山羊INSR基因可变剪接体在背最长肌中的表达模式

旨在对山羊胰岛素受体(insulin receptor,INSR)基因进行可变剪接分析,研究其在背最长肌中的表达模式。本试验以简州大耳羊妊娠期胎儿(妊娠期第45、60和105天)及出生后第3天羔羊背最长肌为试验材料,基于转录组测序数据(accession number:SRR3567144)并利用Sanger测序验证,分析INSR基因的可变剪接体类型及其在背最长肌中的表达差异,同时利用在线软件对不同可变剪接体进行生物信息学分析。结果显示,在山羊背最长肌中INSR基因CDS区存在4种不同的可变剪接形式(INSR1、INSR2、INSR3和INSR4),其CDS长分别为4 110、4 146、 4 113和4 149 bp,对应的氨基酸残基数分别为1 369、1 381、1 370和1 382个。山羊INSR 4个可变剪接体之间的主要区别在于Exon 11(36 bp)跳跃和Exon 15部分(3 bp)缺失,这两种可变剪接模式在牛、猪、山羊、人、绵羊和小鼠间完全一致。这些可变剪接改变了山羊INSR的Ser磷酸化位点和第二个FN3功能域,使所编码蛋白3D结构在两个区域发生明显改变。同时,各可变剪接体表达量在背最长肌发育的4个时期均无显著性差异(P0.05),同一时期各可变剪接体表达量之间也无显著性差异(P0.05)。INSR基因序列和剪接模式在哺乳动物中高度保守,该研究结果将为深入揭示INSR基因对动物肌肉发育的调控机制提供理论参考。     

猪hnRNPUL1基因克隆及变异剪接体鉴定

旨在克隆民猪hnRNPUL1基因全长编码区（complete coding sequence，CDS）序列并进行可变剪接分析，研究其组织表达和亚细胞定位情况。本研究以3头3月龄民猪为试验材料，利用RT-PCR技术克隆hnRNPUL1基因CDS及可变剪接体，应用qRT-PCR检测其在心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、背肌、腿肌等组织中的表达情况，同时，在生物信息学预测的基础上，通过融合表达绿色荧光蛋白的方法鉴定核定位序列。研究结果表明，猪hnRNPUL1基因（GenBank accession No.：MN399154）CDS全长2 580 bp，预期编码的多肽链存在着hnRNPs家族的特征性结构域——SAP、SPRY和AAA；猪hnRNPUL1普遍表达于所检测的各组织中，其中在脾脏中表达量最高，在腿肌中表达量最低；核定位序列（NLS）位于多肽链的133~430 aa处，与生物学信息学预测的结果存在着偏差；同时获得了2个变异剪接体和11种可变剪接片段。本研究结果对进一步揭示猪hnRNPUL1基因功能及转录调控机制提供了基础。     

山羊DGAT1基因的克隆及对前体脂肪细胞脂质沉积的调控作用研究

旨在克隆山羊DGAT1基因序列,明确DGAT1基因在山羊不同组织中的表达模式,并进一步揭示过表达DGAT1基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质代谢的影响。本试验以10月龄健康简州大耳公羊（n=7）为试验动物。采用RT-PCR法克隆山羊DGAT1基因序列,并对序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测DGAT1在山羊不同组织中的相对表达水平;采用双酶切法构建pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体并转染至山羊肌内前体脂肪细胞;使用RT-qPCR检测DGAT1过表达效率及脂质代谢相关基因的表达情况;通过油红O染色法观察过表达DGAT1对脂滴形成的影响,利用GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量。结果显示,获得山羊DGAT1基因序列全长1 651 bp （GenBank登录号：MT221183）,包含5'UTR 125 bp,CDS 1 470 bp,3'UTR 56 bp,编码489个氨基酸残基;山羊DGAT1基因在小肠中的表达量最高,在脾中表达量最低;RT-qPCR检测结果显示,DGAT1在细胞中过表达极显著（P<0.01）,GPAM基因的相对表达水平显著上调（P<0.05）,ADRP和ACOX1基因极显著上调（P<0.01）,而AGPAT6基因相对表达水平显著下调（P<0.05）,MLYCD和HSL基因极显著下调（P<0.01）;油红O染色结果显示,过表达DGAT1后脂滴聚积相较于对照组极显著增多（P<0.01）,甘油三酯测定结果显示,过表达DGAT1基因可极显著增加山羊肌内脂肪细胞甘油三酯含量（P<0.01）。本研究成功获得山羊DGAT1基因CDS区序列并构建了pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体,过表达DGAT1可显著促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积,并显著影响脂质代谢相关基因的表达,这些结果为进一步阐明DGAT1对调控山羊肌内脂肪代谢的作用机制提供了重要数据。     

