入、多个碱基缺失、碱基缺失后插入以及两个靶位点之间多个碱基缺失的多种突变类型。T2代获得一株纯合突变体,TT1两个靶位点之间产生79 bp的碱基缺失,且全株表现为黄籽。本研究为CRISPR/Cas9载体在白菜型油菜中TT1基因功能验证提供借鉴,并为其它作物TT1同源基因的功能验证提供了新的突变体材料。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻OsSLR1敲除突变体

GA是种子萌发的促进因子,能解除种子休眠和刺激萌发,GA的信号通路可以通过对DELLA蛋白的去抑制作用来完成的。通过对不同物种的DELLA蛋白功能的研究,发现不同物种的DELLA蛋白的功能具有高度保守性,本实验主要研究水稻中的DELLA蛋白SLR1,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建OsSLR1基因敲除突变株。首先,通过对OsSLR1的结构和功能域进行分析比对,最终选择3个靶点;然后,利用重组法构建CRISPR/Cas9敲除载体;最后,通过农杆菌介导法,将敲除载体转染成熟的日本晴水稻愈伤,待培育出幼苗,通过PCR和Western Blot进行鉴定。最终筛选得到1株Os SLR1敲除突变株系slr1-1,通过观察突变体萌发表型,发现slr1-1突变体第2天发芽率显著高于日本晴,而且slr1-1突变体的生长速度显著快于日本晴。通过不同浓度PAC对slr1-1突变体萌发表型的影响,发现水稻的DELLA蛋白SLR1敲出的突变体种子萌发不受PAC抑制,表明OsSLR1是通过调控GA信号途径影响水稻种子的萌发,详细的调控机制和互作蛋白等还有待深入的研究。通过对SLR1调控GA信号通路控制水...     

利用CRISPR/Cas9敲除NbLFY基因延迟本氏烟开花时间

开花是植物从营养生长转向生殖生长的重要标志,过早开花会造成植物早衰,严重影响以营养体为产品器官的经济作物的产量和品质,因此研究植物开花基因并对其进行编辑以延迟开花时间具有重要的理论意义和应用价值。LFY基因可抑制叶原基生长并促进花分生组织及花器官形成,是调控植物开花的关键“分子开关”。为利用LFY基因延迟易早花植物的开花时间,本研究以本氏烟为试验材料,构建了NbLFY基因的CRISPR/Cas9敲除载体,利用农杆菌介导法转化叶盘并对编辑植株的表型进行了观察分析。结果表明,通过抗性筛选和PCR检测共获得了10株T₀代植株,靶位点测序分析发现其中有2株NbLFY基因发生了突变,编辑效率为20%,突变类型均为缺失了一个碱基(T)而造成了移码突变。对T₁代基因编辑植株进行表型性状观察发现,与野生型相比,基因编辑植株株高显著降低,现蕾期延迟20 d,第一花序节位也明显提高,表明NbLFY基因的突变导致本氏烟开花时间延后,生殖生长进程延迟。本研究结果证实了NbLFY基因可促进本氏烟开花,敲除该基因可以推迟开花时间。上述研究结果为其他经济作物利用LFY基因...     

利用CRISPR/Cas9技术敲除OsEIL1和OsEIL2基因改良水稻耐盐性

为了培育耐盐水稻品种,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻品种东农427的耐盐负调控基因OsEIL1和OsEIL2设计1个敲除靶点对其进行同时敲除。通过PCR和测序的方法,在T_0共检测出了5个突变单株,其中有1株为双基因同时突变的植株。在该植株的T_1株系中,获得了4株双基因纯合突变且不含T-DNA元件插入的植株。在T_2进行苗期耐盐性鉴定,成熟期考察农艺性状指标。结果表明,在苗期200 mmol/L NaCl溶液处理5 d后,突变体植株的鲜质量和干质量显著高于野生型植株,地上部及地下部钠离子含量均显著低于野生型植株,钾离子含量与野生型植株无明显差异。恢复7 d后,突变体植株幼苗存活率(75.0%)显著高于野生型植株(8.3%)。在成熟期,突变体的主要农艺性状未发生明显变化。综上,利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种东农427进行了耐盐改良,为耐盐水稻品种的培育提供了理论和材料基础。     

