猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒株HUB2株全基因组序列分析

从湖北省暴发猪"高热病"的猪场分离出1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),并命名为HUB2株.根据GenBank上已发表的PRRSV全基因序列设计引物进行RTPCR扩增,获得PRRSV HUB2株全基因组cDNA序列.测序结果表明PRRSV HUB2株基因组全长15 320 bp(不包括PolyA尾).分析结果显示该毒株与PRRSV美洲型标准株(VR-2332)和欧洲型标准株(LV)全基因核苷酸同源性分别为89.6%和50.3%.说明HUB2属于美洲型毒株.与VR-2332相比,HUB2株非结构蛋白(Nsp2)存在2处不连续的缺失(共缺失30个氨基酸),其缺失位点位于推定氨基酸序列的第481位和532～560位.此次新出现的强毒株全基因组序列特性的揭示为科学防治猪高致病性蓝耳病奠定了理论基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株FS的分离鉴定与全基因组序列分析

从一例疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病例中分离到一株病毒,经全基因组测序分析可知此毒株在Nsp2部位发生了30个氨基酸的缺失,GP5蛋白相对保守。本毒株与VR-2332同源性达到88.7%,与欧洲型代表株LV株的核苷酸同源性为58.5％,与国内报道的JN-HS毒株相似性最大,核苷酸同源性达到98.8%。     

基于全基因组分析2017—2021年福建省猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组特征

通过对福建地区规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)进行病毒分离及全基因组序列分析,从而了解PRRSV流行情况及基因组特征,为猪场防控PRRS提供理论基础。2017—2021年从福建地区规模化猪场采集疑似感染PRRSV的组织病料和血清,进行病毒分离鉴定,采用RT-PCR方法对PRRSV分离株进行全基因组序列扩增,应用DNAstar 7.0软件进行序列分析,使用MEGA 7.0软件邻近法进行遗传演化分析,并利用生物软件SimPlot 3.51和RDP4.10对PRRSV基因组序列进行重组分析。成功分离得到32株PRRSV-2,其全基因组大小为14 938～15 439 bp(不包括ployA),32株PRRSV之间基因组核苷酸相似性为82.4%～99.4%,与PRRSV-2代表毒株(VR-2332、JXA1、NADC30、QYYZ)和PRRSV-1代表毒株(LV)之间核苷酸相似性分别为81.4%～99%和59.8%～60.6%。分别基于PRRSV全基因组与ORF5基因构建的遗...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GZZJ201711株全基因组序列分析

为了解贵州省毕节地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因变异情况,于2017年从贵州毕节地区某疑似感染PRRSV猪群分离到1株PRRSV,将其命名为GZZJ201711毒株。采用RT-PCR分段扩增出PRRSV GZZJ201711株13个基因片段,分别连接到pMD19-T载体上进行测序,拼接后得到PRRSV GZZJ201711株全基因组长15 322 bp (去除polyA尾),包括5’UTR、ORFla-ORF7、3’UTR。序列分析表明,GZZJ201711株与欧洲型Lelystad virus(LV)株核苷酸同源性为60.3%,与美洲型毒株代表株ATCC VR-2332核苷酸同源性为89.2%,与HP-PRRSV(HUN4、JXA1、TJ)等毒株同源性在98.8%~98.9%之间。GZZJ201711株与高致病性毒株JXA1、HUN4、TJ属于同一小分支,其中与XJu-1、GDHY毒株遗传关系最近。GZZJ201711毒株的NSP2基因有30个氨基酸缺失,与JXA1、HUN4、TJ等HP-PRRSV毒株缺失位置一致。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