过表达NR4A1促进山羊皮下脂肪细胞分化

旨在克隆山羊NR4A1基因的CDS区序列,明确其组织和细胞表达模式,以及探究过表达NR4A1基因对山羊皮下脂肪细胞分化的影响。本试验利用双酶切法构建山羊过表达载体pcDNA3.1-NR4A1。以1周岁简州大耳羊（n=5）为试验动物。利用RT-PCR方法和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）技术克隆NR4A1基因编码区序列并明确其时空表达特性,再将山羊pcDNA3.1-NR4A1载体转染皮下脂肪细胞使NR4A1过表达,利用形态学方法检测过表达后脂滴聚集的变化,同时采用qPCR方法检测脂肪分化标志基因相对表达水平的变化。结果获得山羊NR4A1基因的编码区序列是1 797 bp,编码598个氨基酸;NR4A1在山羊各组织中广泛表达,且在山羊背最长肌中的相对表达水平最高（P<0.01）,在山羊皮下脂肪细胞分化60 h表达量最高（P<0.01）;过表达NR4A1基因显著促进山羊皮下脂肪细胞的脂滴积累,并且显著提高C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、LPL、SREBP1和AP2的相对表达水平（P<0.05）。NR4A1基因可能是山羊皮下脂肪细胞分化的正调控因子,且可能是协同脂肪分化标志基因的表达量来实现的。     

猪CPB2基因可变剪接体的克隆及生物信息学研究

本研究旨在克隆猪CPB2基因的不同可变剪接体，预测对应蛋白的功能特性以及研究不同转录本表达特性。以健康状态和体重相同的3头12月龄巴马小型猪为试验动物，通过RT-PCR技术及基因平末端克隆技术扩增猪CPB2基因的CDS区及部分非编码区，利用生物信息学工具预测CPB2编码蛋白的基本生物学特征，利用RT-PCR技术检测CPB2基因在肝、心、肾、皮下脂肪、肠系膜脂肪、股二头肌和背最长肌中的表达特征。以实验室制备的代谢性疾病易感猪为试验动物，利用qRT-PCR技术检测CPB2基因在富营养饮食效应下肝中的表达特征。结果表明，本研究成功克隆出猪CPB2基因的3种可变剪接体（CPB2-1、CPB2-2和CPB2-3），其中CPB2-1与NCBI序列XM_001929146.4相同，CPB2-2和CPB2-3为新发现转录本。与CPB2-1相比，CPB2-2和CPB2-3发生了5'端可变剪接（alternative 5'splice site，A5SS）事件；CPB2-1编码423个氨基酸的酸性不稳定性蛋白，CPB2-2和CPB2-3编码同种281个氨基酸的碱性不稳定性蛋白；与CPB2-1相比，CPB2-2和CPB2-3缺少信号肽和激活肽，但具有相同羧肽酶活性结构域；CPB2基因3种转录本仅在肝和肾中表达，其他组织无表达；在富营养饮食诱导的代谢性疾病易感猪的肝中，CPB2-1（P<0.01）和CPB2-2（P<0.01）显著降低，CPB2-3未显著降低（P=0.14）。综上，本研究成功在肝中克隆了猪CPB2的3种可变剪接体，推测CPB2-1是行使纤溶与凝血等生理功能的正常转录本；新发现转录本CPB2-2和CPB2-3被留在肝和肾中可能具有羧肽酶活性和重要生理学功能；CPB2基因可能与代谢相关的慢性肝病存在一定联系。     

