磷胁迫下羊草的响应及磷响应相关基因表达分析

【目的】磷是植物生长发育所必需的大量营养元素,研究无机磷酸盐（inorganic phosphate,Pi）胁迫下羊草的响应,筛选不同浓度Pi胁迫下的内参基因,并分析Pi响应相关基因的表达,为羊草Pi胁迫响应的分子机制研究提供基础数据。【方法】以羊草幼苗为材料,进行不同浓度Pi处理培养,对羊草的株高和根长进行检测,利用钒钼黄比色法检测羊草植株中Pi的含量。根据羊草转录组数据选取7个候选内参基因,从NCBI核酸序列数据库选取1个候选内参基因,对羊草不同处理材料进行总RNA提取和cDNA合成,利用qRT-PCR对候选内参基因的表达进行检测,并通过geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对其稳定性进行评估。根据筛选获得的较稳定内参基因,对Pi响应基因的qRT-PCR检测数据进行相对定量分析。【结果】表型观测结果显示,无论是低Pi还是高Pi胁迫都使得羊草的生长减缓;株高对低Pi或缺Pi胁迫较为敏感,根长对高Pi胁迫较为敏感;并随着处理浓度的增加羊草中Pi的含量也增加。qRT-PCR溶解曲线分析显示8个候选内参基因均具有单一的溶解峰,基因表达谱分析表明8个候选内参基因的CT值范围是17.16—26.61,其中,LcGAPDH的表达丰度最高为17.16—20.22,Lc18SrRNA的表达丰度最低为23.28—26.61,CT值变异系数最小的为LcARPT（2.09%）,最大的为LcTUA（6.8%）。综合geNorm、NormFinder和Bestkeeper稳定性排名,通过计算几何平均数,获得8个候选内参基因综合稳定性排名,其中排名靠前的3个基因分别为Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α,排名最后的2个基因为LcTUA和LcTUB。分别以Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α作为内参基因,qRT-PCR相对定量表达分析结果显示,与对照相比,LcPHO1-2的表达受低Pi或者缺Pi诱导;LcPAP2的表达受高Pi诱导;而LcPAP27的表达同时受低Pi和高Pi下调。【结论】低Pi和高Pi胁迫均使羊草生长受阻,羊草地上组织与地下组织对Pi胁迫响应的模式不同。筛选出3个表达较为稳定的内参基因Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α。LcPHO1-2和LcPAP2分别参与了羊草对低Pi和高Pi的应答响应,LcPAP27同时参与了羊草对低Pi和高Pi的响应进程。     

近零磁场下灰飞虱转录表达分析稳定性内参基因筛选

【背景】 地磁场（geomagnetic field,GMF）并不是稳定不变的,其随时间和空间时刻变化。目前,随着对动物磁生物学研究的日益深入,基于实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术开展的磁响应基因转录表达谱研究有力促进了磁响应通路的鉴定和磁感受机制的揭示。【目的】 筛选近零磁场（near-zero magnetic field,NZMF）下短翅型灰飞虱（Laodelphax striatellus）稳定表达的内参基因,使对目的基因的定量分析更加准确。【方法】 迁飞性昆虫灰飞虱采自江苏省农业科学院试验田并在室内使用TN1三叶期稻苗进行扩繁（温度：（25.0±1.0）℃,相对湿度：70%—90%,光周期：14L﹕10D）。采用亥姆霍兹线圈室内模拟近零磁场（NZMF;＜500 nT）和地磁场（GMF;~50 000 nT）,人工模拟磁场强度有效处理空间为直径30 cm的球形空间,试验过程中严格控制除磁场强度外的环境因子（温度：（25.0±1.0）℃,相对湿度：75%,光周期：14L﹕10D）并利用磁通门计每日对人工模拟磁场进行校准和监测,灰飞虱连同TN1三叶期稻苗均置于试管中进行暴露处理,每隔两日与对照磁场中稻苗对调以避免稻苗潜在磁响应对灰飞虱的影响。利用Trizol法分别提取初羽化灰飞虱雌、雄成虫总RNA,检测各生物学重复RNA质量并调至含量一致,反转录为cDNA,利用qRT-PCR技术并结合常用内参筛选分析软件geNorm、NormFinder、BestKeeper以及在线综合分析系统RefFinder对在NZMF和GMF两种磁场强度下灰飞虱体内的内参基因稳定性进行评估筛选,其中,待评估的11个常用内参基因包括Actin1、Tubulin（α1TUB和α2TUB）、Elongation factor 1 alpha（EF-1α）、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）、Ubiquitin（UBI）、Ribosomal protein S11（RPS11）、Ribosomal protein S15e（RPS15）、Ribosomal protein L8（RPL8）、Ribosomal protein L9（RPL9）和ADP ribosylation factor2（ARF2）。【结果】 不同磁场环境（NZMF vs. GMF）下,灰飞虱短翅雌成虫EF-1α和RPL9表达稳定性在geNorm和NormFinder两种评估方法中都居于前两位,与BestKeeper软件的结果略有差异,进而利用在线工具RefFinder对以上3种方法的评估结果进行稳定性综合排序,结果表明EF-1α稳定性最好,RPL9稳定性次之;灰飞虱短翅雄成虫中,基于geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种评估方法,α2TUB和RPL9表达稳定性中均居于前两位,而Actin1表达稳定性虽在NormFinder和BestKeeper中处于前两位,但其在geNorm中稳定性较低,最后,通过在线工具RefFinder综合分析表明,α2TUB稳定性最好,RPL9稳定性次之。【结论】 明确了不同磁场强度（NZMF vs. GMF）下适用于灰飞虱短翅雌、雄成虫中稳定表达的内参基因,其中,若使用双内参系统,雌成虫中可使用EF-1α和RPL9搭配,雄成虫中可使用α2TUB和RPL9搭配,为稳定表达的内参基因系统。此外,RPL9在灰飞虱短翅型雌、雄成虫中均可作为稳定的单一内参基因使用。研究结果确保了对灰飞虱响应磁场强度变化研究中关键目的基因转录表达的准确定量,并为今后开展磁场强度变化下的转录表达谱分析提供了有力保障。     