为了对从湖南某发病猪场送检的血清中分离到的1株蓝耳病病毒进行鉴定,试验通过接种Marc-145细胞传代后产生明显而稳定的细胞病变,又经过RT-PCR及间接免疫荧光(IFA)检测成功验证;通过对分离株的ORF5基因的测序结果表明,ORF5核苷酸序列与欧洲型代表株LV株及北美经典毒株VR-2332、国内经典美洲株CH-1a的相似性分别为64.5%、87.4%、93.0%,说明其属于美洲型;而将NSP2高变区的测序结果与JXA1等高致病性变异株的Nsp2比较后发现,都在同一位置不连续缺失30个氨基酸。说明成功分离到1株北美型变异株,最终将其命名为PRRSV CZ-HN株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1001株和GX1002株全基因组分子特征分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况及分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增2010年PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株基因片段,经克隆、测序、拼接,获得2个分离株的全基因序列。结果显示,不包括Poly(A)尾,GX1001株、GX1002株基因组全长分别为15329和15318 bp。同源性分析结果表明,2个分离株间全基因组核苷酸序列同源性为99.3%,与国内外北美洲型代表毒株间的全基因组核苷酸序列同源性为84.9%~99.5%,与欧洲型代表毒株间的同源性为61.5%~61.9%。序列分析结果表明,2个分离株的NSP2编码区均存在第481和533-561位,共30个氨基酸的不连续缺失,具有PRRSV高致病性变异毒株(HP-PRRSV)的遗传特征,但分别在不同区域出现新的突变、缺失及插入等变异现象。遗传进化分析结果表明,所有美洲型毒株可分为4个亚群,GX1001株和GX1002株均属于以高致病性JXA1株为代表的第4亚群。上述结果表明,本研究获得的PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株均属于HP-PRRSV,但其基因组在不同区域发生了新的遗传变异现象。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离经典株与变异株的全基因组序列分析

通过分段设计引物,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)LX、JX株基因组进行RT-PCR扩增,对各片段cDNA进行克隆和序列测定,拼接后获得全基因组序列。结果,PRRSV LX株全基因组序列长度为15 412 bp(不包括PolyA尾),PRRSV JX株全基因组序列长度为15 320 bp(不包括PolyA尾)。序列分析表明,JX株全基因组核苷酸序列与LX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、98.6%、91.0%、94.6%、90.9%、61.7%;LX株全基因组核苷酸序列与JX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、89.7%、99.7%、91.5%、99.7%、62.2%。对不同分离株的5′-UTR、Nsp2进行了序列比较,并根据5′-UTR、Nsp2、ORF5的基因序列和氨基酸序列,对国内外分离株进行了系统进化分析。根据5′-UTR核苷酸序列,可将PRRSV美洲型毒株分为4个亚群,LX株和JX株分别属于经典美洲型和"高热病"变异型。根据Nsp2氨基酸序列分析了不同分离株的分子进化关系,表明依据Nsp2序列美洲型分离株可初步划分为5个亚群,JX株独立于其他毒株,独自处于一个分支。依据ORF5序列也可将美洲型分离株划分为5个亚群。本研究为探讨PRRSV的分子进化奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定

采集临床疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料,经处理后进行细胞培养、电镜观察、半数细胞感染量测定、间接免疫荧光试验、动物回归试验以及RT-PCR检测,分离到1株病毒。分离株在Marc-145细胞上连续4代后出现特异性细胞病变;电镜观察到直径50~80 nm的病毒粒子,有囊膜;TC ID50为10-4.7/0.1 mL;与美洲型PRRSV阳性血清进行间接免疫荧光试验可见特征性荧光;RT-PCR检测结果为阳性;回归40日龄血清阴性仔猪可出现PRRSV感染的典型临床症状和病理变化,并且可检测到血清中的特异性抗体。结果表明分离株为PRRSV,命名为PRRSV-SCH07。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1R株全基因组序列测定及遗传变异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征的弱毒(PRRSV)株在基因组水平上的变异和分子遗传特征,本研究对致弱毒株CH-1R株进行了全基因组序列的测定。结果表明,CH-1R株基因组序列全长15424nt,具有典型的动脉炎病毒基因组结构。通过与亲本株CH-1a株序列进行比对,发现其基因组内碱基的缺失和突变主要分布在ORF1a基因的第2191位～2193位、ORF5基因的第439位、ORF6基因的第49位和ORF7基因的第28位和第139位。其中PRRSVCH-1R株的Nsp2蛋白和结构蛋白的变异相对较大,尤其是Nsp2蛋白的变异,同CH-la株相比,CH-1R株的Nsp2蛋白存在多处核苷酸的突变,其中包括连续3个核苷酸发生缺失;由结构蛋白基因推导的氨基酸序列共有17处变异,在各结构蛋白中以GP3和GP5蛋白变异较大,而高度保守的M蛋白和N蛋白,同样发生了变异,由此预测了Nsp2蛋白的R631E、GP5蛋白的L146Q、M蛋白的Q16L和N蛋白的K46N处毒力相关的氨基酸位点,推测其在毒株致弱过程中起到了重要的作用。     