山羊RPL27A基因克隆及组织表达特性分析

为研究山羊核糖体蛋白L27A （ribosome protein L27A，RPL27A）基因结构及其相关的生物学功能，试验采集简州大耳羊的14种组织样品（心脏、肝脏、脾脏、背最长肌、皮下脂肪等），利用RT-PCR扩增并克隆获得山羊RPL27A基因序列，通过在线工具进行生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR技术检测RPL27A基因在各个组织及不同分化阶段的皮下前体脂肪细胞中的表达水平。结果显示，山羊RPL27A基因CDS区长447 bp，可编码148个氨基酸。生物信息学分析表明，RPL27A基因在不同的物种间具有较高的保守性，RPL27A蛋白是不稳定的亲水碱性蛋白，其与脂代谢及脂肪沉积相关的RPS18、RPL26、RPL34、RPL32、RPL37A等核糖体蛋白存在相互作用，RPL27A蛋白没有跨膜结构域，且无信号肽，亚细胞定位表明其主要存在于细胞质中。实时荧光定量PCR结果显示，RPL27A基因在山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、背最长肌、皮下脂肪等14种组织中均有广泛表达，且在瘤胃中表达水平最高，在臂三头肌和股二头肌中也存在较高的表达水平，均显著高于其他组织（P<0.05）；RPL27A基因在成脂诱导60 h的山羊皮下脂肪细胞中的表达水平显著高于分化前（P<0.05）。本研究成功克隆了山羊RPL27A基因CDS序列，并揭示了RPL27A基因在山羊14种组织中的表达特性，研究结果可为阐明RPL27A基因对山羊脂肪细胞分化的调控机制提供材料。     

陆川猪PDK4基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析

试验旨在了解陆川猪丙酮酸脱氢激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4,PDK4）基因CDS区序列信息及其所编码蛋白的结构和功能,构建PDK4基因的真核表达载体,分析PDK4基因在陆川猪不同组织中的表达情况,以期为阐明PDK4基因在陆川猪生长发育过程中的分子机制奠定基础。采用RT-PCR技术扩增陆川猪皮下脂肪PDK4基因CDS区,利用生物信息学软件预测分析其结构与功能,并利用常规分子克隆技术将其插入真核表达载体中获得pEGFP-N1-PDK4,用脂质体法将重组质粒转染3T3-L1细胞并观察荧光,用实时荧光定量PCR检测PDK4基因mRNA在陆川猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、皮下脂肪中的表达情况。结果显示,陆川猪PDK4基因CDS区全长1 224 bp,编码407个氨基酸,与NCBI上公布的野猪PDK4基因CDS区同源性达99.8%。对陆川猪PDK4基因所编码的蛋白进行生物信息学分析发现,其分子质量约为46.144 ku,原子总数为6 509个,理论等电点（pI）为7.21,带正电荷和负电荷的氨基酸数均为42个。PDK4蛋白可能有2个N-糖基化位点、33个磷酸化位点。亚细胞定位结果发现,PDK4蛋白有34.8%存在于线粒体,30.4%存在于细胞质,26.1%存在于细胞核,质膜和液泡膜各占4.3%。细胞试验发现,对照组和试验组均发出荧光,相较于对照组,试验组中PDK4表达量极显著升高（P<0.01）,PDK4基因在皮下脂肪中表达丰度最高,随之为肝脏、肺脏、心脏、脾脏和肾脏,在背最长肌中表达量最低,而且在皮下脂肪中的表达量极显著高于背最长肌（P<0.01）。本试验成功扩增出PDK4基因CDS区并构建了真核表达载体,成功对其结构和功能进行预测分析,为研究陆川猪皮下脂肪沉积的遗传改良提供了参考依据。     