新疆马铃薯甲虫对噻虫嗪的抗性监测及其细胞色素P450基因表达分析

【目的】以世界性害虫马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)为研究对象,筛选其参与噻虫嗪解毒的细胞色素P450主效基因。【方法】于2018、2019年利用点滴法监测新疆察布查尔县、伊宁县、塔城市、乌鲁木齐市和吉木萨尔县11个马铃薯甲虫田间种群对噻虫嗪的抗性水平,并测定分析噻虫嗪LD₅₀处理72 h后成虫中3种主要解毒酶细胞色素P450酶(P450)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和酯酶(EST)的活性变化。利用Illumina HiSeq^TM 2500高通量测序技术进行转录组测序,获得抗性和敏感种群之间的差异表达基因(DEG),运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术验证3个P450基因并分析6个P450基因(CYP4C1、CYP9e2、CYP305a1、CYP9Z25、CYP9Ya和CYP9Yc)在不同种群及噻虫嗪处理后的表达情况。【结果】抗性监测发现,2018年的YN1、URMQ1、TC和QPQL1以及2019年的YN2和JMS种群成虫对噻虫嗪抗性倍数(RR)分别达到5.99、8.81、10.86和20.33倍和...     

陆地棉扩展蛋白基因的鉴定与特征分析

目的 扩展蛋白（Expansin）是细胞壁的重要组成部分,在植物的生长发育及逆境胁迫应答等方面均发挥着重要作用。基于全基因组水平系统鉴定陆地棉Expansin基因家族,并通过生物信息学及表达模式分析,为揭示扩展蛋白基因在棉花生长发育中的功能及后续利用奠定基础。方法 利用BLAST和HMMER在陆地棉基因组中搜索并鉴定扩展蛋白基因家族成员;利用ClustalW、MEGA、MCScanX、Prot Param、MEME、SignalP、Euk-mPLoc、FancyGene和DnaSP等软件对其基因序列和蛋白序列进行生物信息学分析。通过RNA-seq数据分析扩展蛋白基因的表达模式和部分同源基因间表达差异,利用qRT-PCR验证部分扩展蛋白基因的表达谱。结果 陆地棉基因组中含有46个EXPA基因、8个EXPB基因、6个EXLA基因和12个EXLB基因,合计72个Expansin基因;四倍体陆地棉中扩展蛋白成员的数量几乎是二倍体棉种（亚洲棉与雷蒙德氏棉）的2倍。除GhA02和GhD06 2个染色体外,其余各染色体上均分布有数目不等的扩展蛋白基因（2—4个）,具有部分同源关系的染色体GhA08和GhD08分别有5个和8个扩展蛋白基因。系统发育树显示,各亚家族成员聚集成群,并且大部分的末端分支均由来源于3个物种的4个（亚）基因组的4个基因组成,如EXPA亚家族的Cotton_A_28454/Gh_A03G0885/Gh_D02G1269/Gorai. 005G142200等等,4个基因之间具有同线性关系。亚细胞定位发现陆地棉所有的扩展蛋白均位于细胞外。基因结构分析显示,扩展蛋白基因由3—5个外显子组成,外显子-内含子结构在进化上高度保守且与氨基酸序列的多样性一致,且在外显子上存在密码子偏好性。RNA-seq数据显示,不同基因在不同时空条件下存在特异性表达,如GhEXPA19A和GhEXPA19D相比其他基因在纤维10 DPA和20 DPA中的表达量很高;在不同的组织（如子叶、新叶、老叶、苞叶）中,GhEXPA24D具有较高的表达量。部分同源基因之间具有不同的表达模式,显示它们之间功能的异化与互补。qRT-PCR结果与RNA-seq数据基本吻合,如GhEXLA3A和GhEXLA3D在纤维发育的伸长阶段高量表达。GhEXPA19D和GhEXLA2D在3DPA的胚珠中表达活跃。结论 陆地棉基因组中含72个扩展蛋白基因,其在DNA水平和氨基酸水平具有一致的结构多样性和进化保守性,在转录水平具有各异的表达模式,显示出家族内成员间功能上的异化与互补。     