1株重组类NADC34猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定与基因组特征分析

为分离天津地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)并分析其分子遗传进化关系,对来自该地区某猪场疑似PRRSV感染的样品进行RT-PCR检测,阳性样品接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs),将出现细胞病变的PAMs进行有限稀释后进行间接免疫荧光鉴定,利用RT-PCR扩增分离纯化株全基因组序列并进行同源性及遗传进化分析,并对分离株进行重组分析和细胞嗜性试验。结果显示,分离获得1株PRRSV毒株(命名为TJbc2021),分离毒株不能感染Marc-145细胞;该毒株全基因组长为15 111 bp,与NADC34的核苷酸同源性最高,为95.2%,属于目前流行于中国的类NADC34 PRRSV,其Nsp2存在100个氨基酸缺失的分子特征;重组分析显示该毒株以谱系1.5毒株(NADC34-like)为主要亲本,以谱系1.8毒株(NADC30-like)为次要亲本,在14 082～14 635 nt(ORF6～ORF7)发生了基因重组。结果表明,分离并鉴定了1株重组类NADC34 PRRSV,可为该地区...     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的分离与鉴定

试验旨在分离并鉴定从发病猪场分离的一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株。从某疫情猪场病猪体内分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株,经细胞传代培育成功增殖性能稳定的新毒株,命名为PRRSV-CHD。该毒株接种细胞后能够产生细胞病变(CPE),病毒滴度达10^-6 TCID50/0.1 mL,在Vero与BHK-21细胞上不出现细胞病变。采用间接免疫荧光法(IFA)检测病毒抗原分布在细胞浆中。与VR2332、CH-1a、HUN4序列比对及系统进化树分析结果表明,该分离株属于美洲型PRRSV;与PRRSV VR2332、CH-1a等比对,Nsp2基因序列在2780—2782 nt有3个核苷酸小缺失和2933—3019 nt的87个核苷酸大缺失,属PRRSV变异株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离与鉴定

从辽宁某猪场采取病料,经处理后接种Marc-145细胞进行PRRSV分离,结果有2份病料在该细胞上盲传后可见典型的CPE,经测定其毒价为10^-6.5TCID₅₀/mL。间接免疫荧光试验可见黄色荧光,用电镜对纯化的病毒进行观察,可见有囊膜包裹的圆形病毒粒子,直径约为50~70 nm。该病毒对氯仿、紫外线、酸碱度变化和热敏感。对有CPE的细胞培养物进行RT-PCR,结果为阳性。接种试验动物出现典型的PRRS临床症状和死亡。结果表明,成功分离到一株PRRSV。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒安徽株的分离与鉴定

从安徽地区的发病猪场的病料中,分离到3株致Marc-145细胞病变的病毒（命名为AH1、AH2、AH3）,负染电镜观察结果可见直径约50 nm的有囊膜的球形病毒粒子,细胞超薄切片可见病毒粒子分散在细胞浆内,直径为40～80 nm。理化特性研究结果表明,3株分离毒均对氯仿、乙醚、甲醛、温度(56 ℃)敏感;间接免疫荧光试验结果显示,分离株与美洲型PRRS阳性血清反应,发出强特异性荧光;对分离毒株Nsp2基因序列分析发现：安徽分离毒株Nsp2基因存在两处共90个碱基缺失现象,与JXA1 PRRSV变异株亲缘性最近。初步鉴定该分离株为高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒。     

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒的致病性分析

为追踪猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）分离株的变异特点,本研究于2016年从河北和福建疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征（PRRS）发病猪场采集病料,接种Marc-145细胞,产生合胞体样细胞病变,RT-PCR和间接免疫荧光试验鉴定为HP-PRRSV,将其分别命名为PRRSV CZ16A和NP16A。为研究PRRSV分离株CZ16A和NP16A对猪的致病性,将分离毒株经噬斑纯化后分别接种PRRSV抗原、抗体双阴性的60日龄健康仔猪,通过临床观察、解剖病理变化及病毒血症检测等指标初步探讨两株PRRSV的致病性。结果表明,分离株CZ16A和NP16A感染猪后均能够在动物体内复制,并引起体温升高,但两株PRRSV分离株均未引起试验动物的发病和死亡,剖检结果显示NP16A分离株能引起动物肺部实变、淋巴结肿大,其毒力比CZ16A分离株稍强。     

Pathogenic Analysis of Two Strains of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

