猪DDX1基因的克隆、序列分析及表达

根据已知人、小鼠、牛、鸡、犬和恒河猴等物种的DEAD-box解旋酶1(DEAD-box helicase 1,DDX1)基因mRNA序列设计引物,从猪肾传代细胞系(PK-15)中克隆DDX1基因编码区(CDs)序列,对该基因进行生物信息学分析、组织表达谱分析。进一步将猪DDX1基因CDs序列克隆至真核表达载体pCMV-Tag2B,构建的重组真核表达质粒转染PK-15细胞后运用Western blot和间接免疫荧光试验检测DDX1基因的真核表达。结果显示:成功克隆了猪DDX1基因的cDNA序列(GenBank登录号为KU522467),其开放读码框全长为2 223bp,编码740个氨基酸;与牛、鸡、黑猩猩、犬、人、小鼠、大鼠和恒河猴的氨基酸序列同源性分别为98.8%、93.5%、97.6%、98.8%、97.7%、97.0%、97.6%和97.8%。表达谱分析表明,猪DDX1mRNA在不同组织中的表达水平存在差异,表现为脂肪、肝脏和脾脏中高表达,而在胃、心脏和肌肉中表达较低。成功构建了猪DDX1基因真核表达质粒,经证实目的基因可以在真核细胞中特异性表达,且表达的DDX1蛋白主要定位于细胞质中,少量定位于细胞核中。结果表明:本试验克隆了猪DDX1基因的序列,分析了其在不同组织的表达规律,并构建了DDX1基因重组表达质粒,为该基因下一步的功能学研究奠定了基础。     

产肠毒素性大肠杆菌K99菌毛蛋白抗原基因的克隆与表达

应用PCR从产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）中扩增出不含信号肽序列的K99菌毛蛋白基因片段，克隆测序后，将该片段连接到E.coli表达载体pET28a( )中，转化E.coli表达菌株BL21（DE3），筛选得到可诱导表达K99抗原的工程菌株。经IPTG诱导，分离纯化K99重组蛋白，以其免疫新西兰大白兔，获得重组蛋白的兔抗血清；免疫印迹分析表明，此重组蛋白制备的抗血清能与标准的K99强毒株姓明显的抗原抗体反应。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT—PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因，将其插入pMDl8-T载体进行序列分析，结果表明，所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物，以重组pMD-T—VP1阳性质粒为模板，扩增获得了VP1基因，通过酶切将其克隆至表达载体pQE—Trisystem上。经测序证实，重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE—VP1转化至大肠埃希氏菌M15，通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达，SDS—PAGE和Western—blot分析表明，表达产物大小与预期的结果（26ku）一致，且具有良好的反应原性。以2mmol／LIPTG诱导表达5h时表达量最高，其中70％～80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中，表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。     

甘菊CBL基因的克隆与表达分析

基于已建立的甘菊ESTs文库,检索到了CBL基因4个不同的EST序列;采用RACE技术获得了它们的全长序列,并命名为ClCBL1-4。将甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)ClCBL与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的CBL进行多重序列比对发现,它们都含有4个结合钙离子的EF-hand结构域,且ClCBL1在N端有一个豆蔻酰化序列(MGCXXSK/T)。采用RT-PCR技术,分析了甘菊中CBL基因的表达与不同逆境胁迫的关系,表明甘菊CBL基因的表达在冷、干旱、热、盐及ABA胁迫中可被不同程度地诱导,而在非逆境胁迫条件下,甘菊CBL基因在根、茎、叶及花等不同器官中均有表达,且表达量相对一致。这些结果说明该家族基因参与了植物非生物逆境胁迫的抵御。     

K88-ST融合基因的克隆及真核表达载体的构建

利用DNA重组技术,将编码K88-ST融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pCAMBIA1302中,成功的构建了植物重组表达质粒pCAMBIA-K88-ST。并将其转化农杆菌EHA105,为K88-ST基因的进一步研究奠定基础。     

紫花苜蓿MsSOS1基因的克隆与表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因SOS1（salt overly sensitive 1）是植物在抵御盐胁迫过程中一个重要的必需基因之一。本研究在紫花苜蓿（Medicago sativa）叶片中克隆得到一个MsSOS1基因,编码859个氨基酸,具有一个CAP-ED superfamily结构域、一个Crp superfamily结构域和一个Na⁺/H⁺ Exchanger superfamily结构域。与鹰嘴豆、大豆、羽扇豆、花生和葡萄的一致性分别是91%,87%,85%,84%和77%。实时荧光定量PCR分析表明,MsSOS1基因在根、茎、叶和花中均有表达,其中在根中的表达量最高,花中最低。此外,MsSOS1基因在4℃、PEG和ABA的胁迫中的表达均受到调控,推测该基因的表达与紫花苜蓿的抗逆性有关。     