黄瓜幼苗下胚轴长度GWAS分析及候选基因挖掘

【目的】挖掘与黄瓜幼苗下胚轴长度显著相关的SNP位点及候选基因,为揭示下胚轴长度的遗传基础和分子机制提供理论依据,为短下胚轴分子标记辅助选择育种奠定基础。【方法】以95份黄瓜核心种质为试验材料,分别于2016年春季、2017年春季、2017年秋季和2018年春季在中国农业科学院南口试验基地塑料大棚进行种植,在两叶一心期调查黄瓜幼苗的下胚轴长度;利用Structure 2.3.4软件分析群体结构,Haploview 软件分析连锁不平衡的衰减;基于最优模型对下胚轴长度进行全基因组关联分析（GWAS）,依据关联SNP位点的LD区间序列,预测与下胚轴长度相关的重要关联候选基因,并利用荧光定量PCR对预测基因进行表达模式分析。【结果】共检测到8个显著关联的位点（Hl1.1、Hl1.2、Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl4.1、Hl5.1、Hl6.1）,分别位于1、2、3、4、5、6号染色体,其中,Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl5.1、Hl6.1等5个位点被重复检测到两次以上。通过分析关联SNP位点的LD区间序列,获得Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa3G141820、Csa4G051570、Csa3G627150、Csa5G174640、Csa6G362970 8个与黄瓜下胚轴长度有关的候选基因,其中既有光形态建成、泛素化、激素信号通路等调控基因,也有调控网络下游参与细胞生长发育,调节细胞大小,直接调控黄瓜下胚轴长度的基因。多基因在不同黄瓜材料中的有机分布,形成了具有不同下胚轴长度的黄瓜种质。基因表达分析显示Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa4G051570、Csa5G174640在短下胚轴材料中高表达。Csa3G141820、Csa3G627150在长下胚轴材料中高表达。【结论】检测到Hl1.1、Hl1.2、Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl4.1、Hl5.1、Hl6.1等8个与黄瓜下胚轴长度密切关联的SNP位点,挖掘到Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa3G141820、Csa4G051570、Csa3G627150、Csa5G174640、Csa6G362970等8个调控下胚轴长度的候选基因。     

荷兰鸢尾‘玉妃’花色变异关键结构基因分析

【目的】花色变异对丰富观赏植物花色具有重要意义,但由于花色变异的不确定性,使其变异机理尚未弄清。荷兰鸢尾是重要球根观赏植物,通过探索荷兰鸢尾蓝紫色野生型‘展翅’及白色突变株‘玉妃’的显色分子机制及色素积累差异,为花色变异机理提供依据。【方法】本研究通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用（UHPLC-QTOF-MS）方法测定荷兰鸢尾2个品种花的花色素苷和黄酮醇的种类及含量。以荷兰鸢尾‘展翅’和‘玉妃’的旗瓣为材料,通过转录组测序,筛选花色素苷合成相关差异基因。以2个品种花发育不同时期为材料,对差异基因进行荧光定量PCR验证。【结果】代谢组分析结果表明,飞燕草素和矢车菊素及其衍生物在蓝紫色花中积累,在白色花中几乎没有积累,而黄酮醇类物质在白色‘玉妃’中含量上升。RNA-seq结果表明,共获得46 485个unigenes,其中27 073个unigenes被公共数据库功能注释,占全部unigenes的58.24%。获得701个差异表达基因,其中485个基因在‘玉妃’中上调表达,216个基因在‘玉妃’中下调表达。花色素苷途径中,2个二氢黄酮醇-4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）基因和1个黄酮醇合成酶（flavonol synthase,FLS）基因有差异表达,分别命名为IhDFR1、IhDFR2和IhFLS1。白色‘玉妃’中,IhDFR1和IhDFR2下调表达,IhFLS1上调表达,导致花色素苷含量显著降低和黄酮醇积累,使代谢流由花色素苷转向黄酮醇。3个基因的qRT-PCR结果显示,IhDFR1和 IhDFR2在蓝紫色花中随着花的发育表达量升高,在白色花中均低表达,IhFLS1在白色花中随着花的发育表达量升高,在蓝紫色花中均低表达,与RNA-seq结果保持一致。【结论】白色‘玉妃’中,IhDFR1和IhDFR2的低表达,及IhFLS1的高表达,使花色素苷积累受阻,部分代谢流由花色素苷转向黄酮醇,导致花色由蓝紫变为白色。     

马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp70的克隆及温度胁迫下的表达特性

【目的】热激蛋白(heat shock protein,HSP)是一种在生物体内广泛存在且高度保守的蛋白质,在生物抗逆过程中发挥重要作用。当生物体遭受不利环境条件胁迫时,其迅速产生可保证生物体的正常生理活动。本研究以重大检疫害虫马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)为研究对象,对其热激蛋白HSP70基因(Ld-hsp70)进行克隆,并对其在温度胁迫下的表达特性进行分析,明确HSP70在马铃薯甲虫温度胁迫中的作用。【方法】基于NCBI数据库检索筛选马铃薯甲虫HSP70的cDNA序列,利用RT-PCR和RACE技术对Ld-hsp70的全长cDNA进行克隆;利用DNAMAN软件对其全长序列进行拼接;采用生物信息学方法对Ld-hsp70及其编码氨基酸的序列特性进行分析;使用MEGAX软件的邻接法(neighbor-joining,NJ)构建马铃薯甲虫HSP70与其他昆虫HSP70的系统进化树;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对Ld-hsp70在不同温度胁迫条件下的表达模式进行分析;利用Primer 5.0软件设计试验所用的特异性引物。【结果】基于NCBI数...     

