鸽毛滴虫外泌体的分离鉴定及蛋白质谱分析

旨在研究鸽毛滴虫是否分泌外泌体及虫源外泌体的蛋白组成和功能,为探索外泌体在鸽毛滴虫寄生过程中的作用奠定基础。采集鸽毛滴虫感染个体口腔及咽部病灶处样本,进行分离培养及纯化,使用显微镜鉴定虫体形态,提取DNA并比对其序列,确定培养物是否为鸽毛滴虫虫株;通过对培养液上清进行超速离心,透射电子显微镜、Western blot技术和纳米颗粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)鉴定培养液上清中是否含有虫源外泌体;最后通过Label-free技术分析虫源外泌体的蛋白质谱表达。结果显示,虫体具有明显的毛滴虫形态及特征,与鸽毛滴虫ITS1/5.8S/ITS2基因比对率达98%。从虫体培养液中提取的囊泡经透射电子显微镜观察具有明显的茶托样结构;NTA结果显示,粒径集中于125.1 nm,峰值粒径为132.3 nm,占比99.3%;CD63和TSG101等外泌体标记蛋白的条带明显,表明提取物为外泌体。质谱结果显示,烯醇酶、3-磷酸甘油醛-脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶和延伸因子为表达量较高的蛋白质。GO功能注释显示外泌体蛋白富集到细胞内和胞浆等细胞组分,发挥GTP连接和GTP酶活性功能,参与小GTPase介导的信号转导与糖酵解等过程。KEGG通路富集表明,虫源外泌体蛋白主要富集于代谢途径、糖酵解/糖异生、抗生素的生物合成和次级代谢产物的生物合成等通路。本研究发现鸽毛滴虫可以分泌外泌体,并对虫源外泌体进行蛋白质谱分析,提示虫源外泌体中的蛋白质在寄生虫的能量代谢、信号转导及生物合成等过程中发挥重要作用。     

水牛犊牛血浆外泌体的分离与鉴定

研究旨在从水牛犊牛血浆中分离外泌体,并对分离的外泌体进行分子生物学特征分析和鉴定。采用差速离心法分离3头水牛犊牛的血浆外泌体,并在透射电子显微镜下观察其形态,使用纳米粒度及Zeta电位仪对提取的外泌体进行粒径大小分析,应用Western blotting方法检测外泌体标记蛋白钙联蛋白（Calnexin）、肿瘤易感基因101（TSG101）、CD9、CD81在3头水牛犊牛血浆外泌体中的表达情况。结果显示,从水牛犊牛血浆中分离的外泌体形态多为圆形和椭圆形,直径在30~150 nm;Western blotting检测结果表明,在水牛血浆外泌体表面,特异性蛋白Calnexin、TSG101和CD81阳性表达,CD9不表达。本研究从形态学和分子生物学特征等方面证实研究获得的提取物为外泌体,由此说明,差速离心法可以成功分离提取水牛犊牛血浆中的外泌体,为水牛外泌体的后续研究提供了重要技术基础和参考。     

牛乳外泌体的分离鉴定及功能研究进展

外泌体是由细胞分泌的含有RNA等小分子和蛋白质的纳米级小囊泡,很多细胞在正常或者病理情况下都可以分泌外泌体,并通过细胞膜将外泌体释放到细胞外进而到达靶细胞后发挥作用。牛乳外泌体可作为"细胞信使"介导细胞间的信息转导,调节肠道屏障功能和肠道微生物菌群平衡及代谢。文章对牛乳外泌体的形态结构、分离与鉴定以及功能特性进行综述,以期为牛乳外泌体在动物中的应用研究提供参考。     

外泌体在动物病毒感染中作用研究进展

外泌体是最小的细胞外囊泡,作为一种重要的细胞间通讯载体,广泛存在于体液中。外泌体本身可以携带复杂的核酸和蛋白质,越来越多的研究表明其在病毒感染中起着重要作用。因此,病毒利用外泌体产生感染的作用机制受到了国内外学者的广泛关注。作者通过对近年来外泌体在病毒感染中相关作用的研究进行总结,以期为外泌体在抗病毒方面的研究提供参考。     

