猪circ0015292的鉴定及其在卵泡中的表达研究

试验旨在通过高通量测序及生物信息学分析circRNA在猪卵泡发育过程中的作用及其可能的机制,为进一步探索circRNA对猪卵泡发育的调控机理奠定生物学基础。采集梅山和杜洛克猪不同级别的卵泡及各组织样本,提取总RNA,采用RNA-Seq技术对卵泡中差异表达的circRNA进行筛选,同时验证并分析其在梅山猪和杜洛克猪卵泡中的表达情况,并用实时荧光定量PCR进行组织表达谱分析。结果显示:试验证实了circ0015292的存在,且其在肌肉、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、输卵管、子宫、垂体及下丘脑中均有不同程度的表达,在心脏、脾脏、肺脏、卵巢中的表达量相对较高;circ0015292在梅山猪S卵泡中的表达量极显著高于杜洛克猪(P0.01),在杜洛克猪M1、M2、L卵泡中的表达量均显著高于梅山猪(P0.05);其潜在靶基因GADD45G、CCR2、IL20RB、CFL1、LAMB3与猪的卵泡发育相关。综合试验结果,circ0015292在不同组织、不同时期卵泡中均有不同水平的表达;部分靶标基因参与细胞周期及卵巢发育相关信号通路,提示其可能通过对靶基因的调控作用间接参与卵泡发育过程,这为猪繁殖机理的研究提供了新思路。     

猪circ0001651的鉴定及其在卵泡中的表达研究

本实验旨在探究circRNA在猪卵泡发育过程中的作用,通过生物信息学分析预测其可能的调控机制,为进一步探索circRNA对卵泡发育的调控机制奠定基础。采用RNA-Seq技术对卵泡中差异性表达的circRNA进行筛选,用Real-time PCR进行组织表达谱分析,并分析其在梅山猪和杜洛克猪卵泡中的表达情况。结果表明:circ0001651在肌肉、脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、输卵管、子宫、子宫角、垂体、下丘脑中均有不同程度表达,其中在下丘脑、垂体、输卵管、卵巢表达量相对较高;circ0001651在梅山猪M2卵泡(M2卵泡直径:5.1～7.0 mm)中的表达量极显著高于杜洛克猪(P <0.01),在杜洛克猪M1卵泡(M1卵泡直径:3.1～5.0 mm)中的表达量极显著高于梅山猪(P<0.01);其潜在靶基因CCR2、EGFL7、TNFRSF12A、CFL1、EGR1、GADD45G、SLIT2等与猪的卵泡发育相关。生物信息学分析显示,circ0001651部分靶标基因参与细胞周期、细胞增殖凋亡及卵巢发育等相关信号通路,提示其可能通过对靶基因的调控作用间接参与卵泡发育过程。     

猪SKP1基因的克隆及其在梅山猪与杜洛克猪卵泡中的表达研究

为探索SKP1(S-phase kinase association protein 1)基因在猪卵泡中的表达规律,本试验从猪卵泡组织中克隆了猪SKP1基因CDS区全长序列,采用Real-time PCR方法检测SKP1基因在不同组织中的表达谱,进一步分析了该基因在梅山猪和杜洛克猪S卵泡、M1卵泡、M2卵泡、L卵泡中的表达。结果表明,经克隆测序,得到了猪SKP1基因492 bp编码区全长序列,与羊、人、黑猩猩、牛、大鼠的同源性分别为93.10%、92.90%、92.29%、91.89%、89.86%。SKP1基因在各组织中均有不同程度的表达(肌肉、脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、十二指肠、卵巢、输卵管、子宫、子宫角、垂体、黄体、大脑、下丘脑),其中在子宫、脾脏、输卵管中表达量较高。SKP1基因的表达量在梅山猪S卵泡、M1卵泡和M2卵泡中的表达量均高于杜洛克猪,特别是在梅山猪M1卵泡和M2卵泡中SKP1基因的表达量极显著高于杜洛克猪(P<0.01),分别达到了2.39、2.82倍,而在L卵泡中的表达量却是杜洛克猪高于梅山猪,结果提示SKP1基因可能参与猪卵泡发育过程。     