大丽轮枝菌木糖苷酶基因的鉴定及基于HIGS技术的功能分析

【目的】 从大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）中鉴定木糖苷酶基因,研究其与大丽轮枝菌致病力的关系,为解析大丽轮枝菌致病分子机制提供理论依据,同时为制定更好的棉花黄萎病防治策略提供科学依据。【方法】 利用生物信息学方法从大丽轮枝菌基因组数据库中鉴定全部木糖苷酶基因,并对基因编码蛋白的结构域、基因的染色体定位及进化关系等进行分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测木糖苷酶基因在不同抗/感棉花品种根系分泌物培养0、6、12、24和48 h大丽轮枝菌中的表达量。利用寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术对木糖苷酶基因VdxyL3在大丽轮枝菌侵染过程中的功能进行初步分析。将VdxyL3的目标片段转化棉花,采用伤根法接种大丽轮枝菌Vd991,观察转化植株的表型,调查病情指数,同时利用qRT-PCR技术对植株中真菌生物量和VdxyL3的表达量进行检测。【结果】 利用生物信息学方法从大丽轮枝菌中查找出13个木糖苷酶基因（VdxyL1—VdxyL13）,其编码序列长度介于1 461—2 544 bp,蛋白质分子量介于38.78—90.97 kD,理论等电点介于4.67—5.89。结构域和进化树分析发现13个木糖苷酶基因中包括9个糖苷水解酶43家族成员、1个3家族成员和3个31家族成员。染色体定位分析发现13个基因分布在6条染色体上,未形成基因簇。qRT-PCR结果发现选取的6个基因均受到根系分泌物的诱导,在一种或多种根系分泌物中培养6 h或12 h后,表达量均明显升高,然后降低。其中VdxyL3受海岛棉根系分泌物诱导后表达量明显升高,表明该基因的表达明显受海岛棉根系分泌物的诱导。HIGS研究结果表明,接菌14 d和21 d后转化VdxyL3基因干扰片段的棉花发病明显较重,其病情指数（33.3和83.9）明显高于空载体对照（21.7和66.1）。qRT-PCR分析发现转化VdxyL3基因干扰片段的棉花植株茎中VdxyL3的表达量明显低于空载体对照,真菌生物量显著多于对照。【结论】 利用HIGS技术将VdxyL3基因沉默后,棉株的抗病性明显降低,表明VdxyL3在大丽轮枝菌致病及宿主-病原体互作过程中可能发挥着重要的作用。     

Adβgal-1和Adβgal-2克隆及其在猕猴桃果实软化中的作用

【目的】 β-半乳糖苷酶是一类参与细胞壁降解的糖苷酶,在植物的生长发育和果实成熟软化过程中发挥重要作用。通过对猕猴桃2个β-半乳糖苷酶基因的鉴定及其表达模式研究,明确它们在猕猴桃果实软化中的作用,丰富猕猴桃的后熟软化机理研究。【方法】 以‘米良1号’猕猴桃为试材,采用RT-PCR法扩增果实的β-半乳糖苷酶基因,利用在线数据库分析其编码蛋白的特性、功能结构域、系统进化关系、基因结构和调控miRNA,应用qPCR研究其在不同组织部位、果实的不同软化时期、不同贮藏温度和ABA处理后的表达特征,并结合酶活性变化,阐释这2个β-半乳糖苷酶基因在猕猴桃果实软化中的作用。【结果】 克隆得到2个猕猴桃β-半乳糖苷酶基因（Adβgal-1和Adβgal-2）,登录号分别为MH319788和MH319789。Adβgal-1的开放阅读框为2 280 bp,编码759个氨基酸;Adβgal-2的开放阅读框为2 025 bp,编码674个氨基酸。结构域分析显示,Adβgal-1和Adβgal-2均含有植物糖苷水解酶家族35的功能结构域（Glyco_hydro_35）。基因结构分析表明,Adβgal-1由18个外显子和17个内含子组成,而Adβgal-2由17个外显子和16个内含子组成。进化树分析显示它们位于两个不同的进化分支中,且序列差异较大,可能源自不同的基因祖先。qPCR分析结果表明,Adβgal-1和Adβgal-2在猕猴桃的各组织部位（根、茎、叶、花、幼果、成熟果）均有表达,但表达水平不同;它们均在果实软化初期上调表达,随着果实硬度的下降,表达量持续增加;在25℃贮藏过程中,它们均在3 d时上调表达,随着时间的推移,表达量增加;而在4℃贮藏过程中,Adβgal-1的表达受到抑制,Adβgal-2的表达呈波浪式;ABA处理诱导Adβgal-1和Adβgal-2的表达。酶活性测定结果显示,β-半乳糖苷酶活性在果实软化初期略有降低,随着果实硬度的下降逐渐升高。【结论】 Adβgal-1和Adβgal-2均参与猕猴桃果实的软化进程。不同贮藏温度和ABA处理对猕猴桃果实软化的影响可能是通过改变β-半乳糖苷酶基因的表达而实现的。     