鸡HMIT基因的克隆与表达分析

旨在克隆鸡H+/肌醇转运蛋白（H+/myoinositol transporter,HMIT）基因的转录序列,并检测HMIT基因在鸡不同组织中的表达情况,以及外源胰岛素处理对HMIT基因相对表达量的影响。本研究以AA肉鸡为试验动物,采用RT-PCR技术克隆鸡HMIT基因全编码区序列,采用生物信息学技术分析其编码蛋白的生物学特性,利用荧光定量PCR检测HMIT基因在大脑、肝、腹脂、腿肌、心、肾、空肠和回肠等组织中的表达情况,并检测其在肾和大脑中进行胰岛素处理120和240 min后的表达情况。结果表明,以NCBI预测的鸡HMIT（XM_001232939.5）序列为模板设计引物,成功克隆出鸡HMIT基因（1 694 bp,GenBank登录号：MN708211）。克隆的鸡HMIT编码区全长1 380 bp,相比XM_001232939.5预测的编码序列少561 bp,预测编码含有459个氨基酸组成的蛋白。核苷酸和氨基酸序列比对发现,鸡HMIT在物种间高度同源,共线性分析显示,HMIT所在的1号染色体区域在物种间也是高度保守的。HMIT编码的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质,其二级结构和三级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。跨膜结构分析显示,鸡HMIT存在8个明显的跨膜结构域。亚细胞定位结果表明,鸡HMIT蛋白分布于质膜（52.3%）、内质网（21.7%）、液泡（17.4%）、线粒体（4.3%）和高尔基体（4.3%）。实时荧光定量PCR检测结果显示,HMIT基因在鸡大脑和肾表达量最高,且显著高于其他组织（P<0.05）。胰岛素处理240 min后,HMIT在肾和大脑中的表达量都显著低于PBS对照组（P<0.05）。本研究克隆获得了鸡HMIT的全编码区,生物信息学分析及组织表达特性研究为深入探索鸡HMIT基因的生理功能和调控机制奠定基础。     

草地早熟禾NRT1/PTR FAMILY 8.3基因的克隆及表达分析

植物硝酸盐转运蛋白(Nitrate transporter,NRT)可有效转运NO3-,提升氮素利用效率.为了解析草地早熟禾(Poa pratensis)适应不同浓度及不同形态氮素、干旱胁迫机理,本研究以草地早熟禾为试材,对NRT1/PTR FAMILY 8.3基因进行克隆、生物信息学分析,并分析了不同浓度及不同形态氮...     

大围山微型鸡POU1F1基因编码区的克隆及序列分析

大围山微型鸡是我国目前报道的体形最小、体重最轻的地方优良品种,具有较高的屠宰率和饲料报酬。研究通过设计特定引物对大围山微型鸡POU1F1基因的编码区进行PCR分段扩增并测序。利用分子生物学软件对其基因序列及编码产物的结构、功能进行了生物信息学分析,并构建其系统发育关系。结果表明,大围山微型鸡POU1F1基因编码区全长984bp,与原鸡的POU1F1基因（NM〈sub〉2〈/sub〉04319）比对,在836位处发生一次碱基转换（C/T）,但未造成氨基酸改变;其编码产物由327个氨基酸残基组成,分子质量为38801.19Da,理论等电点为8.67;系统发育树结果表明,不同物种间在该基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列上有较高的相似性,大围山微型鸡与原鸡POU1F1基因编码区核苷酸序列和氨基酸的相似性分别达到了99%和100%。大围山微型鸡POU1F1基因编码区的成功克隆,为进一步研究POU1F1基因的遗传特性和大围山微型鸡的矮小机理奠定了基础。     