鸽毛滴虫3种检测方法比较及环境毛滴虫存在调查

本研究采用现场直接镜检法、样品培养检查法和PCR检测法3种不同检测方法对采自广东省某规模化肉鸽养殖场的60份鸽口腔黏液样品进行鸽毛滴虫检测,来比较3种不同检测方法的差异。结果表明,直接镜检法毛滴虫的阳性率仅为20.0%,而使用培养检查法和PCR检测方法对样品进行检测,其阳性率分别为38.3%和40.0%,均明显高于直接镜检法。以此建立了一种简便、快速和高效的鸽毛滴虫样品培养检查法。同时也对广东省不同地区3个规模化肉鸽场的养殖环境进行鸽毛滴虫检测,结果在鸽笼、食槽、保健砂和水槽部位均未检测到鸽毛滴虫。本研究为鸽毛滴虫病的防治提供了技术支持和依据。     

鸽毛滴虫感染Dot-ELISA检测方法的建立

为了制备兔抗鸽IgG抗体-HRP,建立斑点酶联免疫吸附试验定性检测鸽毛滴虫抗原的检测方法,将纯化的鸽IgG加入佐剂免疫兔子,获取纯化的兔抗鸽IgG抗体;采用简易过碘酸钠法标记兔抗鸽IgG,获取兔抗鸽IgG抗体-HRP;同时将鸽毛滴虫用超声波粉碎加入佐剂后多次免疫健康鸽获取鸽抗鸽毛滴虫高免血清(一抗);然后在2×106个/mL的鸽毛滴虫抗原量下,用不同浓度的一抗抗体、兔抗鸽IgG抗体-HRP进行试验;并对70个临床样品进行检测。结果显示,在2×106个/mL的鸽毛滴虫抗原量下,一抗与兔抗鸽IgG-HRP最佳工作浓度分别为1∶100和1∶500;70个样品中,48个镜检为阳性的样品用Dot-ELISA检测有44个呈阳性,阳性符合率为91.7%;22个镜检为阴性的样品用Dot-ELISA检测有12个呈阴性,阴性符合率为54.5%;Dot-ELISA检测与镜检结果的总符合率为80%。结果表明,本试验成功地建立了鸽毛滴虫感染的Dot-ELISA检测方法。     

外泌体的生物学功能及牛乳源性外泌体资源开发进展

外泌体是一种天然存在于动物体液中的纳米颗粒,能够包裹丰富的核酸、蛋白质和脂质等生物活性物质,是介导细胞间通讯的有力载体.牛乳源性外泌体可抵御摄入者或犊牛胃肠道消化酶的降解,将其包裹的活性内容物传递至靶器官发挥信号传递作用.近期研究表明,牛乳源性外泌体含有大量免疫相关RNA和蛋白质,可调控犊牛的生长发育,尤其是免疫系统的...     

乳源外泌体研究进展

外泌体(exosomes)是一种纳米级别的细胞外囊泡,广泛存在于多种动物的组织和体液中,在各种类型的细胞外囊泡中,外泌体作为一个载体可以携带多种具有生物活性的内含物,而这些内含物的分拣是一个受调控的、非随机的过程.近年来,有研究发现,哺乳动物的乳源外泌体通过消化道被吸收后,可以促进幼畜肠道和免疫系统的发育,同时还参与一...     

毛滴虫在鸽肝组织原代外植块培养液中的生长研究

分别从3组不同日龄鸽消化道(口腔、嗉囊及内脏)采集毛滴虫特征性病变内容物,经处理后接种在健康鸽肝脏组织块原代外植pH 7.0培养液中,置37.5℃培养.250倍光学显微镜观察,虫体在24～36h生长达到高峰,数量为200～517个/μL,大量虫体定殖肝组织块中,并进行阿米巴样快速游动,同时可见数百虫体黏附聚集瓶底绞结成团及大量体积增加两倍的分裂体.5d后在瓶底可见死亡虫体,7d后活虫体数量逐渐下降,12d活虫体减至20个/μL,培养基液pH 6.0.每隔7d传代培养,最多可传至F1.代.     