TETs与细胞程序性死亡相关基因在山羊妊娠早期输卵管及子宫角的表达

【目的】TET（ten-eleven translocation）家族蛋白在调控胚胎和胎盘发育等过程中具有重要作用,输卵管与子宫内膜细胞的死亡平衡会影响受精卵及早期胚胎的发育。因此探讨TETs、细胞程序性死亡相关基因和附植相关基因在妊娠早期山羊输卵管及子宫角中的表达规律及其潜在调控作用,以期为研究胚胎发育及附植的分子机制奠定基础。【方法】以合川白山羊为研究对象,采集妊娠19d（P19）山羊子宫角及输卵管组织,以空配19d（C19）为对照,利用H.E染色观察C19组和P19组山羊子宫角组织形态,利用qRT-PCR技术检测了胚胎附植相关基因（WNT5a、OPN、VEGFA）、TETs（TET1、TET2、TET3）、细胞程序性死亡相关基因（凋亡相关基因（BAX、BCL2、Caspase9）、焦亡相关基因（GSDMD、NLRP3、Caspase1）和炎症相关基因（NF-kB、TNF-α））的相对表达,并分析了TETs及细胞程序性死亡相关基因在输卵管和子宫角组织的表达相关性。【结果】H.E染色结果显示,在P19组中山羊子宫角的腺体增多,形态多变。qRT-PCR结果显示,OPN在P19组山羊子宫角中的表达量极显著高于C19组（P＜0.01）,BAX/BCL2的表达量显著增加（P＜0.05）,而WNT5a和 VEGFA表达差异不显著;TET1、TET2、TET3在山羊子宫角及输卵管中均有表达,在C19组和P19组山羊子宫角中TET1及TET2的表达量极显著高于C19组和P19组中TET3的表达（P＜0.01）;在P19组山羊输卵管中TET2（P＜0.01）、NF-kB（P＜0.01）、Caspase1（P＜0.01）、GSDMD（P＜0.05）显著增高。相关性分析表明,输卵管中TET2与TET3（P＜0.01）、NF-kB（P＜0.01）、Caspase9（P＜0.05）显著正相关;子宫角中,TET3与VEGFA（P＜0.05）、WNT5a（P＜0.01）显著负相关,胚胎附植关键基因OPN与Caspase1（P＜0.01）、NLRP3（P＜0.05）、GSDMD（P＜0.05）显著正相关,而细胞焦亡关键基因GSDMD在输卵管与子宫角中均与Bax（P＜0.05）、Caspase1（P＜0.01）、NLRP3（P＜0.05）呈显著正相关。【结论】在妊娠早期山羊子宫角和输卵管中TETs表达与细胞程序性死亡部分基因表达具有一定的相关性,推测TETs与细胞凋亡或焦亡的发生对输卵管、受精卵、早期胚胎及子宫的发育具有一定的调控作用。胚胎附植关键基因OPN与焦亡相关基因显著相关,暗示妊娠早期子宫角中细胞焦亡的发生可能参与胚胎附植。为研究TETs通过细胞程序性死亡相关基因在妊娠早期输卵管及子宫角中的表达规律提供了理论参考。     

大白菜ACA基因家族的全基因组鉴定与表达分析

【目的】通过对大白菜ACA（Ca²⁺-ATPase）基因家族鉴定与表达分析,研究其家族基因间的共性与特性,为进一步揭示ACA家族进化关系提供数据支撑,为深入解析BraACAs在低温胁迫、盐胁迫以及自交不亲和方面的功能研究奠定基础。【方法】根据已报道的拟南芥ACA基因家族,同源比对出大白菜ACA基因家族,利用在线软件Expasy预测其分子量、理论等电点等理化性质;采用MEGA 5.0软件构建系统进化树;运用在线软件GSDS 2.0绘制基因结构图谱;TBtools对其染色体定位;McscanX软件进行拟南芥与大白菜ACA家族基因共线性分析;利用在线软件PlantCARE预测大白菜ACA基因家族启动子元件;通过在线工具Pfam和MEME进行蛋白保守结构域分析;利用qRT-PCR技术检测BraACAs在不同组织、非生物胁迫和自交异交授粉后的表达量。【结果】大白菜ACA基因家族有18个基因成员,分布在大白菜10条染色体上;根据进化树关系分成4组,分别包含3、4、4和7个成员;蛋白结构域分析显示,有13个成员包含N端自抑结构域。qRT-PCR结果表明,BraACAs主要在花与果荚中高表达;低温胁迫下,Bra002762与Bra035649表达量总体上调;盐胁迫下,Bra031701表达量显著上调;自交和异交授粉中,Bra003276和Bra024117差异性表达。对Bra002762、Bra035649、Bra031701、Bra003276和Bra024117亚细胞定位分析,发现这些基因均定位在细胞质膜上。【结论】大白菜ACA家族基因蛋白结构均含有4个ACA基因特有的高度保守结构域。该家族在大白菜不同组织中表达模式不同,5个ACA家族基因成员编码蛋白定位于细胞膜上,其中Bra002762、Bra035649、Bra031701与低温和盐胁迫响应有关;Bra003276和Bra024117与自交不亲和性相关。     

黄瓜CC-NBS-LRR家族基因鉴定及在霜霉病和白粉病胁迫下的表达分析

【目的】对黄瓜全基因组的CC-NBS-LRR（CNL）基因家族进行生物信息学和表达模式分析,为深入研究CNL基因家族在黄瓜生长、发育和病害胁迫响应中的功能提供参考。【方法】以拟南芥CNL为参考序列,利用本地Perl语言和Pfam等软件检索黄瓜‘9930’基因组并确定黄瓜CNL基因家族成员。通过ExPASy、GSDS2.0、MEGA、MEME、Tbtools、Mev等工具对黄瓜CNL家族基因进行生物信息学分析。根据转录组数据库、霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）、白粉病菌（Podosphaera xanthii）接种处理和实时荧光定量PCR技术分析该类基因的表达模式。【结果】从黄瓜全基因组中鉴定得到17个CsCNL,这些基因分布在除1号染色体外的6条染色体上,其编码蛋白与其他植物CNL结构相似,均含有CC、NBS和LRR保守结构域,蛋白质大小介于197—1 148 aa,分子量在22.6—131.3 kD,等电点在5.71—8.38。共线性分析表明其中不存在片段重复和串联重复基因,多物种系统进化关系表明,CsCNL基因家族成员在葫芦科植物之间具有较高的结构和功能相似性。CsCNL启动子中存在多种与抗病相关的顺式作用元件。CsCNL表达具有组织特异性。在接种霜霉病菌2 d和5 d后,Csa3G815400、Csa3G822360和Csa7G420890在抗性品种中均显著上调表达,Csa4G015850在抗性品种中下调表达,在敏感品种中显著性表现不一;在接种白粉病菌2 d和5 d后,Csa2G008000和Csa3G684170在敏感品种中显著上调表达,在抗性品种中显著下调表达;Csa4G016360、Csa7G420890和Csa7G425940在抗性品种中显著上调表达,在敏感品种中表达量无变化或显著下调。【结论】CsCNL家族成员具有组织表达特异性并且多数基因能够响应霜霉病菌和白粉病菌的胁迫。推测Csa3G815400、Csa3G822360和Csa7G420890表达量增加,Csa4G015850表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的霜霉病抗病反应;Csa4G016360、Csa7G420890和Csa7G425940表达量增加,Csa2G008000和Csa3G684170表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的白粉病抗病反应;而Csa7G420890表达量的增加能同时诱发抗病黄瓜品种的霜霉病和白粉病的抗病反应。     