猪lncRNA-ENSSSCT00000018610的克隆及其在猪卵泡中的表达

为了探究lncRNA-ENSSSCT00000018610在猪卵泡发育过程中的作用,本研究采用RACE技术对lncRNA-ENSSSCT00000018610的全长序列进行了扩增克隆,用Real-time PCR进行组织表达谱分析,并分析其在梅山猪和杜洛克猪卵泡中的表达情况以及采用顺式和反式两种方法对lncRNA-ENSSSCT00000018610靶基因进行预测。结果表明,克隆获得了lncRNA-ENSSSCT00000018610全长序列1 731bp;lncRNA-ENSSSCT00000018610在肌肉、心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、卵巢、输卵管、子宫、垂体、黄体、下丘脑中均有不同程度的表达,其中以肾、肺、子宫、卵巢表达量相对较高;lncRNA-ENSSSCT00000018610在杜洛克猪S、L卵泡中的表达量显著高于梅山猪(P0.05),在杜洛克猪M1和M2卵泡中的表达水平极显著高于梅山猪(P0.01)。lncRNA-ENSSSCT00000018610的潜在靶基因TNIP1、CYP2J2、SCARB1、IBSP等与猪产仔性状相关,并且参与猪的卵泡发育。提示其可能通过对靶基因的调控间接参与卵泡发育过程。     

梅山与杜洛克母猪发情前期卵巢组织差异表达基因的分离与鉴定

为了探讨梅山与杜洛克母猪卵巢差异表达基因对猪排卵与繁殖性状的影响,应用mRNA差异显示技术研究梅山猪与杜洛克猪卵巢中基因表达的差异性,分离9条在纯种梅山猪与纯种杜洛克猪卵巢中差异表达的表达序列标签(ESTs),并用半定量RT-PCR鉴定。通过BLAST比对发现,其中有3条EST与GenBank序列同源性较高。组织表达谱分析揭示了这些ESTs在梅山猪心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪、小肠、大脑、卵巢、子宫、脾脏、输卵管等各个组织中的表达有不同程度的差异。研究结果表明,梅山猪和杜洛克猪卵巢之间的不同基因差异表达的方向存在差异,这些差异表达的基因可能在某种程度上导致猪繁殖力的差异,进而为研究影响猪排卵数的分子机理调控网络打下基础。     

TGFβ-SMAD信号通路基因在梅山猪与杜洛克猪不同级别卵泡中的表达分析

为探索TGFβ-SMAD信号通路基因在卵泡中的表达规律,采用Real-time PCR方法检测TGFβ-SMAD信号通路基因THBS1、DCN、LTBP1、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、TGFβRⅠ、TGFβRⅡ、SMAD2、SMAD3、SMAD4基因在梅山、杜洛克S、M1、M2、L卵泡中的表达量变化。结果表明:TGFβ配体1、2、3型及正向调控因子THBS1、LTBP1、负向调控因子DCN、受体TGFβRⅠ、TGFβRⅡ以及受体调控SMAD2、SMAD3和辅SMAD4都在梅山与杜洛克的中等卵泡中存在表达差异,TGFβ1基因、TGFβRⅠ基因在梅山猪各级卵泡中的表达量均极显著高于杜洛克(P0.01)。研究提示,TGFβ-SMAD基因可能参与卵泡发育过程。     

梅山猪与杜洛克猪中等卵泡差异表达基因的鉴定

本试验采用抑制性消减杂交技术构建了卵泡期第4天梅山猪和杜洛克猪中等卵泡M2组织差异表达的消减cDNA文库,从中筛选差异表达的基因,并通过实时荧光定量PCR对其进行验证,利用DAVID软件对差异表达的基因进行聚类分析。结果表明,从梅山猪和杜洛克猪M2卵泡消减文库中筛选得到了148和75个差异表达的ESTs,分别含有125和60个已知的基因。实时荧光定量PCR验证结果与筛选结果相符。GO功能分类注释到调控代谢、细胞循环、生物合成、胞内转运、类固醇雌激素受体和刺激等生物学过程。KEGG Pathway分析表明有6个基因参与TGF-beta信号通路,5个基因参与卵母细胞减数分裂信号通路,7个基因参与类固醇雌激素受体信号通路,推测TGF-beta信号通路中的基因可能调控猪卵泡的发育。研究结果为深入探讨卵泡发育机理和对繁殖性状影响的遗传机理奠定了基础。     

猪卵泡发育过程中差异表达miRNA的鉴定

本研究旨在探讨miRNAs对猪卵泡发育过程的影响。以卵泡期第4天杜洛克猪中等M1卵泡(直径3.0~4.9 mm)与M2卵泡(直径5.0~6.9 mm)为试验材料,通过miRNA芯片杂交检测筛选到在杜洛克母猪中等M1卵泡与M2卵泡之间的差异表达miRNAs,随机抽选若干个检测到的miRNA用Q-PCR的方法对芯片结果进行验证,并预测差异表达miRNA的靶基因,进行GO及KEGG分析。结果表明:芯片检测出347个猪miRNA的表达,筛选得到表达量高且差异大的34个miRNA;随机筛选出6个差异表达的miRNA经Q-PCR验证,与基因芯片结果一致;分析得到的靶基因涉及最多的为Jak-STAT、细胞因子及其受体的相互作用信号通路,且两个信号通路均与卵泡发育相关。结果提示:检测筛选得到的差异表达miRNA可能对猪的卵泡发育过程具有调控作用。     