动物卵泡液外泌体分离方法及主要生殖功能研究进展

外泌体(exosome)是一种广泛存在于各种体液环境和部分组织中的纳米级、均一性膜性囊泡,主要由蛋白质、脂质、mRNA、miRNA和lncRNA等多种生物成分构成。近年来,研究学者已从不同动物的卵泡液中分离出外泌体,并证实卵泡液外泌体参与卵泡颗粒细胞的增殖、卵子的形成及发育、动物受精、胚胎发育、以及雄性动物生殖功能等一系列生殖过程,为进一步研究卵泡液外泌体对哺乳动物生殖功能的调控提供新思路。作者重点阐述了卵泡液外泌体分离鉴定的方法、主要成分以及调控哺乳动物生殖功能的分子机制的最新进展,为全面了解外泌体结构功能、生发凋亡和作用机制提供参考,为利用外泌体探索动物生殖理论和提高动物繁殖技术并将其应用于生产实际提供相关基础信息。     

种鸽感染毛滴虫对乳鸽生长性能、胴体性能和免疫功能的影响

【目的】 研究种鸽感染毛滴虫对乳鸽的危害,为鸽场毛滴虫病的防治提供参考。【方法】 分别选择18对未感染和18对感染毛滴虫的种鸽为对照组和试验组,每对种鸽哺育2只乳鸽,试验期28 d,统计乳鸽的死亡率、生长性能和胴体性能,以及免疫器官指数和抗体水平等生化指标。【结果】 试验组乳鸽的口腔毛滴虫数量显著高于对照组(P<0.05),且虫株数量随乳鸽日龄增长而增长;试验组乳鸽死亡率为26.92%,显著高于对照组(P<0.05);试验组乳鸽1~7日龄的平均日增重显著低于对照组(P<0.05),但出栏重和胴体性能无显著差异(P>0.05);毛滴虫可造成口腔黏膜、胸腺、肝脏和脾脏等组织出现明显病理损伤,血液中白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性显著升高(P<0.05),可溶性抗原CD8(sCD8)水平显著降低(P<0.05)。【结论】 综上,种鸽感染毛滴虫后可通过哺喂鸽乳的过程导致乳鸽感染,引起乳鸽肝脏和脾脏等组织出现明显病理损伤,免疫功能下降,死亡率升高。     

鸽源禽毛滴虫的体外药敏试验

利用体外培养的禽毛滴虫对8种市面上常用药物进行了体外抗禽毛滴虫药敏试验.在发育繁殖稳定的禽毛滴虫的培养管中,分别加入不同种类及其不同浓度的受试药物,37℃作用2和6 h后,计算各管活虫数;并与不加药物的培养管中的活虫数比较,计算活虫率,以此为指标评价不同药物的杀虫效果.结果表明,二甲硝唑、替硝唑具有显著的杀毛滴虫作用,制霉菌素、环丙沙星、复方磺胺甲（口恶）唑仅有部分抑制作用而不能将滴虫完全杀灭,泰乐菌素、复方甘草、盐酸小檗碱杀虫作用不明显.试验结果为临床选用抗禽毛滴虫药物提供了依据.     

卵黄抗体对鸽毛滴虫与白色念珠菌感染的治疗效果

旨在研究鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体制备方法和评价其临床效果。利用临床分离的白色念珠菌与毛滴虫制备二联灭活疫苗,免疫产蛋母鸡获得高水平抗体,采取低温冻干技术制备成卵黄抗体粉。建立ELISA抗体检测法测定卵黄抗体水平,确保质量可控;以分离的肉鸽毛滴虫、白色念珠菌制备发病模型,评价卵黄抗体的保护效果。结果表明：二次免疫后,卵黄中毛滴虫抗体和白色念珠菌抗体OD值达到高峰,分别为0.90和0.66,抗体维持时间达到2个月。卵黄抗体按1 g·只^-1口服饲喂5 d后,肉鸽口腔和嗉囊病变评分与感染对照组相比显著降低（P<0.05）,与甲硝唑、制霉菌素无差异;此外,毛滴虫、白色念珠菌病原载量极显著降低（P<0.01）。研制的鸽毛滴虫与白色念珠菌二联卵黄抗体可以替代甲硝唑和制霉菌素,为肉鸽的健康养殖提供一种新的抗菌素替代产品。     