干扰Smad3促进山羊脂肪细胞分化

旨在克隆山羊Smad3的基础上，明确其组织和细胞表达谱，最终阐明干扰Smad3基因对山羊肌内和皮下脂肪细胞分化的影响。本研究选用5只体况良好的1周龄简州大耳羊，空腹24 h后屠宰并采集相应组织和细胞进行试验。利用RT-PCR技术克隆山羊Smad3基因cDNA区序列并进行生物信息学分析，利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）技术检测Smad3基因的组织和细胞时序表达水平；并且合成靶向Smad3的siRNA，采用油红O染色从形态学上明确干扰Smad3对山羊前体脂肪细胞成脂分化的影响，利用qPCR检测干扰Smad3对脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、PPARγ、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15以及Smads相关基因Smad2、Smad4、Smad7和TGF-β1基因mRNA表达水平的影响，探讨可能的作用机制。结果，获得山羊Smad3基因1 449 bp，其中CDS区序列为1 278 bp，编码425个氨基酸；Smad3在山羊各组织中具有广泛表达特性，且在肾脏中的表达水平最高（P<0.01）；Smad3均在山羊肌内和皮下两种脂肪细胞诱导分化的36 h表达量最低，极显著低于在未分化前体脂肪细胞中的表达丰度（P<0.01）；干扰Smad3后发现显著促进了山羊肌内和皮下脂肪细胞中脂滴的聚集，且脂肪细胞分化标志基因、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15的表达水平显著上升（P<0.05），Pref-1的相对表达水平极显著下降（P<0.01），同时干扰Smad3基因下调了Smad2、Smad4和Smad7基因的相对表达水平（P<0.05）。研究结果指出，干扰Smad3促进山羊脂肪细胞分化，且可能通过调控脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15等及协同Smad2、Smad4和Smad7的表达来实现的。     

阳原驴MSTN基因生物信息学分析及组织表达研究

【目的】试验旨在分析阳原驴肌生长抑制素(myostatin,MSTN)基因CDS序列特征及其在不同生长发育时期和不同组织中的表达水平。【方法】采集6、12、18、24月龄阳原驴的血样及不同组织样,提取其基因组DNA及不同组织样总RNA。利用PCR技术扩增阳原驴MSTN基因CDS序列,并对其进行生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR技术检测MSTN基因在阳原驴不同生长发育时期背最长肌、腿肌和18月龄不同组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏)中的表达水平。【结果】阳原驴MSTN基因CDS序列长1 128 bp,编码375个氨基酸,与马的核苷酸序列相似性最高(99.9%),编码蛋白属于不稳定的亲水性蛋白,含有转化生长因子-β(TGF-β)超家族结构域,不含跨膜区,存在1个信号肽区域,包含6个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点和34个磷酸化位点,主要分布于细胞核中(39.1%),二级结构中无规则卷曲占比最高(50.93%)。MSTN基因在18月龄阳原驴背最长肌和腿肌中的表达水平显著高于6、12、24月龄(P＜0.05);MSTN基因在18月龄阳原驴不同组织中均有表达,其中背最长肌中的表达水平显著高于其他组织(P＜0.05),其次是腿肌、肺脏、脾脏、肾脏和肝脏,心脏中的表达水平最低。【结论】试验成功扩增出阳原驴MSTN基因CDS序列,MSTN基因在阳原驴不同生长发育时期背最长肌和腿肌中的表达水平均以18月龄最高,且在18月龄不同组织中以背最长肌和腿肌中表达水平较高。研究结果为进一步探讨MSTN基因在阳原驴骨骼肌生长发育中的作用机制提供参考。     