水稻黄绿叶突变体ygl3的鉴定与基因功能分析

【目的】为了丰富和加深人们对植物叶色形成的分子机理认识,对水稻黄绿叶突变体ygl3(yellow green leaf 3)进行表型鉴定和基因克隆,阐明YGL3的分子功能,为解析YGL3调控水稻叶色形成的分子机理奠定基础。【方法】从水稻中花11 CRISPR-Cas9敲除突变体库中鉴定出2份稳定遗传的等位黄绿叶突变体,命名为ygl3-1与ygl3-2,对突变体的表型进行鉴定,测定野生型和突变体苗期的叶绿素含量,运用透射电镜观察野生型和突变体ygl3的叶绿体结构。利用实时荧光定量PCR分析YGL3的组织表达模式,并使用BioXM 2.6软件对YGL3及其同源蛋白序列进行比对,采用酵母双杂交方法筛选YGL3的互作蛋白。【结果】在苗期,与野生型相比,突变体ygl3叶片黄化,叶绿素、类胡萝卜素和总光合色素含量显著降低。透射电镜结果表明,突变体ygl3叶绿体形态异常,类囊体片层结构较少,而野生型叶绿体形态正常,类囊体片层结构排列有序。CRISPR-Cas9敲除位点鉴定结果表明,LOC_Os01g73450发生单碱基插入,导致蛋白翻译提前终止,该基因编码351个氨基酸的蛋白突变...     

紫花苜蓿MsCIPK2的克隆及功能分析

【目的】CIPK是植物响应逆境胁迫信号通路中一类重要的蛋白激酶,可与CBL形成CBL-CIPK复合物,启动细胞内相关应答基因的表达而应对各种非生物胁迫。发掘并研究紫花苜蓿MsCIPK基因响应非生物胁迫的分子机理,有助于揭示紫花苜蓿抗逆生物学基础,为紫花苜蓿抗逆育种提供新的基因资源。【方法】通过PCR技术克隆MsCIPK2,使用生物信息学工具分析基因序列,利用qRT-PCR技术分析MsCIPK2,以及与其互作的4个CBL基因（MsCBL2、MsCBL6、MsCBL7和MsCBL10）在紫花苜蓿各组织中的表达水平,在烟草叶片表皮细胞中,瞬时表达pCAMBIA1302-GFP-MsCIPK2融合表达载体,通过激光共聚焦显微镜观察进行亚细胞定位,利用酵母双杂交技术分析MsCIPK2与4个MsCBLs蛋白互作情况,利用发根农杆菌诱导紫花苜蓿产生过量表达MsCIPK2的毛状根,利用qRT-PCR技术分析转基因毛状根株系中相关基因的表达水平。【结果】通过PCR扩增获得MsCIPK2片段,该基因CDS为1 230 bp,编码409个氨基酸,具有典型的CIPK家族的ATP结合位点、激活环、NAF motif和PPI motif等结构域。MsCIPK2在紫花苜蓿根中表达量最高,在花中表达量最低。亚细胞定位结果显示,MsCIPK2蛋白定位于内质网。酵母双杂交试验结果显示,MsCIPK2蛋白与MsCBL2、MsCBL6、MsCBL7和MsCBL10蛋白具有相互作用,且与MsCBL10蛋白相互作用较强。MsCBL2、MsCBL6和MsCBL10在紫花苜蓿根中表达量最高,MsCBL7在荚中表达量最高。qRT-PCR结果表明,过量表达MsCIPK2的毛状根中响应非生物胁迫基因ATPase、P5CS、CYP705A5、COR47、HAK5和RD2的表达量均明显上调。在200 mmol·L^-1 NaCl和20%PEG处理条件下,与对照相比,过量表达MsCIPK2毛状根的丙二醛含量降低,SOD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量增高。【结论】紫花苜蓿MsCIPK2与MsCBLs蛋白互作,主要在根中表达并响应盐和干旱胁迫,过量表达MsCIPK2可以提高紫花苜蓿的耐盐性和耐旱性,MsCIPK2可作为提高紫花苜蓿抗逆育种的候选基因。     

水稻短宽粒基因SWG1的图位克隆

【目的】水稻产量由单位面积有效穗数、每穗粒数和粒重3个因素构成,其中,粒重主要由水稻的籽粒形态决定。筛选和鉴定新的粒型突变材料和基因,可为产量性状的分子设计育种奠定基础。【方法】在籼稻保持系西大1B(XD1B)的甲基磺酸乙酯（EMS）诱变群体中鉴定到一个短宽粒突变体short and widen grain 1(swg1);分析籽粒形态和其他农艺性状,并对颖壳进行组织细胞学观察分析;运用BSA法进行基因定位;通过遗传互补试验确定候选基因;采用qRT-PCR分析该基因的表达模式及其他粒型相关基因和细胞发育基因的表达水平。【结果】农艺性状分析发现,与野生型相比,swg1突变体粒长显著降低,粒宽显著增加,表现出短宽粒的表型;进一步组织和细胞学分析,发现突变体颖壳纵向细胞变短是粒长变短的主要原因,而粒宽增加是由于颖壳横向细胞数目和细胞大小同时增加。遗传分析结果表明,该突变性状受隐性单基因控制,通过图位克隆与遗传互补验证,确定候选基因为LOC＿Os07g42410,编码一个植物特异转录因子。qRT-PCR分析发现该基因表达无明显的组织特异性,在茎、叶、幼穗中表达强烈。通过对已知粒型相关基因、细胞...     