Trichomonas gallinae in budgerigars and columbid birds in Perth, Western Australia

Objective To estimate the prevalence of infection with Trichomonas gallinae and other parasites of the alimentary tract in psittacine and columbid birds in Perth and to determine in vitro the effectiveness of drugs commonly recommended for treating trichomoniasis.
Design and procedures Samples of crop contents were collected from aviary flocks of budgerigars (Melopsittacus undulatus) and other psittacine and columbid birds in both private and commercial collections in Perth. Similar samples from wild Senegal doves (Streptopelia senegalensis) also were collected. Crop contents were examined and cultured for Trichomonas gallinae and in vitro studies were conducted on the susceptibility of isolates to several drugs used commonly. Other parasites also were detected by faecal examination and/or necropsy.
Results T gallinae was recovered from birds in 1 of 13 private collections of budgerigars (2/289 birds in total). Direct wetmount examination of crop fluid identified 36.4% of samples at four commercial bird dealers which were later determined by culture to contain T gallinae . The prevalence of T gallinae infection ranged from 0 to 11.4% in budgerigars. The prevalence of T gallinae infection in wild Senegal doves was 46% and from one flock of racing pigeons was 59%. The in vitro minimum lethal concentrations of metronidazole, dimetridazole and ronidazole ranged from 40 to 96, 30 to 80 and 40 to 92 μg/mL respectively for six isolates of T gallinae . Other alimentary parasites detected during the survey included Spironucleus sp (syn Hexamita sp), coccidia, Ascaridia platycerci and Raillietina sp.
Conclusions Thirteen budgerigar flocks belonging to members of avicultural societies in Perth had a low prevalence of trichomoniasis and other parasitic infections. The dose rate currently recommended for ronidazole may not result in complete protozoacidal activity against T gallinae infection.     

猪子宫腔液外泌体来源的TIMP2蛋白对胚胎附植的影响

旨在研究猪子宫腔液外泌体来源的TIMP2蛋白对妊娠早期胚胎附植的影响.本研究采用超速离心法分离妊娠第9天(n=3)和第12天(n=3)大白猪子宫腔液外泌体,利用Western blot(WB)检测外泌体中TIMP2蛋白的变化,并通过免疫组化试验研究TIMP2蛋白在子宫中的表达定位.进一步用外泌体与猪胚胎滋养层细胞(po...     

Antitrichomonal activity of Peganum harmala alkaloid extract against trichomoniasis in pigeon (Columba livia domestica)

1. This study was designed to evaluate the antitrichomonal effects of P. harmala alkaloid extract against T. gallinae, both in vitro and in vivo, as well as comparing it to that of metronidazole, conventional antitrichomonal medication and harmine and harmaline, the two alkaloids present in P. harmala.

2. T. gallinae were collected by the wet mount method from infected free-living pigeons. The in vitro assay was performed using multi-well plates containing test compounds in final concentrations of 5, 10, 15, 20, 30, 50 or 100 μg/ml. The in vivo assay was done on 60 experimentally infected pigeons dosed with metronidazole at 50 mg/kg body weight (BW) or alkaloids at 25 mg/kg BW.

3. The 24 h minimum inhibitory concentration (MIC) of alkaloid extract was 15 µg/ml while that of metronidazole was 50 µg/ml. Harmine and harmaline revealed 24 h MIC of 30 and 100 µg/ml, respectively. Treatment of infected pigeons with alkaloids led to a full recovery after 3 d but with metronidazole total eradication of trophozoites was not achieved.

4. In conclusion, data of the present study suggested P. harmala is a potent natural anti-trichomonal agent, effective against T. gallinae.     