3种家蚕30K蛋白基因的克隆表达及抗凋亡功能分析

业已明确家蚕30K蛋白不仅作为家蚕生长发育的重要能源物质,还对细胞凋亡具有明显的抑制作用。采用RT-PCR技术从家蚕5龄幼虫脂肪体中克隆了BmLp-C6、BmLip19G1和BmLp-C12p(GenBank登录号分别为X54735、AY568957、NM_001101728)共3种30K蛋白基因的cDNA序列,并利用Bac-to-Bac系统构建含有3种30K蛋白基因的重组杆状病毒表达载体,转染家蚕BmN培养细胞大量表达3种30K蛋白,3种表达产物纯化后的样品经SDS-PAGE检测到明显的30 kD大小的目的蛋白条带,Western blotting分析3种纯化后的蛋白样品与6×His-tag抗体具有良好的特异性反应。纯化后检测3种表达产物对诱导凋亡的抑制作用。经MTT法检测3种纯化30 K蛋白可明显增强过氧化处理的人血管内皮原代培养细胞(EC)的活力,采用ELISA法检测3种纯化30K蛋白能明显减缓EC细胞中的DNA片段化,显示3种30K蛋白对H2O2诱导的EC细胞的凋亡均具有一定的抑制作用。用生物信息学方法预测3种家蚕30K蛋白的氨基酸序列相似性达43%,三级结构极其相似,推测3种蛋白具有相似的生物学功能。     

K+对盐胁迫下罗布麻生长及离子吸收分配的效应

通过温室盆栽试验,研究了低钾(0.01 mmolL-1)和正常钾(2.5 mmolL-1)水平对NaCl胁迫下罗布麻(Apocynum venetum)生长和离子吸收分配的影响。结果表明,随着介质中NaCl浓度的增加,罗布麻的根、茎、叶的生物量和株高呈下降趋势;但相同浓度NaCl处理下,低钾和正常钾之间无显著差异(P0.05)。罗布麻各器官中Na+含量随介质NaCl浓度的增加显著上升(P0.05),叶中上升幅度明显大于根和茎;叶和茎中K+随介质NaCl浓度的增加显著下降,但仍维持较高水平,根中K+浓度能保持稳定;低钾和正常钾水平下,与无盐胁迫(对照)相比,50 mmolL-1 NaCl处理植株叶中K+浓度无显著变化。在对照条件下,罗布麻体内积累大量K+,其叶中K+浓度是Na+的15倍多。可见,增强K+的选择性吸收和运输,保持叶部较高的K+含量和K+/Na+比是罗布麻适应盐逆境的重要生理机制。     

野生罗布麻特性及利用价值

野生罗布麻Apocynum venetum是生长在北方盐碱、荒漠等地的特有物种,不但可以防风固沙,还是很好的纺织、制药、制茶原料。青海省野生罗布麻资源丰富,主要生长在柴达木盆地的盐碱地、沙漠边缘及河流两岸,分布面积9.93万hm2,年产麻皮量约3.72万kg,也是该地区维持生态平衡的主要灌木树种,如果加以开发利用,不仅能改良土壤、改善当地气候环境条件,还可以增加农民收入,促进全省经济发展。     

施锂对罗布麻生长及叶绿素荧光参数的影响

罗布麻对锂具有一定的富集作用,锂对于罗布麻生长可能有益。本文采用沙培试验方法,研究了根施及叶面喷施方式下不同锂浓度处理对一年生罗布麻生长、叶绿素含量及其荧光特性的影响。结果表明,无论叶面喷施或根施,不同锂浓度处理对一年生罗布麻生长状况均表现出较为明显的影响,在一定浓度范围(010 mg/kg)内,随着锂浓度的增加,叶绿素荧光参数(包括F_v/F_m、F_v/F_o、Ψ_o、φ_Eo、PI_ABS、叶绿素含量、叶绿素a/叶绿素b值、S_m)、罗布麻生长量、株高、茎粗及主叶对数和侧枝数等均有所增加,说明适宜的锂供应有利于罗布麻的生长。但随着供应浓度的进一步提高,各项生长及荧光指标呈降低趋势,因此过量的锂供应会抑制罗布麻生长,而且有益与有害之间的范围很小,在实际罗布麻栽培中要严格控制锂施用量。     

干热胁迫对罗布麻幼苗生理特性的影响

为研究罗布麻(Apocynum venetum)抗干热胁迫能力,在不同温度(25℃,30℃,35℃)下,用不同水势(0,-0.3,-0.6,-0.9,-1.2,-1.5 MPa)的PEG溶液对罗布麻幼苗进行模拟干热胁迫试验,测定其生理生化指标变化。结果表明,总体上,随干热胁迫程度的增加,植物体内相对电导率逐渐上升,可溶性糖含量先上升后下降,丙二醛含量先下降后上升,而超氧化物歧化酶活性则随水分胁迫逐渐增加,随温度的升高而逐步下降。综合各指标,罗布麻在30℃,-0.9~-1.2 MPa的干热胁迫下表现出极强的抗干热能力。     