SPF大白猪和长白猪CIITA基因剪接突变体的鉴定分析及在不同组织中的表达模式

为了鉴定分析SPF大白猪和长白猪CIITA剪接突变体，研究其在猪不同组织中的表达模式。本研究以5周龄的8头SPF大白猪和7头SPF长白猪为研究对象，设计特异性引物对CIITA基因进行扩增、克隆和测序，对获得的序列分析其剪接突变体特征，利用在线软件对不同剪接突变体进行生物信息学分析，同时利用荧光定量PCR方法检测CIITA基因剪接突变体在2头SPF长白猪8种组织中的表达模式。结果显示，在SPF大白猪和长白猪CIITA基因CDS区存在3种不同的剪接突变体（CIITA-A、CIITA-B和CIITA-C），其CDS长分别为939、984和1 698 bp。CIITA-A和CIITA-B突变体由于Exon 11部分核苷酸缺失（40和199 bp）使终止密码子提前，从而致使编码CIITA蛋白的结构域受到了剪接的影响，缺失了末端富含亮氨酸的4个重复结构域，蛋白结构发生了明显的改变。进化树结果表明，针对CIITA，猪与绵羊和牛具有较近的亲缘关系，在不同猪品种中具有较高的保守性。同时，CIITA不同剪接突变体在猪8种组织中均有表达，且表达量趋于一致，均在脾或肺中表达量较高，其次是肾、脊髓、甲状腺、肝、胸腺，在心脏中表达最低。本研究从SPF大白猪和长白猪上共获得了3个CIITA剪接突变体，其中两个蛋白结构缺失了4个富含亮氨酸的重复结构域，且不同剪接突变体在猪不同组织中均有表达，表达量稍有差异，为后续CIITA基因在机体内的免疫调控功能研究奠定了理论基础。     

性成熟期辽宁绒山羊与子午岭黑山羊睾丸发育比较

本研究旨在探究性成熟期辽宁绒山羊与子午岭黑山羊睾丸发育是否存在差异,并对两品种繁殖性能进行比较。选取性成熟期健康的辽宁绒山羊和子午岭黑山羊各5只,采集睾丸组织,通过大体解剖和苏木精-伊红（HE）染色石蜡切片,比较两品种山羊睾丸组织发育及形态学差异;ELISA检测雄激素浓度;实时荧光定量PCR （real time quantitative PCR,RT-qPCR）、蛋白免疫印迹（Western blot）检测两品种山羊睾丸组织中死盒多肽4（DEAD box polypeptide 4,DDX4）和类无精症缺失基因（deleted in azoospermia-like gene,DAZL）的表达情况。结果显示,辽宁绒山羊睾丸总重和睾丸长周径极显著高于子午岭黑山羊（P<0.01）,而睾丸短周径、睾丸脏体比和睾丸胴体比均差异不显著（P>0.05）;辽宁绒山羊生精上皮厚度显著高于子午岭黑山羊（P<0.05）,而两者精细管面积、直径和单位面积内精细管数量均无显著差异（P>0.05）;两品种山羊睾丸中雄激素分泌无显著差异（P>0.05）;辽宁绒山羊DDX4 mRNA及蛋白表达量均显著高于子午岭黑山羊（P<0.01或P<0.05）,DAZL mRNA表达量极显著高于子午岭黑山羊（P<0.01）,而蛋白表达量差异不显著（P>0.05）。以上结果表明,性成熟期辽宁绒山羊性腺发育程度与子午岭黑山羊一致,但生精上皮较子午岭黑山羊厚,生殖标记基因表达量存在差异,推测可能会影响两品种的生精能力。     

KLF11抑制山羊肌内前体脂肪细胞分化

旨在获得山羊Krüppel样因子11(Krüppel-like factor 11,KLF11)基因序列,明确其组织及细胞表达模式,阐明KLF11对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响及可能作用途径。本研究利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测KLF11在山羊各组织及成脂诱导分化不同阶段细胞中的表达水平,利用油红O染色和qPCR等方法从形态学及分子生物学等角度确定干扰KLF11后对山羊肌内脂肪细胞分化的影响及可能的作用途径。结果表明,KLF11核苷酸序列总长为1 752 bp,CDS区为1 518 bp,编码505个氨基酸残基。KLF11基因在山羊各个组织中都有广泛表达,并且在肝、背最长肌及腹部脂肪中存在较高水平表达;KLF11在成脂诱导48 h的山羊肌内脂肪细胞中表达水平极显著高于诱导分化前(P<0.01)。筛选到干扰效率可达到63.58%的KLF11-siRNA1有效干扰序列,转染山羊肌内前体脂肪细胞后发现可明显促进山羊肌内脂细胞的脂滴积聚,且脂肪细胞分化标志基因PPARγ和C/EBPβ mRNA水平出现极显著上调(P<0.01),Pref-1 mRNA水平出现极显著下调(P<0.01);干扰KLF11基因后,KLFs有些成员(KLF1、KLF2、KLF4、KLF5、KLF8、KLF10、KLF14、KLF16)表达水平发生极显著下降(P<0.01),有些(KLF15)则出现相反的表达模式。KLF11基因可能通过调控PPARγ、C/EBPβ和Pref-1的表达抑制山羊肌内前体脂肪细胞分化,并且这种作用可能是通过协同KLF2、KLF4、KLF10,拮抗KLF7和KLF15来进行的。     