靶向马铃薯StProDH1基因的CRISPR/Cas9 sgRNA表达载体构建

CRISPR/Cas9基因编辑系统已成为许多作物基因功能研究和品种改良的重要工具。脯氨酸(Pro)在植物响应干旱胁迫方面起着重要作用,脯氨酸脱氢酶ProDH是脯氨酸分解途径中的限速酶。为了研究StProDH1在马铃薯脯氨酸代谢中的作用,本研究以StProDH1为靶基因,构建了表达马铃薯脯氨酸脱氢酶g RNA的CRISPR/Cas9基因敲除系统,在StProDH1基因5'端第一个外显子上为靶标区域选择设计sgRNA,以p P1C.4为模板,克隆得到sgRNA克隆框,将得到的sgRNA克隆框通过同源重组技术连接到pP1C.4载体中,获得pP1C.4-Cas9-ProDH1-g RNA载体。通过设计引物特异性扩增以及测序进一步确定sgRNA准确地连入载体,这对马铃薯中脯氨酸累积及其培育抗旱马铃薯新品种具有重要意义。     

利用CRISPR/Cas9技术创建OsCOL9水稻突变体

CRISPR/Cas9系统可对植物的内源基因进行有效定点编辑,为作物的遗传育种提供了新的方向。以感病水稻品种丽江为材料,抗病基因OsCOL9为靶基因,探索该系统对水稻内源基因定点编辑效率以及获得有研究意义的突变体。OsCOL9基因CDS序列全长1 266 bp,编码一个422 aa蛋白,分子量大小约为45.6 k Da,蛋白质结构的N端含有B-box结构域,C端含有CCT(CONSTANS、CONSTANS-Like、TOC1)结构域。设计4个长20 nt的guide RNAs(gRNAs)靶点,靶向编辑OsCOL9基因的CDS起始区域以及外显子的末端,分别由U3、U6a、U6b以及U6c启动子驱动,提取T1转基因植株的基因组DNA并对编辑位点附近的DNA片段进行序列分析。结果表明,T1材料中OsCOL9的碱基缺失数最多可达59 bp,突变次数最多可达11次,取得较好的基因编辑效果。同时本试验出现了脱靶效应,因此着重探讨了降低脱靶效应的方法。由于CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑时没有外源基因的导入,加上该技术的快捷、简便,对生物技术与传统育种的结合具有重要实践意义。     

CRISPR/Cas9技术编辑RMS2基因及其利用

水稻雄性不育是杂交水稻杂种优势利用的基础.为了推动粳型第三代杂交水稻育制种技术的发展,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对普通隐性核雄性不育基因RMS2进行定点编辑.根据CRISPR/Cas9基因编辑原理,以RMS2作为靶标基因,在基因第一和第二外显子分别选择正反向靶位点,在NCBI数据库利用BLAST工具分...     

利用CRISPR/Cas9技术创制大豆高油酸突变系

大豆是重要的油料作物,其种子脂肪酸中油酸含量是评价大豆油脂品质的重要指标之一。本研究设计了分别由AtU3d、AtU3b和AtU6-1启动子驱动、长20 bp的guide RNA (gRNA)靶点以靶向编辑GmFAD2-1A基因的外显子区,首先将这3个靶点一起组装到pYLCRISPR/Cas9-DB载体上,然后利用农杆菌介导的方法转化大豆材料华夏3号。通过PCR技术及测序分析对T1代转基因大豆植株靶点编辑情况进行检测,获得纯合GmFAD2-1A大豆突变体。GmFAD2-1A突变大豆植株在株高、主茎节数、单枝分枝数、叶形、花色、种皮色、种脐色、生育期等方面与对照大豆植株没有显著差异;而GmFAD2-1A突变体大豆种子油酸含量显著高于对照大豆品种华夏3号,说明GmFAD2-1A是油酸代谢过程中的关键基因。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功对控制大豆油酸基因GmFAD2-1A进行编辑,获得稳定的纯合GmFAD2-1A大豆突变体材料,为高油酸育种提供了新的种质资源并创建了方法。     

CRISPR/Cas9技术在获取双突变体材料中的应用

为了研究含双MATH结构域基因sb3 与sb6 的功能,需要创制这2 个紧密连锁基因的双突变体。利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对拟南芥Col-0 中的sb3、sb6 基因进行特异性定点双敲除。通过PCR和Singer 测序验证,共获得10 株T0代转基因植株,其中5 株在目标片段上没有发生编辑;另5 株在sb3 基因上的目标序列都发生了编辑,在sb6 基因的目标序列上只有2 株发生了编辑。至此成功获得了sb3 与sb6 基因双敲除的突变体,且获得该突变的类型为核苷酸缺失突变体。这个双突变体的获得为进一步研究双MATH结构域基因在拟南芥中的功能奠定了良好的基础     