HSL与FAS基因在苏太猪不同组织器官中的表达研究

为了探究HSL及FAS基因在苏太猪不同组织器官中的相对表达水平,试验运用实时荧光定量PCR法检测HSL及FAS基因在苏太猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、皮下脂肪和背最长肌8个不同组织器官中的相对表达量。结果表明:HSL与FAS基因在苏太猪各组织器官中均有一定的表达。HSL基因在皮下脂肪中的表达水平最高,在背最长肌中的表达水平最低,表达水平顺序依次为皮下脂肪肺脏心脏脾脏肾脏肝脏胃背最长肌。FAS基因在皮下脂肪中的表达水平最高,在背最长肌的表达水平最低,表达水平顺序依次为皮下脂肪脾脏肺脏胃肝脏肾脏心脏背最长肌。     

猪BMP-6基因在不同组织中的表达谱分析

为了研究猪BMP-6基因的组织表达特性,试验采用实时定量PCR技术分析了BMP-6基因在猪脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、小肠、大肠、肌肉、卵巢等11种组织中的相对表达情况。结果表明:BMP-6基因表达谱广泛,其中BMP-6基因在卵巢中的表达量最高,肝脏中的表达量次之,胃和小肠中的表达量最低。说明BMP-6基因可能与繁殖性状相关。     

Cloning of Porcine SKP1 Gene and it's Expression Studies between Meishan and Duroc Pigs with Follicle

To detect the expression pattern of S-phase kinase association protein 1 (SKP1) gene in during porcine follicle development.The coding sequence (CDS) of SKP1 gene was cloned from porcine follicular tissue.To analyze the tissue expression profiling of SKP1 gene and its expression level in follicles with different diameter (S,M1,M2,L) from Duroc and Meishan pigs were investigated by Real-time fluorescence quantitative PCR.The results showed that the length of CDS of porcine SKP1 was 492 bp,and it's similarity with that of Ovis aries,Homo sapiens,Pan troglodytes,Bos taurus and Rattus were 93.10%,92.90%,92.29%,91.89% and 89.86%,respectively.SKP1 mRNA was expressed in all tested tissues (muscle,fat,heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,duodenum,ovarian,tubal,uterine,uterine horn,pituitary,corpus luteum,brain,hypothalamus),and especially high in uterine,spleen and tubal.Both in Meishan pig.The expression of SKP1 mRNA in S,M1 and M2 follicles were higher than Duroc pig.Especially,the expression in Meishan pig M1 and M2 follicles were significantly higher than Duroc pig (P<0.01),respectively 2.39,2.82 times,and the expression of L follicle in Duroc pig was higher than Meishan pig,which suggested that SKP1 gene might be involved in the process of procine's follicular development.     

Identification of Differentially Expressed Genes in Medium-sized Ovarian Follicles between Meishan and Duroc Sows

To reveal the molecular mechanism involved in different number of ovulation between hyperprolific and ordinary sows, forward and reverse subtracted cDNA libraries were constructed to screen differentially expressed genes in medium ovarian follicles at 4th day during follicular phase of estrous cycle between Meishan and Duroc sows. The differentially expressed genes selected were demonstrated by Real-time PCR and cluster analysis was performed through DAVID. The results showed that a total of 148 and 75 non-redundant ESTs were isolated from the SSH library of Meishan and Duroc sows M2 follicles, including 125 and 60 known genes, respectively. The results of Real-time PCR were consistent with the screening results. GO analysis indicated that these genes were involved in regulation of metabolic process, cell cycle, biosynthetic process, intracellular transport, steroid hormone receptor and stimulus. KEGG pathway analysis defined 6 genes involved in TGF-beta signaling pathway, 5 genes in oocyte meiosis pathway, 7 genes in steroid hormone receptor signaling pathway. Genes controlling TGF-beta signaling pathway were considered to play an important role in regulating follicle development. The research would be helpful for further studying the follicular development and the genetic mechanism on reproductive traits.     