巴马香猪VRTN基因克隆、表达及其多态性与繁殖性状的关联分析

旨在研究VRTN（vertebrae development homolog）基因在巴马香猪群体中的编码区序列特征、组织表达情况、脊椎数性状因果突变位点ins291的等位基因频率及其与乳头数和产仔数性状的关联。本研究采集3头0日龄巴马香猪组织,利用cDNA克隆技术获得VRTN基因编码区全长序列并进行生物信息学分析,利用荧光定量PCR技术检测VRTN在心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪组织中的表达情况;采集279头经产巴马香猪母猪血液,检测ins291位点在该群体中的频率分布,并与乳头数、产仔数性状进行关联分析。结果表明,巴马香猪VRTN基因编码区全长2 097 bp,其编码的氨基酸序列在不同物种间存在大量保守区域;VRTN基因编码698个氨基酸,预测为亲水性蛋白质,存在1个螺旋转角螺旋域超家族结构功能区、2个低复杂度区域和2个内部重复结构,并与核受体辅抑制子1（NR6A1）、果蝇同源框基因Prospero的脊椎动物同源蛋白2（PROX2）和富亮氨酸重复序列74亚基（LRRC74A）等蛋白具有相互作用;VRTN基因在0日龄巴马香猪各组织中均有表达,其中在背最长肌组织中表达量最高;巴马香猪保种群体中VRTN基因有利突变位点ins291的等位基因频率为21.15%,不同基因型个体之间平均产仔数、总乳头数、左侧乳头数、右侧乳头数和单侧最大乳头数性状均无显著差异（P>0.05）,但纯合突变型（ins/ins）个体的乳头数性状均高于其他基因型个体。结果提示,在巴马香猪产业化生产中可通过分子育种手段提高VRTN ins291有利等位基因频率,但不影响其产仔数性状。     

MSTN基因在1~6月龄哈萨克羔羊肌肉组织中表达量及其与生长指标相关性分析

试验旨在分析MSTN基因在1~6月龄哈萨克羔羊肌肉组织中表达量及其与各项生长指标的相关性,为哈萨克羊的良种选育提供科学依据.随机选取5只哈萨克公羔羊,每月定时在羔羊活体腿部取肌肉组织,软尺测量体长、体高、体重、管围、胸围等各项生长指标.实时荧光定量 PCR分析1~6月龄哈萨克羔羊肌肉组织中MSTN的表达量,相关性分析MSTN基因在羔羊肌肉中的表达量与各项生长指标的关联性.结果显示:哈萨克羔羊各项生长指标在1、2月龄快速增长,体重从4月龄开始增重缓慢,体长、体高、胸围在3月龄出现增长缓慢,管围在3月龄起基本停止增长.MSTN基因在1~4月龄哈萨克羔羊肌肉组织中表达量均无显著性差异(P>0.05),呈现略微上升的趋势,5月龄达到最高峰,6月龄迅速下降.MSTN 基因在肌肉中表达量与体长呈显著负相关 (P<0.05),相关系数为-0.472,与体重、胸围呈弱负相关,与管围、体高呈弱正相关.     