罗布麻种子老化过程中的生理生化特性

罗布麻（Apocynum venetum）集中成片分布于盐碱、沙荒地区,耐寒耐旱,耐盐碱耐风沙。自然严酷条件下,罗布麻种子活力变化对其种群的环境适应性具有重要影响,因此采用人工老化的方法,研究其在逆境条件下的生理变化,可探明罗布麻种子活力的劣变规律、种群的扩繁机制以及罗布麻种子的贮藏特性和寿命。在相对湿度100%、温度分别为35 ℃和50 ℃的条件下,对罗布麻种子处理84 h,测定其生理生化指标。结果表明,在相同温度下,随着老化时间延长,种子电导率在初期先下降后升高,脱氢酶、过氧化物酶逐渐降低,浸出液可溶性糖逐渐升高。老化温度越高,对种子造成的影响越大。罗布麻种子对高温逆境在生理上有响应,种子抗热性较强。     

鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达

本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因核苷酸序列，设计了1对用以扩增GPV主要非结构蛋白NS1基因的引物。通过PCR技术，扩增出NS1完整基因片段1．9kb。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：GPV H1株NS1基因全长1884bp，编码627个氨基酸，与国外已发表的B株核苷酸序列同源性为98．15％。同时将该目的基因正向插入到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6P-1的BamH1多克隆位点，构建了GPV NS1的原核表达载体，成功的表达了约97KD的NS1融合蛋白。     

禽脑脊髓炎病毒VP1基因的克隆及表达

应用RT-PCR方法,扩增出AEV Van-roekel株结构蛋白基因VP1,测序结果表明VP1基因全长810bp,编码270个氨基酸;和AEV 1143株相比,核苷酸同源性为94.2%,氨基酸同源性为99.26%.将VP1基因定向克隆到pGEX-6p-1载体谷胱苷肽转移酶基因的下游,并把重组质粒转入宿主菌BL21中,经IPTG诱导后,VP1基因得以表达.表达产物经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,确定表达的融合蛋白大小约为58Ku,且具有良好的反应原性.将表达产物纯化后免疫试验兔,琼脂扩散试验显示免疫血清能与禽脑脊髓炎琼脂扩散标准阳性抗原呈特异反应,表明重组VP1蛋白保留了天然蛋白的部分活性.     

盐生植物小花碱茅K+通道PtAKT1基因片段的克隆及序列分析

为研究小花碱茅(Puainellia tenuiflora)K⁺/Na⁺选择吸收分子机制,根据已报道的其他植物AKT1基因的保守序列设计一对简并性引物,以小花碱茅根部总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出AKT1基因,以期为小花碱茅AKT1全长基因的克隆、表达调控及其作物改良的研究奠定基础。序列分析结果表明:该基因长度大约为1019 bp,编码339个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的高等植物AKT1基因序列的同源性均在85%以上,与其他AKT1的氨基酸序列同源性达73%以上。     

盐胁迫对罗布麻和大花白麻种子萌发的影响

以罗布麻(Apocynum venetum)和大花白麻(Poacynum hendersonii)为研究对象,在不同浓度(0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%、2.1%)NaCl处理下,研究盐胁迫对种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明,1)随着NaCl浓度的增加,罗布麻和大花白麻种子发芽率、发芽势、发芽指数呈明显降低趋势,平均发芽天数延长,各指标在1.5%～2.1%NaCl浓度处理下受抑制程度更加明显。低浓度时两物种发芽率和发芽势差异均不显著(P> 0.05),高浓度时罗布麻受抑制程度显著高于大花白麻(P <0.05)。2) NaCl浓度为0.9%时,大花白麻胚芽长显著高于罗布麻(P <0.05),其他浓度时二者差异不显著(P> 0.05)。NaCl浓度为0.3%、0.6%、0.9%和2.1%时大花白麻的胚根长显著高于罗布麻,其他浓度时二者差异不显著。随NaCl浓度增加,两物种胚根长与胚芽长呈降低趋势,且在1.5%～2.1%NaCl浓度处理时受抑制程度更加明显。3)罗布麻种子相对盐害率大于大花白麻,但二者差异不显著(P>0.05)。...