烟粉虱味觉受体基因BtabGR1和BtabGR2的克隆与表达模式分析

【目的】烟粉虱（Bemisia tabaci）为世界性分布的重要农林入侵害虫,寄主植物种类众多,但对不同寄主植物存在嗜性差异,而味觉受体（gustatory receptor,GR）基因在其取食选择等行为中发挥重要作用。本研究通过克隆烟粉虱味觉受体GR1和GR2基因,明确其在烟粉虱不同发育期和成虫不同组织中的表达特性,为基因功能的深入研究提供依据。【方法】从烟粉虱MED隐种成虫头部转录组中筛选获得味觉受体基因序列,利用巢式PCR技术克隆获得两个味觉受体基因的完整开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,两个基因分别命名为BtabGR1和BtabGR2,运用生物信息学软件对其编码氨基酸序列特征、结构域等信息进行预测,基于邻接法构建BtabGR1、BtabGR2与其他半翅目昆虫味觉受体基因的系统进化树,并利用实时荧光定量PCR方法分析两个基因在烟粉虱不同发育期（卵、1—4龄若虫和雌、雄成虫）和雌、雄成虫不同组织（头、胸、腹、足）中的表达情况。【结果】克隆获得BtabGR1和BtabGR2基因序列（GenBank登录号：OL845904和OL845905）,完整开放阅读框为1 287和1 344 bp,分别编码428和447个氨基酸,预测蛋白分子量为 48.54和51.50 kD,理论等电点为8.85和8.74,具有4个和6个跨膜结构域。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示,BtabGR1 和BtabGR2与其他半翅目昆虫GR28b和GR43a-like基因亲缘关系较近。发育期表达谱分析表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱的不同发育历期均有表达,其中BtabGR1在成虫中表达量高于其他发育期,而BtabGR2在卵中的表达量最高;组织表达谱结果表明,BtabGR1和BtabGR2在烟粉虱雌、雄成虫不同组织中均有表达,且均在成虫头部高表达。【结论】BtabGR1和BtabGR2具有昆虫味觉受体基因的典型特征,二者均在烟粉虱成虫头部高表达,推测两基因在烟粉虱寄主植物适应过程中发挥重要作用,可作为烟粉虱新型防控措施的潜在靶标。     

小麦ZY96-3籽粒灌浆过程中籽粒发育相关基因的表达分析

【目的】 研究小麦ZY96-3籽粒在灌浆过程中与籽粒发育相关基因的表达模式,为了解基因调控籽粒灌浆的分子机制提供参考。【方法】 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,分析小麦ZY96-3籽粒灌浆期间6个与籽粒发育相关基因的表达动态。【结果】 从小麦ZY96-3开花后6个目标基因的表达模式均是先增后降,且都在花后7 d开始表达;与粒重相关基因TaTGW6在花后7 d表达量最高,与籽粒大小相关基因TaCYP78A5、蛋白质合成基因TaPBF-D和淀粉合成酶基因GBSSⅠ、SBE1、AGPase1都在花后15 d左右表达量达到最大;自花后19 d开始,各基因的表达量均显著下降。【结论】 与粒重相关基因TaTGW6主要在小麦ZY96-3籽粒灌浆初期起关键作用,而其余5个基因主要在籽粒灌浆中后期发挥功能。基因在小麦ZY96-3籽粒灌浆期间的表达模式。     

水稻直立短穗突变体esp的转录组研究

【目的】克隆水稻直立短穗基因Erect and Short Panicle（ESP）,分析其参与的基因调控途径,解析ESP控制株型、穗长等农艺性状的分子机理。【方法】以直立短穗突变体esp及其野生型为材料,成熟期进行株高、穗长、粒长等表型测定;构建籼粳杂交F₂定位群体,挑选与突变表型一致的F₂单株,利用与突变性状连锁的分子标记对目的基因进行定位;对野生型和突变体进行基因组测序,结合定位结果,找到突变位点,克隆ESP;利用生物信息学软件进行进化树和基因表达分析;提取野生型和突变体幼穗中的RNA并建库,GO（gene ontology）聚类分析表达差异基因,同时根据KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库,分析野生型和突变体中植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因的表达变化,并通过qRT-PCR验证。【结果】通过表型观察和农艺性状调查,与野生型相比,直立短穗突变体esp株高降低,穗长变短,穗型由弯曲变为直立,每穗粒数减少,粒长变短,粒宽和千粒重增加;有效穗数无显著差异。利用突变体esp与PA64构建籼粳F₂定位群体,将目的基因定位于水稻第7染色体长臂标记C7-11和C7-14之间7.58 Mb区间内,基因组测序发现LOC_Os07g42410第6内含子与第7外显子连接位点由碱基G变异为A,导致第6内含子不能被剪切,蛋白翻译提前终止;该基因与已报道的OsDEP2/OsEP2为等位基因。进化分析显示该基因广泛存在于单子叶和双子叶植物中;表达分析表明ESP在茎秆、花序、雌蕊、内外稃和子房中高度表达,其表达水平随着子房变大而逐渐降低。利用转录组分析突变体和野生型幼穗中的基因表达,结果表明,与野生型相比,esp突变体中表达差异显著（差异>1.5倍）的基因630个,其中235个表达上调,395个表达下调。GO分析显示植物激素信号转导和内质网蛋白加工相关基因受到不同程度地调控,利用qRT-PCR进行验证,结果与转录组数据一致。【结论】直立短穗基因ESP与已报道的直立穗基因OsDEP2/OsEP2为等位基因,其突变导致株高降低、穗长变短等多个表型;ESP可能通过调节植物激素信号转导、内质网蛋白加工过程中的基因表达,进而影响植株的发育。     