利用基因编辑技术改良水稻直链淀粉含量与香味

直链淀粉含量是稻米品质的理化指标之一,理想的稻米直链淀粉含量是13%~18%,有香味的稻米特别受消费者欢迎。本研究利用CRISPR/Cas9系统对Wx、Badh2(fgr)2个基因进行定突变,分别在Wx的5’UTR内含子剪切点和编码区序列(CDS)的第13外显子处设计靶点,Badh2的编码区序列(CDS)的第3和第9外显子处设计靶点,构建2个双靶点CRISPR/Cas9载体,通过遗传转化导入受体‘中早35’中,2个独立的转化事件分别得到14株和13株T0代转化苗,对T0突变情况分析表明,突变频率分别为57.1%,46.2%;对Wx基因编辑后产生的4个无转基因标记的T2代稳定株系进行直链淀粉含量测定,结果分别为12.2%、11.3%、7.4%、4.9%,比未编辑的对照‘中早35’(24.6%)大幅降低;同时对Badh2编辑后产生3个无转基因标记T2代稳定株系进行香气物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)含量测定,结果分别为228.16μg/kg,198.31μg/kg,2095.24μg/kg通过口嚼判断这3个株系确实有不同程度的香味,而没有香味的对照‘中早35’为0.000001μg/kg,以上所有株系的农艺性状与对照‘中早35’一致。综合结果表明,利用CRISPR/Cas9系统成功编辑水稻Wx、Badh2基因,获得了稳定遗传、较低直链淀粉含量且带有香味的突变体,为优质稻育种提供了新的种质资源和创建方法。     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在作物品种改良中的应用

基因组编辑技术是用特殊的核酸酶对基因组进行精准修饰的一种新兴技术。2013 年研究人员发现了CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统,将其中的CRISPR/Cas9 系统成功改造成RNA引导的核酸内切酶,发展了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术。该技术能够对包括植物在内的几乎所有物种的基因组进行高效、精准的定点修饰,而且程序简易、操作方便灵活,加速了遗传工程、功能基因组学的研究,给生命科学的各个领域带来了革命性变化。本综述回顾了CRISPR/Cas9 的出现、改进与发展,简述了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术的作用机理,归纳总结了CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术在作物品种改良、提高作物品质和产量中的应用,最后,分析了该技术在作物品种改良中的发展前景及应用价值,以期为合理利用该技术进行种质创新、品种改良提供理论依据。     

基于CRISPR/Cas9技术对水稻ALOG家族成员的基因敲除突变体的构建

ALOG (Arabidopsis LSH1 and Oryza G1)基因家族成员广泛存在陆生植物中,并在其生长发育的过程中起到关键作用。在水稻ALOG基因家族中总共有10个成员(G1, G1L1～G1L9),G1、G1L5和G1L6已经被证明是影响水稻花发育的关键基因,然而其余7个基因成员的功能还未知。本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑系统对水稻ALOG基因家族功能未知的7个成员进行基因敲除,得到它们的突变株系,借此研究它们的基因功能并观察植株表型。在得到的所有T0代突变体植株中,G1L1、G1L2、G1L3、G1L8和G1L9经过测序和解码已经检测到各自纯合的突变株,经过对纯合突变株基因型和氨基酸序列的分析发现,它们各自的序列都发生移码并且编码的氨基酸序列都存在不同程度的突变,说明基因敲除成功。通过对T0代纯合植株的表型观测,我们在G1L1和G1L2的纯合突变株中发现了穗发育缺陷的表型,即主穗轴变长,且上面的小穗变少。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻ALOG基因家族成员进行敲除,为进一步研究水稻发育尤其是水稻花发育调控分子机制提供了重要的遗传材料。     

一个CRISPR/Cas9-VQR基因编辑系统的构建

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术,但该编辑系统的使用范围受PAM (proto-spacer-motif)位点NGG的限制。本研究通过突变Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)编码氨基酸(1135位的天冬氨酸D突变成缬氨酸V, 1335位的精氨酸R突变为谷胱氨酸Q, 1337位的苏氨酸T突变为精氨酸R,命名该突变子为Cas9-VQR)改造其识别PAM为NGA的位点以扩大其使用范围。并使用玉米Ubi启动子启动Cas9-VQR基因、优化SpCas9的密码子、加入保守的核定位信号序列、增加单子叶植物中保守的3′UTR序列和使用水稻U6启动子启动gRNA来修饰该编辑系统。结果表明Cas9-VQR系统能够识别PAM为NGA的位点,并进行有效的切割。体外酶切活性检测结果表明Cas9-VQR的切割效率为5%～70%。水稻转化检测结果表明Cas9-VQR的切割效率约为27.5%～70.5%,平均切割效率为46.23%。本研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在作物中的使用范围,特别是NGA PAM位点较高的作物。