Gene Expression Analysis on Different Muscles and Intramuscular Adipocytes in Cashmere Goat

The objective of this study was to discover the expression of key genes for fatty deposition in Inner Mongolia cashmere goat,so that deeply analysize the change features of intramuscular fat deposition.Real-time PCR was used to detect the expression pattern of seven different genes (PPARγ,FTO,Lipin,LPL,HSL,A-FABP and Perilipin) in ten different muscle tissues,and in intramuscular adipocyte for three periods as early (D3),middle (D7),and end (D11),as well as the changes in key points of induced differentiation time (24,48,72 and 96 h).The correlation between the seven genes and the intramuscular fat content was researched from the prospective of analyzing the tissues and cells.The results showed that FTO gene mRNA had a higher expression in different tissues than that of other genes.While the Lipin gene mRNA expression was the lowest than others,LPL and HSL were the key enzymes in the fat synthesis and splitting,the expression trends of which were basically similar,they only showed the opposite expression pattern in the psoas major muscle,and trapezius A-FABP and Perilipin gene expression patterns were more special,the overall expression level was lower,the former's expression level was higher in next moment chest muscle than other tissues,while the latter's expression level was higher in biceps femoris muscle than other tissues.Analyzing from the cell level,the expression patterns of Lipin,PPARγ,A-FABP and Perilipin were similar,with the increase of adipocytes cultivating day age and the triglyceride accumulation,the corresponding expression level increased gradually;The expression abundance of Lipin gene in each time point was extremely low;The expression level of HSL gene reduced gradually as the differentiation degree increases;The expression level of Perilipin gene was higher only in the late period of induction and differentiation.Through statistical analysis of the correlation,the PPARγ gene mRNA of cashmere goat formed negative correlation with intramuscular fat;While other adipogenic genes like HSL,LPL,FTO,Lipin,Perilipin and A-FABP mRNA formed positive correlation with intramuscular fat content.Therefore,the key gene expression of fat deposition had the specificity,generally,the amount of gene expression by quantitative analysis was FTO> PPARγ> LPL >HSL> A-FABP >Perilipin >Lipin,such results lay foundation for further researching the fat deposition mechanism and improving the quality of cashmere goat.     

关中奶山羊FGF2基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】对关中奶山羊成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）基因进行克隆及生物信息学分析，并检测其在山羊各组织中的表达差异，为后续探究该基因的功能奠定基础。【方法】以关中奶山羊乳腺cDNA为模板，采用RT-PCR技术扩增并克隆关中奶山羊FGF2基因完整CDS区序列，进行相似性比对、系统发育树构建及生物信息学分析；运用实时荧光定量PCR方法检测FGF2基因在关中奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢组织中的表达情况。【结果】关中奶山羊FGF2基因编码区长468 bp，可编码155个氨基酸，分子质量为17.26 ku，理论等电点为9.58，其中含量最高的是甘氨酸，占10.3%。相似性比对结果表明，关中奶山羊FGF2氨基酸序列与人、牛、马、兔、绵羊、虎鲸和野猪的相似性分别为98.7%、99.4%、100.0%、98.7%、99.4%、99.4%和62.6%。系统进化树显示，FGF2基因在不同物种间具有高度保守性，与马的亲缘关系最近。关中奶山羊FGF2蛋白不稳定指数为38.39，属于稳定亲水性蛋白质，不含跨膜结构和信号肽；FGF2蛋白二级结构含有α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲，分别占比10.32%、14.19%、30.97%、44.52%。蛋白质互作预测分析显示，FGF2蛋白与FGFR、KDR、FGF1、FGFR4、MET和FGFR1等与乳腺生长发育相关的蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR检测到关中奶山羊FGF2基因在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢中均有表达，在乳腺中表达水平最高，其次为卵巢，在背最长肌中的表达水平最低。【结论】关中奶山羊FGF2基因CDS区序列长468 bp，编码155个氨基酸，为亲水蛋白，二级结构以延伸链和无规则卷曲为主。FGF2基因在关中奶山羊泌乳高峰期的不同组织中均有表达。本试验结果为进一步探究FGF2基因在关中奶山羊乳腺发育中的作用及其具体功能提供了参考。