柑橘Rboh家族鉴定及其对激素和柑橘溃疡病的响应

【目的】活性氧（reactive oxygen species,ROS）是植物抗病反应中重要的信号分子,而Rboh是参与活性氧产生的关键酶之一。本研究通过鉴定和分析柑橘全基因组中Rboh基因家族生物信息学特性、生物胁迫相关植物激素和溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染诱导下表达模式,为研究Rboh基因家族与柑橘抗溃疡病过程的相关性,进一步研究和利用柑橘Rboh基因打下基础。【方法】利用过氧化物酶数据库RedOxiBase和柑橘（甜橙）CAP数据库获得柑橘Rboh家族序列信息;利用生物信息学软件对CsRboh进行理化性质、系统进化关系、染色体定位、基因结构、蛋白功能结构域、保守基序和启动子元件系统分析。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析植物激素水杨酸（salicylic acid,SA）、茉莉酸（jasmonic acid,JA）、脱落酸（abscisic acid,ABA）和溃疡病菌处理下CsRboh表达模式。【结果】鉴定得到7个柑橘Rboh家族成员（CsRboh01—CsRboh07）,其编码蛋白包含784—946个不等的氨基酸残基,等电点（PI）分布在8.67—9.40,主要定位于细胞膜结构和细胞质。根据系统进化树可将柑橘Rboh家族划分为I—IV 4个亚家族。CsRboh家族基因不均匀分布在甜橙的5条染色体,均含有典型的呼吸爆发NADPH氧化酶结构域（NADPH_Ox）、铁还原酶跨膜组件（Ferric_reduct）、FAD结合结构域（FAD_binding）和铁还原酶NAD结合结构域（NAD_binding）4个功能结构域。CsRboh家族各基因的启动子区域含不同激素响应元件,数目和类型各有差异。qRT-PCR结果显示CsRboh基因家族各成员可响应激素和溃疡病菌诱导,在不同激素和溃疡病菌处理下感病品种晚锦橙和抗病品种四季橘中表达模式具有差异。结合系统进化树聚类分析、同源基因功能研究及其启动子区域顺式作用元件分析发现,CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06在抗、感两个品种中受柑橘溃疡病菌诱导表现出明显不同的表达趋势和表达量。【结论】CsRboh02、CsRboh04和CsRboh06可能与柑橘品种抗、感性密切相关,是3个有潜力的抗溃疡病分子育种候选基因,初步确定CsRboh家族基因在柑橘响应溃疡病过程中发挥关键作用。     

龙眼SPL基因家族全基因组鉴定及表达分析

【目的】鉴定龙眼SPL（DlSPL）基因家族所有成员,并对其成员进行表达分析,为探究SPL在龙眼生长发育中的功能研究提供参考。【方法】采用生物信息学方法对龙眼SPL基因家族成员进行鉴定,并对其基本理化性质、基因结构、系统进化关系、启动子顺式作用元件、FPKM值进行分析;利用qRT-PCR技术检测其在非胚性愈伤组织（nonembryonic callus,NEC）、胚性培养物及不同激素处理下的胚性愈伤组织（embryonic callus,EC）中的表达情况。【结果】DlSPL基因家族共有14个成员,其基因结构和蛋白结构均高度保守且只有一个SBP结构域,DlSPL启动子存在大量的光反应元件、组织特异性调控元件、激素应答元件、胁迫响应元件和植物生长发育有关的顺式调控元件。RNA-seq表达量分析（FPKM值）表明,11个DlSPL成员在不同光质处理的EC中表达,只有DlSPL8在蓝光和白光处理下的EC中呈下调表达趋势;11个DlSPL成员在激素2,4-D和KT中表达,其中DlSPL3和DlSPL13在2,4-D和激动素（kinetin,KT）共同处理下的表达量高于2,4-D和KT分开处理;有13个DlSPL成员在非胚性及胚性培养物中表达,其中7个成员在NEC阶段表达量最高。qRT-PCR结果表明,在不同胚性培养物中,DlSPL1和DlSPL14在EC阶段表达最高,DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13在不完全胚性紧实结构（incomplete embryonic compact structure,ICpEC）阶段表达量最高;DlSPL1、DlSPL5、DlSPL7和DlSPL13成员响应脱落酸（abscisic acid,ABA）信号并显著下调;DlSPL5响应茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）信号且呈上调表达趋势,其他3个成员呈下调表达趋势。【结论】共鉴定出龙眼SPL基因家族成员14个,均含有一个高度保守的SBP结构域;DlSPL可能参与龙眼体胚的形态建成,并响应ABA和MeJA的应答。