Samples of sick pigs suspected of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) infection were collected from Hebei and Fujian provinces in China in 2016. Studies were carried out to investigate the variation characteristics of the isolated virus strains.The virus isolates were propagated in Marc-145 cells and caused syncytial cytopathic effect. RT-PCR and indirect fluorescent assay (IFA) results showed that the isolates were HP-PRRSV and hence designated as PRRSV CZ16A and NP16A, respectively. In order to study the pathogenicity of CZ16A and NP16A, the isolated strains were purified by plaque-isolation, and then inoculated to 60-days-old healthy pigs, which were negative in both of PRRSV infection and antibody. Clinical observation, histopathological changes and viremia detection were carried out to evaluate the pathogenicity of these two strains of PRRSV. Results showed that both isolates could replicate in pigs and cause a high body temperature, but these two strains of PRRSV isolates could not cause morbidity or mortality in experimental animals.Autopsy results also showed that NP16A could cause consolidation of the lung, lymph node enlargement in tested animals, suggesting that its virulence was a little stronger than CZ16A.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒缺失变异株的基因组特征

对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)分离株HB2(sh)／2002的全基因组序列进行了测定与分析。该毒株基因组全长为15373nt(不包括PolyA尾)，与国内外美洲型PRRSV分离株全序列相似性介于88．7％～95．1％之间。序列分析表明，该毒株是1个天然存在缺失的变异毒株，其ORFla的Nsp2存在编码12个氨基酸的连续36个核苷酸的缺失，ORF、3存在编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失。这是国内外首次发现PRRSV存在缺失变异现象，研究结果补充和丰富了PRRSV毒株的基因组信息数据，为深入研究该毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

Genome Characterization of a Recombinant Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) mutates continuously, and it is increasingly difficult to control it. To monitor the genetic evolution characteristics of PRRSV timely under the condition of natural infection, a novel PRRSV variant named SHpd1/2018 was isolated from PRRSV positive clinical samples. The results showed that the SHpd1/2018, with a total genome length of 15 018 bp (excluding poly A), showed similar proliferation characteristics to HP-PRRSV strain HuN4. However, it could not be recognized by the monoclonal antibody against HuN4-Nsp2. The sequence analysis indicated that SHpd1/2018 had the greatest homology with HP-PRRSV-like strains, reaching 94.3% with HuN4 strain. The results of recombination analysis showed that SHpd1/2018 was recombined from HP-PRRSV-like strain (main parent strain) and NADC30 strain (secondary parent strain), and both the two recombination breakpoints nt2002 and nt3205 are located in the hypervariable regions of the Nsp2 gene. In short, we confirmed that the isolated strain SHpd1/2018 is a recombinant PRRSV, which may be the main cause of the disease in the pig farm in Shanghai.     

1株重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因组特征

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）不断发生变异,其防控难度也逐渐增加。为了及时监测PRRSV在自然感染背景下的遗传进化特点,本研究从上海某发病猪场的临床样品中分离获得1株PRRSV毒株,命名为SHpd1/2018株,并对其生物学特性和基因组序列进行分析。结果表明,该毒株基因组全长为15 018 bp（不含poly A）,不能被针对HP-PRRSV强毒HuN4株的Nsp2的单抗所识别,但其增殖特性与强毒HuN4株相似。序列分析表明,SHpd1/2018株与HP-PRRSV强毒株的相似性最高（与HuN4相似性为94.3%）。重组分析结果显示,SHpd1/2018株是以HP-PRRSV-like为主要亲本毒株,NADC30-like为次要亲本毒株的重组病毒,两个重组断点nt 2002和nt 3205均位于Nsp2基因的高变区。研究证实SHpd1/2018株是1株发生变异重组的PRRSV分离株,该毒株是上海某猪场保育猪发病的主要原因。     

家蝇体内猪繁殖与呼吸综合征病毒的初步分离与鉴定

为调查养猪场环境中家蝇携带猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)情况,2010年采集贵州某猪场家蝇样本,采用RT-PCR方法筛选阳性样本,接种Marc-145细胞分离培养病毒,对分离获得的家蝇样本的PRRSV Nsp2基因进行克隆和序列分析。针对PRRSV N基因家蝇样本扩增出377 bp的特异性片段,阳性家蝇样本接种的Marc-145细胞出现明显CPE现象,针对PRRSV Nsp2基因细胞培养物扩增出1064 bp的特异性片段,测序结果显示,家蝇样本的细胞培养物的PRRSV Nsp2基因片段与贵州猪场猪源PRRSV流行株相比具有较高的核苷酸同源性,高达97.1%~98.5%。从而初步推断家蝇也可能成为PRRSV携带者。