猪睾丸组织与雄性生殖相关circRNA鉴定

为研究环状RNA （circRNA）在杜洛克和大白猪睾丸中的表达差异，采用去除组织总RNA中核糖体RNA （rRNA）和线性RNA的方法构建特异性猪睾丸circRNA文库，并在Illumina PE150平台上进行测序，测序数据经过质控、比对、拼接后得到用于后续分析的数据。运用生物信息学软件find_circ和CIRI识别circRNA，并进行表达水平统计，从而得到猪睾丸组织circRNA表达谱，然后用DEseq2进行组间表达差异分析，对差异表达circRNA进行功能富集分析以筛选与雄性生殖相关的circRNA。结果发现，共识别到21 743个circRNAs，其中632个circRNAs在杜洛克和大白猪中的表达差异显著（|log₂（FoldChange）|>1，P<0.05），在杜洛克猪上调表达的circRNAs有281个，下调表达的有351个。差异表达circRNA富集结果显示，有52个GO条目与繁殖相关，其中有9个与雄性生殖相关。经进一步筛选鉴定，有6个与雄性生殖相关的circRNAs （circ_0030058、circ_0009504、circ_00178101、circ_0019933、circ_0033379和circ_0017932），它们可能参与精原细胞分化、精子发生和精子细胞发育等生物学过程。综上所述，杜洛克和大白公猪睾丸中存在表达丰度不同的circRNA，这些circRNA可能参与精子生成，可以作为预测公猪生育能力的生物标记。     

KIT-KIT ligand in the growth of porcine oocytes in primordial follicles

Mammalian ovaries are endowed with a huge number of small oocytes in primordial follicles (primordial oocytes). The mechanism regulating initiation of oocyte growth and follicular development is not well understood. Several growth factors and cytokines are known to be involved in oocyte growth and follicular development. Herein, the involvement of KIT, a receptor tyrosine kinase, and its ligand, KIT ligand (KL), in the initiation of porcine oocyte growth was examined. At first, KIT expression was examined immunohistochemically in primordial oocytes from neonatal (10-20 days) and prepubertal (about 6 months) pigs. Similar expression of KIT was detected in all oocytes from both the neonatal and prepubertal pigs. Next, to examine the growth of primordial oocytes, ovarian tissues containing primordial oocytes were xenotransplanted into immunodeficient SCID mice. Primordial oocytes from the neonatal pigs grew with follicular development as described previously, whereas those from the prepubertal pigs did not initiate growth in the xenografts after 2 months. To stimulate the growth of primordial oocytes from the prepubertal pigs, they were cultured in a medium supplemented with KL (50 and 100 ng/ml) for 1 or 3 days before xenografting. After 2 months, however, the oocytes did not grow, and the primordial follicles did not develop, although a higher number of primordial oocytes survived in the KL-treated tissues. These results suggest that KIT-KL might not be associated with the growth initiation of porcine primordial oocytes, although they do enhance the survival of the oocytes.     

香猪基因组外显子SNPs检测及繁殖和体型性状候选基因分析

为从基因组水平上探究香猪性成熟早、产仔数少、体型小的分子机理,本研究下载与香猪在繁殖和体型性状方面有明显差异的梅山猪、杜洛克猪的重测序数据作为参照,对26头香猪、24头梅山猪和24头杜洛克猪的重测序数据进行SNPs检测和等位基因频率差值分析,筛选香猪基因组外显子上与梅山猪、杜洛克猪高度分化的SNPs位点,并使用AS-PCR方法和Sanger测序方法统计其中8个SNPs位点的群体等位基因频率。最后,对含有高度分化SNPs位点的基因进行GO功能富集和KEGG通路分析。结果显示,SNPs检测获得香猪基因组外显子上SNPs共236 710个,包括193个终止密码子丢失、1 238个终止密码子获得、90 945个错义SNPs和144 334个同义SNPs。得到1 046个香猪高度分化SNPs,包括429个错义SNPs、2个终止子丢失、6个终止子获得和609个同义SNPs,影响524个蛋白质编码基因;并发现X染色体上44-58 Mb的一段富含高度分化SNPs的热点区域。群体等位基因频率验证结果与重测序结果一致,鉴定了8个位点均为香猪与梅山猪、杜洛克猪高度分化的SNPs。对524个含有高度分化SNPs的基因进行GO和KEGG分析,富集到卵母细胞减数分裂、雌激素信号途径等繁殖相关通路;GO功能注释到细胞内雌激素受体信号、纤毛运动等繁殖相关条目,骨骼系统形态发生、骨骼发育、成骨细胞分化等体型相关条目。得到含有香猪高度分化SNPs的18个繁殖性状候选基因PTGFR、TRO、DNAH17、PKDREJ、KAT8、DNAI2、VDR、TEX14、QSOX1、AR、WNK3、ADCY3、SPEF1、MIGA2、SLC2A8、PSMF1、TBC1D20、IFT172和7个体型相关基因IBSP、NR6A1、HSPG2、TARS、PDZD2、FGF4、AMER1,可能是决定香猪性成熟早、产仔数少、体型小的关键基因。