不同日龄鸽乳粗蛋白质和矿物元素含量变化规律的研究

【目的】 试验旨在研究1~28日龄乳鸽嗉囊中鸽乳粗蛋白质和矿物元素含量的变化规律。【方法】 选取36对种鸽,每对种鸽哺育2只乳鸽,于乳鸽1、3、5、7、14、28日龄采集鸽乳,每个时间点6个重复,每个重复2只乳鸽,在种鸽哺喂后通过挤压嗉囊的方式采集乳鸽嗉囊内鸽乳。分别在乳鸽1、7、14、21、28日龄时称重,并记录种鸽每周的采食量。【结果】 乳鸽体重随日龄增加呈显著的线性和二次增加(P<0.05),在1~21日龄乳鸽体重随日龄增加而增加(P<0.05),之后维持稳定。种鸽颗粒料和原粮以及总采食量随日龄增加呈显著的线性和二次增加(P<0.05),原粮和颗粒料采食量以及总采食量均于7日龄后显著增加(P<0.05),并在15~28日龄维持稳定。不同日龄鸽乳的粗蛋白质和矿物元素含量均有显著差异(P<0.05)。粗蛋白质含量随日龄增加呈显著的线性和二次减少(P<0.05),1~5日龄粗蛋白质含量维持稳定,在7日龄显著降低(P<0.05),在14~28日龄维持稳定。钙含量随日龄增加呈显著的线性增加(P<0.05),磷含量呈显著的线性减少(P<0.05),钙磷比呈显著的线性升高(P<0.05)。铜、锰、锌含量均随日龄增加呈显著的线性和二次增加(P<0.05)。铁含量随日龄增加呈显著的二次增加(P<0.05),铜、铁、锰、锌含量均在1~3日龄维持稳定,铜含量在5日龄显著增加(P<0.05),之后维持稳定,于14日龄显著增加(P<0.05),随后于28日龄显著降低(P<0.05)。铁、锌和锰含量均于5日龄显著增加(P<0.05),在5~28日龄维持稳定;硒含量随日龄变化无显著差异(P>0.05)。【结论】 乳鸽在21日龄前生长速度快,21~28日龄乳鸽体重维持稳定,种鸽颗粒料和原粮采食量以及总采食量均随乳鸽日龄增加而增加。鸽乳中粗蛋白质和磷含量均随日龄增加而减少,而钙、铜、铁、锰、锌含量均随日龄增加而增加。     

金莲花及花椒水提物体外抗鸽源禽毛滴虫活性

为研究金莲花、花椒水提物体外抗鸽毛滴虫活性及对鸡胚成纤维细胞(CEF)的毒性,使用不同质量浓度的金莲花、花椒水提物分别与鸽毛滴虫共同孵育一定时间,同时设不同质量浓度的甲硝唑做为对照,分别计算药物对虫体的相对抑制率和半数抑制浓度(IC50);再采用MTT法检测药物对CEF的半数毒性浓度(TC50),计算两种中药水提物的选择指数(SI)及安全范围。结果表明,金莲花、花椒水提物体外作用48h对鸽毛滴虫的IC50分别为0.911、1.98g/L;对CEF的TC50分别为1.915、6.37g/L;选择指数分别为3.22、2.10。与甲硝唑相比,金莲花、花椒水提物质量浓度分别≥16、20g/L时与甲硝唑的抗虫活性接近。以上结果可以看出,一定质量浓度的金莲花、花椒水提物均具有一定的抗鸽毛滴虫活性,且细胞毒性较低,两者选择指数均大于1,为有效药物。     

Characterization of an ecto-5'-nucleotidase (EC 3.1.3.5) activity in intact trophozoites of Trichomonas gallinae

This study describes the enzymatic properties of an ecto-5'-nucleotidase in Trichomonas gallinae. The enzyme hydrolyzes nucleoside monophosphates at pH 7.2 and is activated by divalent cations, such as magnesium. Ecto-5'-nucleotidase activity was insensitive to levamisole, tetramisole (alkaline phosphatase inhibitors), and AMPCP (adenosine 5'-[alpha,beta-methylene]diphosphate), an ecto-5'-nucleotidase inhibitor, whereas 0.1mM ammonium molybdate (considered a potent inhibitor of 5'-nucleotidase activity) completely inhibited the enzyme activity. The apparent K(M) (Michaelis constant) and Vmax (maximum velocity) values for Mg2+-AMP were 466+/-57 microM and 3.7+/-0.59 nmolPi/min/10(6) trichomonads, respectively. Considering that trichomonads lack the ability to synthesize purines and pyrimidines de novo, the presence of an ecto-5'-nucleotidase in intact trophozoites of T. gallinae could be important in regulating the extracellular nucleotide levels and generating adenosine, essential for the survival strategies of the parasite.